微波法制備膠體金全抗原及其抑菌性能研究

微波法制備膠體金全抗原及其抑菌性能研究

氨基溶膠（pm）是氨基溶膠中的一種抗生素，其母核為酪氨酸和內(nèi)酰胺環(huán)。由于其抗菌譜比青霉素G廣,對革蘭氏陰性和陽性菌均有抑制作用,再加上毒性低,價(jià)格便宜,在免疫檢驗(yàn)、快速診斷、生物傳感器、植物保護(hù)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。由于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使和人們對抗生素殘留后的危害認(rèn)識不足,導(dǎo)致食品和環(huán)境中青霉素類抗生素的殘留,從而引起一系列安全隱患。1857年,法拉第用氯金酸溶液制得膠體金,發(fā)現(xiàn)在其中加入少量電解質(zhì)后,可使它由紅色變成藍(lán)色,最終凝集為無色,而加入明膠等大分子物質(zhì)后,可以阻止這種改變。這一發(fā)現(xiàn)奠定了膠體金制備和應(yīng)用基礎(chǔ),1971年Faulk等把他用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的透射電鏡研究,膠體金制備和應(yīng)用研究。由于膠體金具有較高電子密度,對生物活性物有良好吸附性能,當(dāng)作為配體的某些生物活性物與膠體金混合后便被吸附并保持其活性,同時膠體金易于制備和定量,穩(wěn)定性好,能滲入超薄切片的細(xì)胞內(nèi)部作為標(biāo)記物,從20世紀(jì)80年代起其研究報(bào)道呈上升勢態(tài)。膠體金標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為繼酶標(biāo)記、放射免疫標(biāo)記、熒光標(biāo)記3大標(biāo)記技術(shù)后,免疫標(biāo)記技術(shù)的又一大進(jìn)步。最近,俄羅斯科學(xué)家研究表明,膠體金能夠促使機(jī)體對抗生素等小分子類抗原產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答,使小鼠免疫系統(tǒng)的吞噬特性增強(qiáng),產(chǎn)生大量抗體。目前國內(nèi)外已經(jīng)有約20余種商品化膠體金試劑盒出售,如最常見的早孕檢測試紙、淋病檢測盒等,除毒品和興奮劑以外,其他小分子化合物的殘留檢測方面的研究和應(yīng)用卻很少見報(bào)道,更未見有應(yīng)用膠體金標(biāo)記法來快速檢測氨芐青霉素殘留的報(bào)道。為此,本文以微波法制得膠體金,并用戊二醛和EDC兩種方法制得氨芐青霉素的全抗原,根據(jù)正負(fù)電荷作用,硫鍵結(jié)合和表面疏水力結(jié)合狀況,制得氨芐青霉素的膠體金結(jié)合物,并對其活性進(jìn)行了檢驗(yàn)。為免疫法快速檢測氨芐青霉素殘留和電化學(xué)生物傳感器監(jiān)測系統(tǒng)的建立以及高效價(jià)抗體的產(chǎn)生奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株、儀器和分析方法氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸三鈉,分析純,天津市英博生化試劑有限公司;氨芐青霉素(AMP)、牛血清白蛋白(BSA),北京鼎國生物技術(shù)有限公司;戊二醛(GA),分析純,天津瑞金特化學(xué)品有限公司;碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),分析純,上海Sanland國際化學(xué)品有限公司;0.01mol/LpH7.4的PBS緩沖液、0.1mol/LpH4.7的MES緩沖液為自配;無菌LB培養(yǎng)基,自配;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.2紅外分光光度計(jì)JB-4A恒溫磁力攪拌器,上海理達(dá)儀器廠;WD800T微波爐,格蘭仕電器有限公司;UVPC-2401紫外可見光分光光度計(jì),日本島津;VECTOR22傅立葉紅外分光光度計(jì),德國布魯克;高速冷凍離心機(jī),日本日立;FDU2200冷凍干燥機(jī),日本RIDUKAKIKAI;恒溫培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器有限公司。1.1.3試驗(yàn)消毒試驗(yàn)菌株為大腸桿菌BL211.2方法1.2.1膠體金的制備按照文獻(xiàn),先將0.1×10-4mg/mLHAuCl4溶液100mL放入微波爐中,高檔沸騰2min,迅速一次加入4.0×10-2mL1mg/mL檸檬酸鈉水溶液,放入微波爐中在中檔保持3min,后呈現(xiàn)透明的橙紅色,即為15nm的膠體金。待液體涼后,用分光光度計(jì)測定其吸收曲線,避光4℃保存。1.2.2edc法和pbs的反應(yīng)GA法10mg氨芐青霉素溶于4mL二甲基甲酰胺中,然后加到8mL溶有100mg蛋白質(zhì)的PBS溶液中,而后在上述混合液中逐滴加入75μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的戊二醛。在室溫下用磁力攪拌器輕柔攪拌3h后,將反應(yīng)物取出,PBS透析72h,每12h換一次透析液。EDC法10mg牛血清白蛋白溶于1mL去離子水,振蕩,使之充分溶解,10mg氨芐青霉素溶于2.5mLMES緩沖液中,將此兩溶液混合振蕩均勻。取50mg碳化二亞胺完全溶解于5mL去離子水中,加入前面混合液中混勻,避光,靜置,室溫反應(yīng)4h,5000r/min離心10min,將上清液用PBS透析72h,每12h換一次透析液。兩種產(chǎn)品均小瓶分裝,標(biāo)記后-20℃保存。溶液中偶聯(lián)物的絕對含量通常以蛋白質(zhì)的相對濃度來表示,按照Bradford染色法,繪出BSA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,對應(yīng)曲線回歸出兩種方法全抗原中蛋白質(zhì)的濃度。用紫外-可見光分光光度計(jì)掃描濃度均為1mg/mL的氨芐青霉素、BSA和全抗原溶液,對兩種方法的偶聯(lián)比進(jìn)行估測。1.2.3膠體金-act全抗原結(jié)合物的制備采用Mey氏穩(wěn)定化實(shí)驗(yàn)確定最小蛋白用量,其操作過程為:在酶標(biāo)孔中分別加入pH6.0膠體金100μL,而后加入不同量的待標(biāo)記物,混均勻后各加入20μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaCl溶液,10min后肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果。取包被的臨界值的1.3倍作為標(biāo)記物的最佳使用量。將上述確定的兩種最佳全抗原用量和膠體金溶液,在磁力攪拌器下混合數(shù)分鐘后,加入一定量的PEG20000溶液,使其最終質(zhì)量濃度為0.5g/L;即為膠體金-AMP全抗原結(jié)合物。標(biāo)記后的膠體金-AMP全抗原結(jié)合物先以1200r/min,4℃離心20min,棄去凝聚的沉淀,而后16000r/min,4℃離心1h。重復(fù)離心兩次,用PBS液懸浮洗滌,而后將沉淀懸浮為原體積的1/10,4℃保存。氨芐青霉素與膠體金的直接結(jié)合,采用上述相同的方法。將結(jié)合物在去離子水中透析24h后,置于變色硅膠中濃縮至原體積的1/10,4℃保存。兩種方法全抗原與膠體金的結(jié)合物和AMP與膠體金的直接結(jié)合物進(jìn)行冷凍干燥,用紅外分光光度計(jì)檢測結(jié)合的具體情況。1.2.4抑菌環(huán)情況測定參考杯碟法操作,制成雙層平板,在牛津杯孔中分別加入100μL的AMP,GA法全抗原,EDC法全抗原,AMP-膠體金直接結(jié)合物,GA法全抗原-膠體金結(jié)合物,EDC法全抗原-膠體金結(jié)合物,37℃培養(yǎng)24h后觀察抑菌環(huán)情況。2結(jié)果與分析2.11掃描線的建立膠體金的粒徑不同會呈現(xiàn)相應(yīng)的顏色,15nm膠體金會呈現(xiàn)紅色,顆粒粒徑(10～70nm)與最大吸收峰之間呈線性相關(guān),基本符合如下直線回歸方程:Y=0.4271X+514.56。最大吸收峰主峰寬度越小,顆粒越均勻;主峰寬度越大,顆粒越不均勻。用紫外-可見光對樣品進(jìn)行掃描,曲線見圖1。用此微波還原法制得的膠體金在520.5nm處有最大吸收峰,回歸方程知道粒徑均值為13.9nm,且此峰相當(dāng)凸出,峰寬較小,判斷以此方法得到的膠體金顆粒粒徑基本上都在15nm左右,符合試驗(yàn)要求。2.2全抗原吸收峰的測定以考馬斯亮藍(lán)溶液作為空白,不同濃度的BSA在595nm下的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖2。將兩種方法所得的全抗原取與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照染色,對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算出相應(yīng)的濃度,再將其稀釋為0.1g/L,測定200～400nm的吸收峰情況,見圖3。根據(jù)偶聯(lián)比計(jì)算公式計(jì)算得兩種方法的偶聯(lián)比,戊二醛法為9∶1,EDC法為15∶1,這與文獻(xiàn)基本上保持一致。2.3氨芐激素的偶聯(lián)臨界值在Mey氏穩(wěn)定化實(shí)驗(yàn)中,GA法全抗原的膠體金變色臨界值為2.5μL,EDC法全抗原的臨界值為3μL,氨芐青霉素的直接偶聯(lián)臨界值是在經(jīng)過2h室溫反應(yīng)的情況下為50μL左右。因此確定3種情況標(biāo)記膠體金的最佳量為:GA法全抗原30μL/mL膠體金,EDC法全抗原40μL/mL膠體金,AMP500μL/mL膠體金。2.4膠體金的結(jié)合采用固體KBr壓片,以BSA、AMP、膠體金晶體的紅外光譜作為對照,檢測上面3種方法偶聯(lián)AMP和膠體金的結(jié)合情況,見圖4。從圖4可以看出,AMP在1780cm-1處有β-內(nèi)酰胺環(huán)的特征吸收峰,AMP-膠體金結(jié)合物此處不出峰,而在GC法全抗原-膠體金結(jié)合物和EDC法全抗原-膠體金結(jié)合物此處均有比較明顯的吸收峰,說明用全抗原的方法偶聯(lián)膠體金能夠?qū)MP和膠體金顆粒比較牢固的結(jié)合到一起。2.5活性產(chǎn)物的活性利用抗生素對細(xì)菌的抑制作用產(chǎn)生的抑菌環(huán)來驗(yàn)證偶聯(lián)物中抗生素的活性和偶聯(lián)狀況,見圖5。從圖5可以清晰地看出GA法和EDC法兩種方法制備的全抗原保留明顯的抗生素活性,對大腸桿菌生長有明顯的抑制作用。采用GA法制備的全抗原與膠體金的結(jié)合物有較強(qiáng)的抗原活性,而EDC法制備的全抗原與膠體金的結(jié)合物僅能表現(xiàn)出不明顯的抑菌效果,AMP和膠體金的直接結(jié)合物基本上看不出任何生物抑菌效果。3缺陷的抗原活性兩種偶聯(lián)方法制備的全抗原均有較好的活性,但當(dāng)將小分子半抗原、兩種全抗原與膠體金顆粒相結(jié)合時,紅外檢測表明兩種全抗原能夠與膠體金結(jié)合,抑菌試驗(yàn)卻表明只有GA法制得的全抗原和膠體金結(jié)合物能保持較好的抗原活性,分析原因如下:(1)GA作為偶聯(lián)劑是在氨芐青霉素的氨基端和蛋白質(zhì)的氨基端通過GA的兩個醛基形成了席夫堿結(jié)構(gòu)而偶聯(lián),但EDC作為偶聯(lián)劑則部分是通過噻唑環(huán)上的羧基和蛋白質(zhì)的氨基端反應(yīng)而偶聯(lián),此時抗原決定簇因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的位阻效應(yīng)可能會不能全部呈現(xiàn)出來。(2)EDC使用的最佳pH4.7可能會導(dǎo)致部分特征官能團(tuán)開環(huán)變化,引起抗生素降解。(3)標(biāo)記物與膠體金的結(jié)合反應(yīng)中,主要通過蛋