小麥amlo-1ac基因表達(dá)的初步研究

小麥amlo-1ac基因表達(dá)的初步研究

meo是通過圖位突變法獲得的大麥抗凝劑。隨后Devoto等在水稻、擬南芥及其它一些植物中相繼克隆了Mlo類似基因。Elliott等報(bào)告了小麥Mlo類似基因,并證明該基因與小麥抗白粉病有關(guān)。目前,小麥Mlo基因家族中已有6個(gè)全長(zhǎng)基因和2個(gè)近全長(zhǎng)基因在GenBank中登錄,包括我們克隆的3個(gè)小麥Mlo基因(TaMlo-A1c,TaMlo-B1c,TaMlo-B1d)。TaMlo-A1c基因是小麥Mlo家族中的重要成員,Yu等證明了TaMlo-A1c是膜結(jié)合蛋白,屬于具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的植物特有的Mlo家族。Southern雜交表明TaMlo-A1c基因在小麥每個(gè)基因組中有1個(gè)拷貝。利用中國春缺失系將該基因定位在2AL、2BL和2DL的特定區(qū)段上。Northern雜交研究了該基因在白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)間小麥葉片中的表達(dá),但它在小麥其它器官中的表達(dá)還未見報(bào)道。Northern雜交是研究基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的常規(guī)方法,一般以穩(wěn)定表達(dá)的18srRNA作為對(duì)照。Actin是植物中的一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的“管家基因”,在研究大麥和大豆基因轉(zhuǎn)錄水平中,尤其在RT-PCR中常用它作為對(duì)照。半定量RT-PCR方法以特異性高、操作簡(jiǎn)便和可靠性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),在研究基因表達(dá)方面有逐漸取代Northern雜交的趨勢(shì)。為了更深入研究小麥TaMlo-A1c基因的抗白粉病機(jī)制。本研究利用半定量RT-PCR方法,以小麥Actin基因作為對(duì)照,對(duì)小麥TaMlo-A1c基因在各個(gè)不同器官中的表達(dá)進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1不同光照、時(shí)間對(duì)小麥根系誘導(dǎo)的菌株試驗(yàn)材料為小麥抗白粉病品系“99-2439”,將其種子播于培養(yǎng)皿中,用透明投影膠片與外界隔離以防止白粉菌孢子落入,在人工氣候箱中按光照12h、黑暗12h光周期,18～20℃下培養(yǎng)。在幼苗長(zhǎng)至一葉一心時(shí),接種白粉菌,在接種后不同時(shí)間(1、4、12、24、48和72h)分別取小麥的幼葉、根、誘導(dǎo)的根;小麥的壯葉、旗葉、幼穗、幼莖取自溫室培養(yǎng)(15～25℃)的未人工接種白粉菌的“99-2439”材料。1.2關(guān)于總rna的檢測(cè)用TRIzol○R(Invitrogen,USA)試劑分別提取小麥幼葉、壯葉、旗葉、穗、莖、根等的總RNA。(1)定量:測(cè)260、280nm處的吸光值,計(jì)算A260/A280的值,估計(jì)總RNA的純度,通過A260的值分別對(duì)不同器官的總RNA進(jìn)行定量。(2)RNA完整性的檢測(cè):在1%普通瓊脂糖凝膠上分離總RNA,若有4條(代表rRNA等)清晰無拖尾的帶,則說明總RNA完整。1.3合成第一鏈生物網(wǎng)絡(luò)roche,ge建立取等量不同器官的總RNA,用試劑盒“1stStrandcDNASynthesisKitforRT-PCR”(Roche,Germany)合成第一鏈cDNA。1.4semi-qt-pcr1.4.1pcr擴(kuò)增條件根據(jù)小麥Actin基因(GenBank查詢號(hào):gi:48927617)序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物:WAC-F:5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′;WAC-R:5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′。PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系,分別加入等量不同器官的cDNA(3μL)模板,1倍的PCR緩沖液(10mmol/L的Tris-HCl,pH8.5～9.0,50mmol/L的KCl,0.1%的Triton-100),200μmol/L的dNTP,1.5mmol/L的MgCl2,0.4μmol/L的Actin基因特異引物,1UTaqDNA聚合酶。反應(yīng)在Perkin-Elmer9600熱循環(huán)儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,18個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。小麥Actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為422bp。取等體積的PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,紫外燈觀察照相。1.4.2特異性引物pcr擴(kuò)增根據(jù)已克隆的小麥TaMlo-A1c基因(GenBank登錄號(hào):AF384144)序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,F1:5′-GATTCATCTCGCTGCTGC-3′;R1:5′-TGGCTGTCTGCTCGTCAAAG-3′。PCR擴(kuò)增條件同1.4.1,其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1050bp。取等體積的PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,紫外燈觀察照相。2結(jié)果與分析2.1小麥actin、tamlo-a1c基因的表達(dá)TaMlo-A1c基因是通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù),從小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系中克隆的,TaMlo-A1c基因的Northern雜交結(jié)果表明,TaMlo-A1c基因在未誘導(dǎo)的小麥易位系葉片中有一定量的本底表達(dá),小麥白粉菌誘導(dǎo)12h之后,表達(dá)水平有所提高,誘導(dǎo)24h后保持這一表達(dá)水平,誘導(dǎo)48h后表達(dá)水平下降,誘導(dǎo)72h后表達(dá)水平進(jìn)一步下降(圖1)。用半定量RT-PCR方法對(duì)小麥TaMlo-A1c基因進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果表明(圖2),小麥Actin基因和TaMlo-A1c基因分別得到與預(yù)期片段大小一致的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。Actin基因在白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)間的葉片中擴(kuò)增條帶亮度基本相同。以此為對(duì)照,分析了葉片中小麥TaMlo-A1c基因在白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)間的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)TaMlo-A1c基因在未誘導(dǎo)的小麥抗白粉病品系“99-2439”葉片中有一定量的本底表達(dá),當(dāng)小麥白粉菌誘導(dǎo)12h之后,表達(dá)水平稍微有所提高,誘導(dǎo)24h后保持這一表達(dá)水平。同時(shí)利用半定量RT-PCR方法對(duì)小麥類受體蛋白激酶基因(TaLRK,GenBank登錄號(hào):AY584533)的表達(dá)進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,該基因在白粉菌誘導(dǎo)12h后的葉片中表達(dá)水平明顯增強(qiáng),誘導(dǎo)24h后表達(dá)水平進(jìn)一步增強(qiáng)(圖2)。進(jìn)一步驗(yàn)證了以小麥Actin基因作為對(duì)照,利用半定量RT-PCR方法研究小麥基因表達(dá)的可行性。2.2小麥幼苗根中tamlo-a1c基因的表達(dá)用半定量RT-PCR方法對(duì)TaMlo-A1c基因在小麥不同器官中的表達(dá)進(jìn)行了分析(圖3)。結(jié)果表明,TaMlo-A1c基因在小麥幼葉、壯葉、旗葉、幼莖、根、白粉菌誘導(dǎo)的根中都表達(dá),幼穗中不表達(dá)。它在葉中的表達(dá)水平明顯高于莖和根,莖中的表達(dá)水平稍微高于非誘導(dǎo)根。且該基因在白粉菌誘導(dǎo)的根中表達(dá)水平有所提高。由此可見小麥TaMlo-A1c基因表達(dá)強(qiáng)度依次為葉、莖、根,在穗中不表達(dá)。3半定量rt-pcr方法TaMlo-A1c是與小麥抗白粉病有關(guān)的重要負(fù)調(diào)控基因。Yu等以18srRNA為對(duì)照用Northern雜交方法,對(duì)白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)間小麥葉片中TaMlo-A1c基因的表達(dá)研究證明,該基因在白粉菌誘導(dǎo)后的葉片中表達(dá)稍微有所增強(qiáng)。由于Northern雜交所需RNA量較多(一般為20μg),操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí),需放射性同位素,對(duì)于序列高度相似的小麥Mlo基因家族,不可避免地產(chǎn)生交叉雜交,不能真實(shí)反應(yīng)一個(gè)基因的表達(dá)變化。為了解TaMlo-A1c基因在小麥不同器官中的表達(dá),本研究利用半定量RT-PCR方法,只需5μg的總RNA。根據(jù)TaMlo-A1cActin基因cDNA片段,設(shè)計(jì)了針對(duì)小麥TaMlo-A1c和Actin基因的特異性引物,通過半定量RT-PCR對(duì)TaMlo-A1c基因在小麥不同器官中的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明TaMlo-A1c基因在小麥葉、莖、根中均表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度依次為葉、莖、根,在穗中不表達(dá)。對(duì)白粉菌誘導(dǎo)后不同時(shí)間小麥葉片中TaMlo-A1c基因的表達(dá)分析表明,該基因在白粉菌誘導(dǎo)后表達(dá)稍微有所增強(qiáng),與Yu等的Northern雜交結(jié)果一致。綜合以前的研究認(rèn)為,盡管小麥TaMlo-A1c基因在Bgt誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄水平有所變化,但其實(shí)質(zhì)性的表達(dá)調(diào)控是在翻譯水平。同時(shí)本研究證明了Actin基因在小麥不同組織中表達(dá)穩(wěn)定,可以作為小麥基因表達(dá)研究的對(duì)照。半定量RT-PCR是目前研究基因轉(zhuǎn)錄水平的有效手段,可用來檢測(cè)基因表達(dá)及其變化狀況,并可進(jìn)行定量分析,與傳統(tǒng)的Northern雜交相比較,具有特異性高、操作簡(jiǎn)便、可靠性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。在植物基因表達(dá)研究方面得到了廣泛應(yīng)用。萬平等以微管蛋白基因(Tubulin)為對(duì)照,利用半定量RT-PCR,研究發(fā)現(xiàn)小麥鋅指蛋白基因(TazF)屬于組成型表達(dá)基因。王維平等以水稻肌動(dòng)蛋白基因(Actin)為對(duì)照,利用半定量RT-PCR研究,發(fā)現(xiàn)水稻RCOI1基因的表達(dá)受茉莉酸甲酯(MeJA)的誘導(dǎo)。同時(shí)半定量RT-PCR方法在病原體檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因的安全檢測(cè)及腫瘤的研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。運(yùn)用半定量RT-PCR方法研究小麥基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),需注意以下幾點(diǎn):(1)總RNA和cDNA的質(zhì)量。只有在總RNA未被降解的情況下,才能保證其中mRNA的完整性和隨后反轉(zhuǎn)錄的cDNA質(zhì)量,從而真實(shí)反映基因的表達(dá)。(2)總RNA的定量。在反轉(zhuǎn)錄之前,作為起始模板各個(gè)樣品中的總RNA量要一樣,cDNA量和電泳PCR產(chǎn)物量也要一樣,才能保證