測定蛋白質(zhì)含量和相對分子質(zhì)量的方法

測定蛋白質(zhì)含量的方法1、凱式定氮法（Kjedahl法）；2、福林（Folin）酚試劑法（Lowry法）；3、雙縮脲法；4、染料結(jié)合法（Bradford法）5、紫外分光光度法；6、BCA比色法1、 凱式定氮法原理：在催化劑（如CuSO4,k2so4等）存在的條件下，將植物材料與濃硫酸共熱，有機(jī)物氧化分解為co2和h2o,其中的氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘?，并進(jìn)一步生成（NH4）2SO4,這個過程稱為消化。在消化后的樣品中，加入過量的NaOH，經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解釋放出NH3,通過蒸餾借助蒸汽將NH3導(dǎo)入過量的硼酸溶液，再用標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)到原來的H+濃度，根據(jù)鹽酸的用量即可計(jì)算出樣品中總氮的含量。優(yōu)點(diǎn)：1、是一種測定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，操作相對簡單；2、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較低。缺點(diǎn)：1、最終測定的是總有機(jī)氮，而不是蛋白質(zhì)氮；2、耗時(shí)較長；3、試劑具有腐蝕性。適用范圍：可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析2、 福林（Folin）酚試劑法此法的顯色原理與雙縮服方法相同，只是加了第二種試劑，即Folin酚是試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是：（1） 在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。（2） Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，操作簡單，不需要特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)長，需要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)曲也不是嚴(yán)格的直線形式，專一性差，干擾物質(zhì)較多。測定蛋白質(zhì)的濃度范圍是25?250四g/mL。3、 雙縮脲法名詞解釋：是肽和蛋白質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒有的一種顏色反應(yīng)。一般含有兩個或兩個以上的肽鍵化合物與CuSO4堿性溶液都能發(fā)生雙縮服反應(yīng)，而生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物，利用這個反應(yīng)借助分光光度計(jì)可以測定蛋白質(zhì)的含量。（2肽只有一個肽鍵，故要發(fā)生雙縮脲反應(yīng)至少是三肽）原理：紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可以用來測定蛋白質(zhì)的含量。測定的干擾物質(zhì)有：硫酸氨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。優(yōu)點(diǎn)：較快速，干擾物質(zhì)較少。缺點(diǎn)：顏色變化不明顯，不太靈敏。測定蛋白質(zhì)的濃度范圍是0.5~10mg/mL。4、 染料結(jié)合法該法基于蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250試劑反應(yīng)，產(chǎn)生一種亮藍(lán)色的化合物，在595nm有最大吸收。在一定的濃度范圍內(nèi)，吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量之間有線性關(guān)系，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。注意：未結(jié)合蛋白質(zhì)之前，染料試劑本身為棕褐色，在465nm有吸收。該法優(yōu)點(diǎn)：快速，簡便，干擾因素少。該法缺點(diǎn)：測定的蛋白質(zhì)溶液濃度不能太高。5、 紫外分光光度法蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在280nm處有特征性的最大吸收峰，可用于置白質(zhì)的定量。優(yōu)點(diǎn)：此法簡便、快速、不損失樣品。缺點(diǎn)：若樣品中含有其他具有紫外吸收的雜質(zhì)，如核酸等，可產(chǎn)生較大的誤差，故應(yīng)作適當(dāng)?shù)男Ｕ?。測定蛋白質(zhì)的濃度范圍是0.1~0.5mg/mL。6、 BCA比色法其原理是在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+再與BCA試劑（4,4'-二羧酸-2,2'-二哇啉鈉）生成紫色復(fù)合物，于562mm處有最大吸收，其強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。優(yōu)點(diǎn)：此法最大特點(diǎn)是：TritonX-100、SDS等表面活性劑無干擾作用，其他優(yōu)點(diǎn)是：簡便、快速、靈敏，可望替代傳統(tǒng)的Lowry法。缺點(diǎn)：試劑較貴。測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（Mr）的方法1、凝膠過濾法；2、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法；3、沉降分析法（超離心沉降法）4、根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量；5、滲透壓法1、 凝膠過濾法原理：當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻凝膠珠之外隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動并最先流出柱外，比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。這樣由不同大小的分子所經(jīng)路徑不同而得以分離，大分子物質(zhì)先被洗脫出來，小分子物質(zhì)后被洗脫出來。優(yōu)點(diǎn)：方法準(zhǔn)確，操作方便，重現(xiàn)性好。缺點(diǎn)：操作的技術(shù)要求較高，耗時(shí)較長。適用范圍：只適用于測定球狀蛋白分子的相對分子質(zhì)量。（蛋白質(zhì)分子流經(jīng)凝膠珠的速度并不直接取決于分子的質(zhì)量，而是他的斯托克半徑。利用凝膠過濾測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白（已知Mr和斯托克半徑）和待測定蛋白必須具有相同的分子形狀，接近球體，否則不能得到比較準(zhǔn)確的Mr。分子形狀為線型的或與凝膠珠能產(chǎn)生吸附作用的蛋白質(zhì)則不能夠用此法測定Mr。）2、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法簡介與比較：SDS：十二烷基硫酸鈉——去污劑蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，他的遷移率取決于他所帶的凈電荷，以及分子大小和形狀等因素。（沒有加入SDS）若在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與原來所帶的電荷和分子形狀無關(guān)。（加入了SDS）原理：由于SDS是一種帶負(fù)電荷的陰離子去垢劑，并且具有長長的疏水性碳?xì)滏湣＿@種性質(zhì)不僅使得寡聚蛋白質(zhì)的亞基拆離，而且還能拆開肽鏈的折疊結(jié)構(gòu)，并且沿著伸展的肽鏈吸附在上面。這樣吸附在肽鏈上帶電荷的SDS分子使得肽鏈帶凈負(fù)電荷，并且吸附的SDS量與肽鏈的大小成正比。結(jié)果是，不同大小的肽鏈將含有相同或幾乎相同的q/r值。由于聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)具有篩分效應(yīng)，所以分子較小的肽鏈將比較大的，但具有相同的q/r值的肽鏈遷移的更快。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單，分離時(shí)間短。缺點(diǎn)：單體聚丙烯酰胺具有毒性，會對神經(jīng)系統(tǒng)以及皮膚等產(chǎn)生不良影響，且影響因素較多。3、沉降分析法（筆記第23頁）原理：蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí)，如果蛋白質(zhì)的密度大于溶液的密度，蛋白質(zhì)分子就會發(fā)生沉降。沉降的速度與蛋白質(zhì)分子大小和密度有關(guān)。利用超速離心機(jī)測定蛋白質(zhì)或其他生物大分子的相對分子質(zhì)量，不同的蛋白質(zhì)由于其分子大小不同，在一定的離心力場中沉降的速度也不同。（純的蛋白質(zhì)溶液中只含有分子質(zhì)量和形狀相同的蛋白質(zhì)分子，在離心場作用下，他們都是以同一沉降速度移動，因此在蛋白質(zhì)溶液與溶劑之間有一個清晰界面。在沉降分析圖譜上呈現(xiàn)一個峰。如果蛋白