生化大實(shí)驗(yàn)報(bào)告

生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告[鍵入文檔副標(biāo)題]

實(shí)驗(yàn)一多酚氧化酶（PPO）的分離與提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯為主要的實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)細(xì)胞組織破碎勻漿、過(guò)濾、離心、硫酸銨沉淀、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。2、通過(guò)本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和了解蛋白質(zhì)的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關(guān)儀器設(shè)備的操作使用，以及蛋白質(zhì)的提取、分離的系統(tǒng)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，位于質(zhì)體、微體內(nèi)，參與植物抗體的調(diào)節(jié)，屬于末端氧化酶的一種。在植物體受到機(jī)械損傷和病毒感染后，PPO催化酚與氧氧化成醌，使組織形成褐變，對(duì)PPO弄得的測(cè)定便是通過(guò)PPO氧化酚產(chǎn)生醌的變色反應(yīng)測(cè)定其酶活性。在蛋白質(zhì)水溶液中，加入少量的中性鹽，如硫酸銨、氯化鈉等，會(huì)增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，從而使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大。這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽溶；而在蛋白質(zhì)水溶液中繼續(xù)加入無(wú)機(jī)鹽類(lèi)可以其溶解度降低而析出的過(guò)程，該現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。蛋白本身隨鹽濃度的溶解度變化曲線具有特征性，可以依據(jù)此分離蛋白，硫酸銨分級(jí)便依據(jù)此原理，首先在蛋白質(zhì)溶解度最高時(shí)，離心取上清，去除此時(shí)未溶解或已經(jīng)沉淀的雜蛋白，之后再其溶解度最低且未變性的時(shí)候離心取沉淀復(fù)溶，去除尚未析出的雜蛋白，從而達(dá)到純化目的蛋白的目的。多酚氧化酶在40%硫酸銨溶液中溶解度最高，而在75%硫酸銨溶液中沉淀量最高，由此可分離提取多酚氧化酶。但使用硫酸銨分級(jí)，分離后的產(chǎn)物中會(huì)有銨根離子殘留，如果采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)，殘留的銨根離子會(huì)造成測(cè)定時(shí)高于實(shí)際值，同時(shí)該樣品之后會(huì)用于離子交換層析純化，所以需要去除其中的離子，故需要透析去除其中銨根離子。多酚氧化酶提取在PH6.0的中性偏酸條件下進(jìn)行，在此PH值下，磷酸緩沖液的緩沖能力最強(qiáng)，故選擇使用其作為緩沖液，其中加入的EDTA為螯合劑，聚乙烯比咯烷酮是用于吸附醌，本身為固體顆粒，不需要溶解。三、儀器與試劑：（1）馬鈴薯200g（2）試劑：溶液A：0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯比咯烷酮）固體硫酸銨溶液B：0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，0.005M氯化鎂）實(shí)驗(yàn)器械與儀器設(shè)備：燒杯，玻璃棒，量筒，天平，高速冷凍離心機(jī)，離心杯，透析袋，植物組織勻漿器，過(guò)濾紗布。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、將馬鈴薯切削塊，按照1g:1ml的比例加入0.03M磷酸緩沖液，放入植物組織勻漿器，將馬鈴薯充分粉碎使PPO從細(xì)胞中釋放出來(lái)。2、將處理過(guò)的溶液用四層紗布過(guò)濾，去除溶液中的大顆粒固性物質(zhì)，裝離心瓶配平后，12000轉(zhuǎn)離心10min。3、離心后取上清液162ml，查表知欲得到0℃硫酸銨40%飽和度需要加入無(wú)水硫酸銨29.92g，稱(chēng)量加入溶液中，用玻璃棒輕輕攪拌，避免因?yàn)闄C(jī)械剪切導(dǎo)致蛋白變性，0℃靜置一小時(shí)。4、靜置一小時(shí)后，裝離心瓶，調(diào)平后離心機(jī)12000轉(zhuǎn)離心10min，棄沉淀得上清液192ml，查表知欲得0℃硫酸銨75%飽和度需要再加無(wú)水硫酸銨35.90g，稱(chēng)量后加入，用玻璃棒輕輕攪拌，0℃靜置2小時(shí)沉淀。5、將透析前樣品抽500ul作為粗酶樣品。6、兩小時(shí)后，裝離心瓶，調(diào)平后12000轉(zhuǎn)離心10min，棄上清液，沉淀加10ml溶液B復(fù)溶，裝透析袋綁好透析過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)二離子交換柱層析純化多酚氧化酶（PPO）及活性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)離子交換層析分離純化PPO的操作，掌握該層析的基本原理、運(yùn)用及操作技術(shù)。2、通過(guò)純化PPO檢驗(yàn)之前提取PPO的實(shí)驗(yàn)是否成功。3、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)并掌握傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)活性及濃度測(cè)定的方法、原理及相關(guān)儀器設(shè)備的操作。二、實(shí)驗(yàn)原理離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類(lèi)不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過(guò)一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑可以分為3部分；高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合,形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子,它能與溶液中其他的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用,稱(chēng)為陽(yáng)離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用,稱(chēng)為陰離子交換劑。離子交換反應(yīng)可以表示為；陽(yáng)離子交換反應(yīng):(R—X-)Y++A+(R—X-)A++Y+

陰離子交換反應(yīng):(R—X+)Y-+A-(R—X+)A-+Y-

R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì),X-和X+分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán),Y+和Y-分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子,A+和A-分別代表溶液中的離子基團(tuán)。當(dāng)A離子與離子交換劑的結(jié)合力強(qiáng)于Y離子,或者提高A離子的濃度,或者通過(guò)改變其他一些條件,可以使A離子將Y離子從離子交換劑上置換出來(lái)。也就是說(shuō),在一定條件下,溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來(lái),并通過(guò)電荷基團(tuán)結(jié)合到固定相上,而平衡離子則進(jìn)入流動(dòng)相,這就是離子交換層析的基本置換反應(yīng)。通過(guò)在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對(duì)溶液中不同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。

PPO是通過(guò)DE52弱堿性陰離子交換劑分離純化的，過(guò)程大體為：陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電,裝柱平衡后,與緩沖溶液中的帶負(fù)電的平衡離子結(jié)合。待分離溶液中可能有正電基團(tuán)、負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)。加樣后,負(fù)電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交換劑上。而正電基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交換劑結(jié)合,隨流動(dòng)相流出而被去除。通過(guò)選擇合適的洗脫方式和洗脫液,如增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)進(jìn)行交換，而將各種負(fù)電基團(tuán)置換出來(lái),隨洗脫液流出。與離子交換劑結(jié)合力小的負(fù)電基團(tuán)先被置換出來(lái)，而與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的需要較高的離子強(qiáng)度才能被置換出來(lái)，這樣各種負(fù)電基團(tuán)就會(huì)按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大到順序逐步被洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離目的。分離過(guò)程中的蛋白質(zhì)濃度是通過(guò)考馬斯亮藍(lán)技術(shù)測(cè)定的，考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax)，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，該染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595nm，與蛋白質(zhì)濃度成正比。PPO催化各種酚與氧氣氧化為醌，以鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉-0.1M檸檬酸緩沖液pH=8.5的反應(yīng)體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計(jì)410nm處使反應(yīng)體系的OD值發(fā)生變化，通過(guò)OD值上升的度數(shù)變化確定PPO的酶活力大小。三、儀器與試劑：試劑：0.02MTris-HCl緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.001MEDTA)，考馬斯亮藍(lán)試劑，檸檬酸緩沖液，鄰苯二酚，氯化鈉；聚乙二醇；DEAE-纖維素DE52；設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃棒、滴管等、層析柱，PH試紙，恒流泵，梯度混合儀，核酸蛋白檢測(cè)儀，GL-20C高速冷凍離心機(jī)，酶標(biāo)板、分光光度計(jì)、分析天平、容量瓶、移液管和試管等。四、實(shí)驗(yàn)步驟將經(jīng)過(guò)透析的PPO蛋白粗酶溶液放入50ml離心管中12000轉(zhuǎn)4℃離心10min，取上清液備用，以此確保無(wú)固性物質(zhì)，防止其破壞膠體。將層析柱洗凈，并確保在下出水口處沒(méi)有氣泡存留且可以正常出水，將已經(jīng)配置好的柱材輕輕倒入層析柱中，勻速添加防止出現(xiàn)多個(gè)柱面，直到柱面到達(dá)8cm左右時(shí)停止。裝好的層析柱上端連接恒流泵，下端用一燒杯承液，恒流泵首先連接緩沖液，利用緩沖液將層析柱中的溶液置換出來(lái)，約5分鐘后開(kāi)始用PH試紙檢測(cè)下出水口流出液體PH值，直到流出液PH與緩沖液PH相同時(shí)停止。將粗酶液上柱，用微量移液器緩慢加入，加樣過(guò)程中連續(xù)，保證液面在柱面上1cm處，防止液體低于柱材破碎，共上樣10ml。用含氯化鈉（0.2-0.6M）的0.02MTris-HCl緩沖液PH7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）進(jìn)行梯度洗脫。每5ml一個(gè)試管收集并進(jìn)行編號(hào)，首先收集4管，編號(hào)1-4，為雜蛋白，之后收集16管樣品，編號(hào)5-20，為可能含有PPO的樣品。從1-20號(hào)樣品管中抽取20ul樣品分別加至酶標(biāo)板中，加20ul考馬斯亮藍(lán)溶液，室溫下靜置2min，測(cè)其OD595值并進(jìn)行記錄，該數(shù)據(jù)說(shuō)明其中粗蛋白含量。從1-20號(hào)樣品管中抽取20ul樣品分別加至酶標(biāo)板中，加20ul檸檬酸緩沖溶液并加20ul鄰苯二酚于30℃環(huán)境中靜置2min，測(cè)其OD410值并進(jìn)行記錄，該數(shù)據(jù)說(shuō)明其中多酚氧化酶的含量。對(duì)上一實(shí)驗(yàn)中的粗酶提取物樣品重復(fù)第（7）（8）兩步，測(cè)其粗蛋白含量及比活力。0-100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取0.5ml含20、40、60、80、100μg蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，分別放入10ml的試管中，加5.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，將溶液混勻，2min后在分光光度計(jì)594nm處測(cè)定其吸光值，空白以去離子水或蒸餾水代替。吸光值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中蛋白濃度的測(cè)定：要求待測(cè)樣品中的蛋白濃度范圍為1-1000μg/ml之間，若濃度過(guò)高，需要對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)儆弥谱鳂?biāo)準(zhǔn)曲線的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的0.D595值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品的蛋白濃度。五、結(jié)果及分析考馬斯亮藍(lán)OD595試管編號(hào)12345678910OD值0.2060.6050.03700000.0240.1440.31試管編號(hào)11121314151617181920OD值0.1720.2110.3860.0840.1680.1320.2310.1860.1180.164檸檬酸緩沖液OD410試管編號(hào)12345678910OD值0000000000.026試管編號(hào)11121314151617181920OD值0.0420.050.0620.0710.0940.1120.2010.1740.0640.03粗酶提取物比活力：OD410=0.192純化倍數(shù)=純化后比活力/粗酶比活力：0.201/0.192=1.047結(jié)果分析：圖1-1多酚氧化酶（PPO）離子交換柱純化結(jié)果多酚氧化酶（PPO）通過(guò)離子交換柱純化的結(jié)果如圖1-1，橫坐標(biāo)為洗脫體積，對(duì)應(yīng)1-20號(hào)試管，共總洗脫體積為100ml。縱坐標(biāo)為OD值，其中藍(lán)色OD595Z折線表示考馬斯亮藍(lán)測(cè)定時(shí)粗蛋白含量的變化，數(shù)值高低表示其中粗蛋白含量多少；紅色OD410折線為檸檬酸緩沖液測(cè)定時(shí)多酚氧化酶含量的變化，數(shù)值高低表示其中酶比活力的高低。所有OD值除0值外，均在0.1-0.8之間，無(wú)異常值，無(wú)需稀釋后在測(cè)定?？捡R斯亮藍(lán)測(cè)定結(jié)果中，2號(hào)試管即5-10ml的OD595值最高為0.605，為雜蛋白中蛋白含量最高的。而在含有目的蛋白的5-20號(hào)試管中，13號(hào)試管OD595值最高為0.386，；4-7管OD595最低為0，該OD值說(shuō)明的是其中的粗蛋白含量，其中共有5個(gè)蛋白峰，分別為2號(hào)，10號(hào)，13號(hào)，15號(hào)，17號(hào)管，其中2號(hào)管為雜蛋白峰。雜蛋白洗脫為1-4號(hào)試管，通過(guò)折線圖可觀察到，在4號(hào)管處，OD595值為0，并在之后5-7管仍然為0，可認(rèn)為大部分雜蛋白榆次已經(jīng)幾乎洗脫，檸檬酸緩沖液結(jié)果也證明了這一觀點(diǎn)。檸檬酸緩沖液中OD410測(cè)定過(guò)程中，從10號(hào)試管開(kāi)始出現(xiàn)不為0，此時(shí)為多酚氧化酶開(kāi)始洗脫的體積，為45-50ml，其濃度一直處于增加狀態(tài)，直至17號(hào)試管處，此處有峰值為0.201,之后酶活性下降明顯，與20號(hào)試管處其值僅為0.3，可認(rèn)為PPO以全部洗脫，故PPO洗脫體積共50ml。純化倍數(shù)為1.047，相較于純化之前，純化效果不明顯，這與預(yù)期的純化結(jié)果相差較多。出現(xiàn)純化效果不好的原因較多，主要原因可能存在于三個(gè)方面：①在多酚氧化酶提取過(guò)程中存在問(wèn)題?？赡軘嚢钑r(shí)措施不當(dāng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)變性，并且有時(shí)會(huì)碰到燒杯壁，攪拌溶解過(guò)程出現(xiàn)的很多氣泡都說(shuō)明很可能是這一步導(dǎo)致了最后純化倍數(shù)偏低。因?yàn)槿鄼z測(cè)結(jié)果均不是很良好，甚至部分組純化倍數(shù)低于1，由此懷疑可能是透析袋存在問(wèn)題，因孔徑太大導(dǎo)致目的蛋白流出，導(dǎo)致純化倍數(shù)降低，這可能是因?yàn)樵就肝龃趶骄瓦^(guò)大或在處理過(guò)程中導(dǎo)致用力擠壓或拉伸導(dǎo)致透析袋孔徑變大。②可能是在離子交換柱分離過(guò)程中操作不當(dāng)，灌柱的過(guò)程中，柱面高度或許不夠高，上柱過(guò)程中柱面上方的液體體積過(guò)多，導(dǎo)致柱體過(guò)密，分離效果不好。③測(cè)定OD值時(shí)出現(xiàn)問(wèn)題，在使用時(shí)，儀器讀數(shù)變化極大，每次測(cè)定時(shí)很不穩(wěn)定，甚至有20孔全部沒(méi)有讀數(shù)的情況出現(xiàn)，可能是使用人數(shù)過(guò)多，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致儀器溫度升高，測(cè)定值不準(zhǔn)導(dǎo)致的。以上三個(gè)方面均有可能導(dǎo)致純化倍數(shù)過(guò)低，但是無(wú)法確認(rèn)是某一方面單獨(dú)導(dǎo)致，還是綜合因素引起純化倍數(shù)過(guò)低，只能在下次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中多加注意，避免類(lèi)似問(wèn)題再次發(fā)生。實(shí)驗(yàn)三分子篩層析純化多酚氧化酶（PPO）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)分子篩純化多酚氧化酶（PPO），學(xué)習(xí)分子篩純化原理，了解分子篩層析純化步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理分子篩層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。分子篩層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成許多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散,組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長(zhǎng)，流動(dòng)速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之間的分子在流動(dòng)中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時(shí)間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過(guò)分子篩層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。三、儀器與試劑：試劑：0.02MTris-HCl緩沖液PH7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）配置是X10倍濃縮液1000ml；葡萄糖凝膠SePHadexG-200、蘭葡萄糖、考馬斯亮藍(lán)試劑、檸檬酸緩沖液，鄰苯二酚。設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃棒、微量移液器、層析柱、PH試紙、恒流泵、核酸蛋白檢測(cè)儀，GL-20C高速冷凍離心機(jī)、DL-7A大容量低俗冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)板。四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）將二中的OD410值最高的17號(hào)試管與5ml一中離心后的粗酶提取物混合后離心5分鐘，取上清液加入蘭葡萄糖，攪拌使其完全溶解后備用。（2）將層析柱洗凈，并確保在下出水口處沒(méi)有氣泡存留且可以正常出水，將已經(jīng)配置好的柱材輕輕倒入層析柱中，勻速添加防止出現(xiàn)多個(gè)柱面，直到柱面到距層析柱柱口1.5-2cm左右時(shí)停止。（3）裝好的層析柱上端連接恒流泵，下端用一燒杯承液，恒流泵首先連接緩沖液，利用緩沖液將層析柱中的溶液置換出來(lái)，約5分鐘后開(kāi)始用PH試紙檢測(cè)下出水口流出液體PH值，直到流出液PH與緩沖液PH相同時(shí)停止。（4）用1000ul微量移液器將（1）中加入蘭葡萄糖后的樣品加入層析柱中，加樣過(guò)程連續(xù)，保證不因?yàn)槿藶橐蛩貙?dǎo)致樣品分層。（5）每5ml一個(gè)試管收集并進(jìn)行編號(hào)，共收集20管，并記錄藍(lán)色于何時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，何時(shí)結(jié)束（6）從1-20號(hào)樣品管中抽取20ul樣品分別加至酶標(biāo)板中，加20ul考馬斯亮藍(lán)溶液，室溫下靜置2min，測(cè)其OD595值并進(jìn)行記錄，該數(shù)據(jù)說(shuō)明其中粗蛋白含量。（7）從1-20號(hào)樣品管中抽取20ul樣品分別加至酶標(biāo)板中，加20ul檸檬酸緩沖溶液并加20ul鄰苯二酚于30℃環(huán)境中靜置2min，測(cè)其OD410值并進(jìn)行記錄，該數(shù)據(jù)說(shuō)明其中多酚氧化酶的含量。五、結(jié)果及分析藍(lán)色于第5管中出現(xiàn)，于第14管中消失，即于20ml開(kāi)始出現(xiàn)，于70ml時(shí)消失。考馬斯亮藍(lán)OD595值：試管編號(hào)12345678910OD值00000.1560.4400.4000.3160.1240.253試管編號(hào)11121314151617181920OD值0.1010.07-0.0230.06400.0770000檸檬酸緩沖液OD410值：試管編號(hào)12345678910OD值0000000.0310.0720.1010.227試管編號(hào)11121314151617181920OD值0.0620.0420.0170.006000000純化倍數(shù)：純化后比活力/純化后比活力=0.227/0.192=1.18結(jié)果分析：圖1-2多酚氧化酶（PPO）分子篩層析純化結(jié)果多酚氧化酶（PPO）通過(guò)分子篩層析純化的結(jié)果如圖1-2，橫坐標(biāo)為洗脫體積，對(duì)應(yīng)1-20號(hào)試管，共總洗脫體積為100ml?？v坐標(biāo)為OD值，其中藍(lán)色OD595Z折線表示考馬斯亮藍(lán)測(cè)定時(shí)粗蛋白含量的變化，數(shù)值高低表示其中粗蛋白含量多少；紅色OD410折線為檸檬酸緩沖液測(cè)定時(shí)多酚氧化酶含量的變化，數(shù)值高低表示其中酶比活力的高低。無(wú)高于，0.8的數(shù)值，無(wú)需稀釋后在測(cè)定，低于0.1的數(shù)值，認(rèn)為其含量過(guò)低，近似于0處理?？捡R斯亮藍(lán)測(cè)定結(jié)果中，6號(hào)試管即25-30ml的OD595值最高為0.356，其中粗蛋白含量最高蛋白含量最高的。1-4管與15-20管OD595最低為0，這與藍(lán)色出現(xiàn)與消失的試管號(hào)相符，該折線圖有其中共有2個(gè)蛋白峰，分別為6號(hào)，1-號(hào)管，蛋白峰和峰值明顯低于離子交換層析結(jié)果，純化結(jié)果較好。檸檬酸緩沖液中OD410測(cè)定過(guò)程中，從6號(hào)試管開(kāi)始出現(xiàn)不為0，此時(shí)為多酚氧化酶開(kāi)始洗脫的體積，為45-50ml，其濃度一直處于增加狀態(tài)，直至10號(hào)試管處，此處有峰值為0.227,為酶峰，之后一直下降，與14號(hào)管處完全消失。此比活力為0，227高于之前的0.201，純化效果較上一步好。純化倍數(shù)為1.18，相較于純化之前，純化效果不明顯，但較離子交換層析結(jié)果有一定這與預(yù)期的純化結(jié)果相差較多。該步奏出現(xiàn)純化效果不好的原因主要問(wèn)題應(yīng)存在于兩個(gè)方面，其一是離子交換層析柱中的多酚氧化酶活性本身就不是很高，分子篩純化后，提升幅度有限；其二，儀器問(wèn)題可能仍然會(huì)干擾本不實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)以上兩個(gè)方面綜合起來(lái)，導(dǎo)致純化倍數(shù)過(guò)低，在下次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中會(huì)多加注意，避免類(lèi)似問(wèn)題再次發(fā)生。實(shí)驗(yàn)四胰酶分離提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)從豬胰臟中之美胰酶結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結(jié)晶的操作技術(shù)。2.為親和層析、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)樣品。二、實(shí)驗(yàn)原理胰蛋白酶是以無(wú)活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端賴(lài)氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開(kāi)，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。胰蛋白酶原的相?duì)分子質(zhì)量約為24000，其等電點(diǎn)約為PH值為8.9，胰蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量與其酶原接近(23300)，其等電點(diǎn)約為PH值為10.8，最適PH值為7.6～8.0，在PH值為3時(shí)最穩(wěn)定，低于此PH值時(shí)，胰蛋白酶易變性，在PH值>5時(shí)易自溶。Ca2+離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用。重金屬離子、有機(jī)磷化合物和反應(yīng)物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰臟、卵清和豆類(lèi)植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑。最近發(fā)現(xiàn)在一些植物的塊莖(如土豆、白薯、芋頭等)中也存在有胰蛋白酶抑制劑。從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶時(shí)，一般是用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來(lái)，然后再根據(jù)等電點(diǎn)的沉淀原理，調(diào)節(jié)PH值以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等(包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原)沉淀析出。經(jīng)溶解后，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?糜蛋白酶和彈性蛋白酶同時(shí)也被激活)，被激活的酶溶液再以鹽析分級(jí)的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白。三、儀器與試劑：（1）凍豬胰臟（2）PH2.5乙酸酸化水、2.5mol/LH2SO4、5mol/LNaOH、硫酸銨、氯化鈣、2mol/LNaOH、0.8mol/L,PH值為9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8mol/L硼酸溶液,加80ml0.2mol/L四硼酸鈉溶液,混合后,用PH計(jì)檢查校正、0.4mol/LPH值為9.0硼酸緩沖液(稀釋1倍即可)、0.2mol/LPH值為8.0硼酸緩沖液:取70ml0.2mol/L硼酸溶液,加30ml0.5mol/L四硼酸鈉溶液,混合后,用PH值計(jì)校正)、2mol/LHCl、0.01mol/LHCl、BAEE-0.15mol/L、PH值為8.0Tris-HCl緩沖液(每毫升Tris緩沖液含0.11mgBAEE和2.22mg的氯化鈣)。（3）恒溫水浴鍋、離心機(jī)、組織粉碎機(jī)、PH試紙、燒杯、離心瓶、量筒、微量移液器、透析袋。四、實(shí)驗(yàn)步驟：將冷凍的豬胰臟在冰水沖洗下剝離其上的脂肪與結(jié)締組織，減少雜蛋白含量。將洗凈的胰臟放入組織粉碎機(jī)后加2倍體積的冷卻的PH2.5-3.0的乙酸酸化水后進(jìn)行粉碎。檢測(cè)提取液中PH，若高于3.0則用10%乙酸調(diào)節(jié)之后再4℃過(guò)夜。將過(guò)夜后的樣品用四次紗布過(guò)濾將濾液在12000r/min下離心十分鐘，取上清液在上清液中加入硫酸銨至75%飽和度，靜置兩小時(shí)將溶液裝離心瓶12000r/min離心十分鐘，棄上清液將沉淀用10ml去離子水復(fù)溶后裝透析袋透析過(guò)夜備用實(shí)驗(yàn)五卵清蛋白分離提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)對(duì)雞卵粘蛋白的分離提取，掌握蛋白質(zhì)分離提取的主要技術(shù)和操作，以及相關(guān)儀器設(shè)備的操作。二、實(shí)驗(yàn)原理雞卵黏蛋白存在于雞蛋清中，對(duì)以擔(dān)保有強(qiáng)烈的抑制作用，高純度的雞卵黏蛋白抑制胰蛋白酶的分子比為1:1，故此可以用雞卵黏蛋白作為親和配基制備純化胰酶的親和柱材。雞卵黏蛋白是糖蛋白，分子量為28000，但糖成分上有差別。有四種不同組分，等電點(diǎn)的范圍為PH3.9-4.5,280nm的消光系數(shù)為：A=4.13（1%，1cm）。同時(shí)雞卵黏蛋白在中性或酸性溶液中，在25-30℃較高溫度下或高濃度的脲中都很穩(wěn)定，而且本身耐機(jī)械剪切，可以根據(jù)此設(shè)計(jì)卵清蛋白提取實(shí)驗(yàn)。三、儀器與試劑：（1）新鮮雞蛋兩只（2）10%TCA（用固體NaOH調(diào)PH至1.05~1.10,需50ml）、5MHCL、5MNaOH、冷丙酮、BAEE-0.15mol/L、PH值為8.0Tris-HCl緩沖液(每毫升Tris緩沖液含0.11mgBAEE和2.22mg的氯化鈣)（3）恒溫水浴鍋、離心機(jī)、PH試紙、燒杯、離心瓶、量筒、微量移液器、透析袋。四、實(shí)驗(yàn)步驟：取蛋清50ml，至于燒杯中，外用溫水浴25-30攝氏度，在不斷攪拌條件下，緩慢加入等體積三氯乙酸-丙酮（1V：2V），會(huì)立即出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，加完后最終PH約3.5，再繼續(xù)攪拌30min，然后在4℃放置過(guò)夜。過(guò)夜后樣品用四層紗布過(guò)濾，去除部分雜質(zhì)。將濾液中加入4℃預(yù)冷的丙酮200ml沉淀蛋白，4℃靜置2h。將靜置后的溶液裝離心瓶12000R/min離心10分鐘，取沉淀。將沉淀溶于10ml去離子水，復(fù)溶后裝透析袋過(guò)夜透析備用。實(shí)驗(yàn)六親和層析純化胰酶一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.去除混雜的與胰蛋白酶相近似的蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）和彈性蛋白酶。2.通過(guò)將胰蛋白酶抑制劑——雞卵粘蛋白與Sephadex-G75偶聯(lián)及親和層析純化胰酶的操作，以了解親和層析的基本原理，掌握親和柱材活化偶聯(lián)及親和層析操作的基本過(guò)程和技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理親和層析主要是根據(jù)生物分子與其特定的固相化的配基或配體之間具有一定的親和力而使生物分子得以分離。這是由一種典型的吸附層析發(fā)展而來(lái)的分離純化方法。許多生物分子都有一種獨(dú)特的生物學(xué)功能。即它們都具有能和某些相對(duì)應(yīng)的專(zhuān)一分子可逆地結(jié)合的特性(分子間通過(guò)某些次級(jí)鍵結(jié)合，如范德華力，疏水力，氫鍵等，在一定條件下又可解離)。如：酶和底物(包括酶的抑制劑、產(chǎn)物、輔酶及其底物的類(lèi)似物)的結(jié)合。特異性的抗體-抗原(包括病毒、細(xì)胞)、激素與其受體、載體蛋白，基因與其互補(bǔ)DNA、mRNA及阻遏蛋白的結(jié)合，植物凝集素與淋巴細(xì)胞表面抗原及某些多糖的結(jié)合等。均屬于專(zhuān)一性而可逆的結(jié)合。這種分子之間的結(jié)合能力叫做親和力。親和層析正是利用生物分子間所具有的專(zhuān)一親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。所以有人稱(chēng)為“生物專(zhuān)一吸附技術(shù)”或“功能層析技術(shù)”。在實(shí)際工作中，只要把被識(shí)別的分子，稱(chēng)為配基（ligand)，在不損害其生物學(xué)功能的條件下共價(jià)結(jié)合到水不溶性載體或基質(zhì)上(matrix,如SePHarose4B)制成親和吸附劑，然后裝柱。再把含有要分離純化的物質(zhì)的混合液通過(guò)這個(gè)柱子，這時(shí)絕大部分對(duì)配基沒(méi)有親和力的化合物均順利地流過(guò)層析柱而不滯留，只有與配基互補(bǔ)的化合物被吸附留在柱內(nèi)。當(dāng)所有的雜質(zhì)從柱上流走后，再改變洗脫條件，使結(jié)合在配基上的物質(zhì)解離下來(lái)。本實(shí)驗(yàn)為了純化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制劑—雞卵黏蛋白作為配基制成親和吸附劑，從胰臟粗提取液中純化胰蛋白酶。雞卵黏蛋白是專(zhuān)一性較高的胰蛋白酶抑制劑，對(duì)牛和豬的胰蛋白酶有相當(dāng)強(qiáng)的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在PH值為7～8的緩沖溶液中卵黏蛋白與胰蛋白酶牢固地結(jié)合，而在PH值為2～3時(shí)，又能被解離下來(lái)。因此,采用雞卵黏蛋白作成的親和吸附劑可以從胰臟粗提液中通過(guò)一次親和層析直接獲得活力大于10000BAEE單位/毫克蛋白的胰蛋白酶制品，比用經(jīng)典分離純化方法簡(jiǎn)便得多。純化效率可達(dá)到10～20倍以上。三、儀器與試劑：試劑：2.5g干重的葡聚糖凝膠SePHadexG-75、0.05MNaI04溶液50ml、純化的雞卵黏蛋白87.5mg、5%K2CO3、0.27GKBH4（溶于20ml水）、0.1MTris-HClPH7.5（含0.5MKCl，0,05MCaCl2）200ml、粗胰蛋白酶液約50ml、0.1M甲酸鈉-0.5MKClPH2.5100ml、考馬斯亮藍(lán)。儀器：試管與試管架、燒杯、玻璃棒、微量移液器、層析柱、PH試紙、恒流泵核酸蛋白檢測(cè)儀，GL-20C高速冷凍離心機(jī)、DL-7A大容量低俗冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)板。四、實(shí)驗(yàn)步驟：將葡聚糖凝膠SephadexG-75溶脹洗滌數(shù)次。緩慢攪拌，加入0.05MNaIO4溶液50ml，攪拌30min。蒸餾水洗滌數(shù)次，抽干備用。將二中制備的雞卵黏蛋白，加入（3）中活化的葡聚糖凝膠。加入5%K2CO3后，調(diào)PH至7.5-9.0，緩慢攪拌2h。將0,27gKBH4溶于20ml水，緩慢攪拌并加入(5)中再靜置過(guò)夜備用。（7）將層析柱洗凈，并確保在下出水口處沒(méi)有氣泡存留且可以正常出水，將靜置后的(6)溶液輕輕倒入層析柱中，勻速添加防止出現(xiàn)多個(gè)柱面，直到柱面到達(dá)8cm左右時(shí)停止。（8）裝好的層析柱上端連接恒流泵，下端用一燒杯承液，恒流泵首先連接緩沖液，利用緩沖液將層析柱中的溶液置換出來(lái)，約5分鐘后開(kāi)始用PH試紙檢測(cè)下出水口流出液體PH值，直到流出液PH與緩沖液PH相同時(shí)停止。（9）將一中透析后的溶液裝離心瓶離心后，取上清液緩慢加入灌好的層析柱中（10）上樣結(jié)束后恒流泵上端接PH7.5緩沖液洗雜蛋白，用試管接雜蛋白樣，每管5ml，共取樣6管，編號(hào)1-6，總體積30ml。（11）6管雜蛋白洗脫完成后恒流泵上端接PH2.5緩沖液解吸附，洗脫胰蛋白酶，用試管承接濾液，每管5ml，共采樣15管。五、結(jié)果及分析（1）考馬斯亮藍(lán)OD595值：試管編號(hào)1234567891011OD值0.5720.4060.5100.3840.1820.0440.1600.2310.2820.3060.367試管編號(hào)12131415161718192021OD值0.1750.1610.1440.0620.0560.0420,0300.01800結(jié)果分析：圖2-1胰蛋白酶親和層析考馬斯亮藍(lán)粗蛋白含量折線圖豬胰蛋白親和層析結(jié)果如圖2-1所示，圖折線為加入考馬斯亮藍(lán)后的OD595值，為其中蛋白含量，所有值均小于0.8，不需要稀釋后再測(cè)定。從圖中可知有共有3個(gè)蛋白峰，分布為1號(hào)試管，3號(hào)試管和11號(hào)試管，其中1號(hào)試管與3號(hào)試管是用PH7.5緩沖液進(jìn)行洗滌的，此時(shí)胰蛋白酶與固定相以共價(jià)鍵結(jié)合，不會(huì)洗脫，股此時(shí)試管中應(yīng)為雜蛋白，曲線整體為下降趨勢(shì)，于6號(hào)試管處有雜蛋白最低值，此時(shí)OD595值為0.044，可近似認(rèn)為雜蛋白已經(jīng)被洗脫。7-21號(hào)試管是用PH2.5解吸附后收集的，其內(nèi)主要蛋白質(zhì)來(lái)源是之前被固定相吸附的胰蛋白酶，由于之前雜蛋白洗脫程度良好，可認(rèn)為其中幾乎沒(méi)有雜蛋白，故11號(hào)試管為胰蛋白酶蛋白峰，峰值為0.367，之后一直下降，于20號(hào)試管處OD值為0，認(rèn)為所有胰蛋白酶全部洗脫，總洗脫體積為65ml。因?yàn)橐鹊鞍酌竵?lái)源是豬胰臟，故其為未激活胰蛋白酶，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未進(jìn)行激活步驟，故無(wú)法確定其中的酶活性，也無(wú)法分析純化倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)七SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及蛋白質(zhì)純度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.對(duì)多酚氧化酶的純度進(jìn)行鑒定以及進(jìn)行分子量的測(cè)定。2.通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)掌握SDS測(cè)定蛋白質(zhì)純度以及分子量的鑒定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。如果在聚丙烯酰胺加入去污劑SDS，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的蛋白質(zhì)能與SDS按一定比例結(jié)合，使各種蛋白質(zhì)的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物帶上相同密度的負(fù)電荷，它的電量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的，因而消除了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與所帶電荷無(wú)關(guān)，在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量的對(duì)數(shù)與電泳遷移率間呈負(fù)相關(guān)。三、儀器與試劑：1、實(shí)驗(yàn)一中多酚氧化酶粗酶、透析后、離子交換柱純化后、分子篩純化后樣本，實(shí)驗(yàn)二中胰酶粗酶、透析后、親和層析樣本，實(shí)驗(yàn)三中DNA、質(zhì)粒、λDNA樣本。2、丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr（Acr/Bis），10％的SDS溶液，10％的過(guò)硫酸銨溶液，四甲基乙二胺（TEMED），1.5MTris,PH8.8，1.0MTris,PH6.8，10×30gTris,125g甘氨酸和5gSDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3，0.2MTris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巰基乙醇及溴酚蘭，0.15％考馬斯亮藍(lán)R250，溶于脫色液，50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。3、電泳儀，垂直電泳槽，微量移液器四、實(shí)驗(yàn)步驟1、用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏膠），垂直放置。2、將配制好的分離膠溶液，倒入，滴加入無(wú)離子水，待凝膠聚集后，倒出無(wú)離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。3、分別向樣品離心管中，按1/1-1/5比例加入5×樣品緩沖液，再沸水浴中加熱3－5min，取出待用。4、用微量注射器分別吸20ul不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和試驗(yàn)樣品注入樣品槽。5、點(diǎn)樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流到10mA（2－3mA/em），保持電流穩(wěn)定不變，進(jìn)行電泳。6、當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到離分離膠底1－2cm時(shí)，停止電泳。7、電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37℃溫箱中保溫過(guò)夜。8、倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。實(shí)驗(yàn)八western-blotting一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)的情況。2.通過(guò)本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)掌握western-blotting鑒定蛋白表達(dá)情況的原理、操作及結(jié)果分析。二、實(shí)驗(yàn)原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。三、儀器與試劑：試劑：勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml；轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml；0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml；膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中；顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H2021.0μl。儀器：燒杯，硝酸纖維薄膜，四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）SDS實(shí)驗(yàn)見(jiàn)之前的。（二）電轉(zhuǎn)1.剪6塊3mm濾紙和一塊NC膜。2.將剪好的3mm濾紙和一塊NC膜在轉(zhuǎn)移液中浸泡3-5min。3.按下列過(guò)程安裝轉(zhuǎn)移裝置，將塑料支架平放在含轉(zhuǎn)移緩沖液的托盤(pán)中，在塑料支架上放一塊海綿。4.將3塊3mm濾紙對(duì)齊放在海綿上，然后依次將NC膜、凝膠、及另3塊濾紙和海綿放上。5.用塑料支架夾盡上述各層，放入電轉(zhuǎn)槽中，NC膜一側(cè)向正極。6.接通電源電壓40V，電流0.17-0.2A，轉(zhuǎn)移1.5-6小時(shí)。7.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出塑料支架，依次取掉各層，用鉛筆在膜的上沿做好標(biāo)記，切下其中一個(gè)孔對(duì)應(yīng)的膜的一半，用氨基黑或考馬斯亮藍(lán)染色，檢查轉(zhuǎn)移效果。8.將其余的NC膜放在一張干凈的3mm濾紙上，室溫干燥30-60min。9.NC膜的封閉：將經(jīng)電轉(zhuǎn)并干燥的NC膜放于一瓶皿上，加入封閉液室溫下輕輕搖蕩2-3小時(shí)。10.將第一抗體用封閉液稀釋?zhuān)♂尪扔深A(yù)實(shí)驗(yàn)確定。11.將B中封閉好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量為0.1ml一抗/cm2NC膜，趕盡塑料袋內(nèi)所有氣泡，封口機(jī)封口，4℃下輕輕震蕩2小時(shí)。12.洗膜：反應(yīng)結(jié)束，將塑料袋剪開(kāi)，棄去廢液，用PBS洗三次，每次10min，將膜從PBS溶液中轉(zhuǎn)至150mMNaCl,50mMTris-HCl(pH=7.5)溶液中室溫下輕輕震蕩10分鐘。13.將二抗用二抗封閉液稀釋?zhuān)♂尪葹?:200-1:2000。將膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般為0.1ml二抗溶液/cm2NC膜，封閉塑料袋，14.剪開(kāi)塑料袋，取出NC膜，在150mMNaCl,50mMTris-HCl(pH=7.5)溶液中沖洗1-5次，每次10分鐘。15.將膜放入顯色液中，室溫下輕輕搖動(dòng)。16.帶條帶出現(xiàn)后（約顯色1-3分鐘），立刻用水洗膜，然后用TE終止。實(shí)驗(yàn)九酶聯(lián)免疫分析技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)操作鑒定胰酶并確定其濃度，掌握ELISA實(shí)驗(yàn)操作步驟和基本原理。二、實(shí)驗(yàn)原理1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmannn,荷蘭學(xué)者Van

Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))。其基本原理與RIA相同。先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。最初發(fā)展的免疫酶測(cè)定方法。是使酶與抗體或抗原結(jié)合，用以檢查組織中相應(yīng)的抗原或抗體的存在。后來(lái)發(fā)展為將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果。這種技術(shù)就是目前應(yīng)用最廣的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，俗稱(chēng)ELISA(enzymelinked

immunosorbant

assay)。

眾所周知,

酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可導(dǎo)致大量的催化過(guò)程，所以極為敏感。免疫酶技術(shù)就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體成抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無(wú)色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡相電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)加以測(cè)定。呈色反應(yīng)顯示了酶的存在，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。所以，這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種固相免疫測(cè)定技術(shù)，其先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，后加入酶標(biāo)抗體與免疫復(fù)合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進(jìn)行定性或定量分析的方法。根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟不同，有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法三種類(lèi)型的常用方法。三、儀器與試劑：1、實(shí)驗(yàn)二親和層析純化后胰酶樣品。2、胰酶抗體，AP標(biāo)記二抗，包被液PH9.6碳酸鹽包被緩沖液:3.03gNa2CO3,6.0gNaHCO3,溶解于900ml雙蒸水中，檢測(cè)并調(diào)整pH至9.6，定容至1L；PBS：1.16gNa2HPO4,0.1gKCl,0.1gK3PO4,4.0gNaCl，溶于500mL蒸餾水中，調(diào)整pH至7.4；封閉液：溶于PBS的1%BSA，血清，脫脂牛奶，酪蛋白或明膠等。洗滌液：PBS或是TBST（Tris-HCl,pH7.4+0.05%

吐溫20）；抗體或抗原稀釋液：1×封閉液；終止液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)可采用不同的終止液。3、酶標(biāo)板、微量加樣器、帶蓋搪瓷盤(pán)、37℃培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、小試管等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、采用十字交叉連續(xù)稀釋分析法確定抗原濃度，抗原濃度一般為0.2to10μg/ml，最好不要超過(guò)20μg/ml。2、將50μl用碳酸鹽包被緩沖液稀釋的抗原加入96孔酶標(biāo)板中，用塑料膜板將孔板覆蓋后置于室溫2小時(shí)或4度過(guò)夜。3、棄去包被液用洗滌液洗滌3次，輕拍孔板使洗滌液甩干。4、每孔中加入200μl封閉液（1%BSA或5%脫脂牛奶等），蓋上膜板，室溫封閉至少2小時(shí)或4度過(guò)夜。5、封閉后用PBS洗滌兩次?？贵w孵育6、每孔加入稀釋好的抗體100μl，室溫孵育2小時(shí)或4度過(guò)夜。7、孵育后用洗滌液洗滌四次。8、每孔加入100μl的底物溶液，待顯色充分后加入100μl的終止液并在酶標(biāo)儀上測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)吸光度值。實(shí)驗(yàn)十染色體DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握提取染色體DNA的原理及方法，并為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此DNA提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本談不上進(jìn)行分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)裂解液裂解細(xì)胞，有機(jī)溶劑反復(fù)抽提。使DNA進(jìn)入水相與擔(dān)保成分分開(kāi)，在RNase作用下，降解RNA以純化DNA。三、儀器與試劑：1.材料：大腸桿菌2.試劑：細(xì)胞裂解液（100mMTris-HCL、5mMEDTA、500mMNaCl、1.25%SDS、PH7.5）；飽和酚；氯仿；70%酒精四、實(shí)驗(yàn)步驟1、取培養(yǎng)菌液加入10ml裂解液，加入1ml酚，等體積氯仿，在65℃下水浴半小時(shí)。2、水浴后12000r/min離心15min，取上清液。3、在上清中加入等體積氯仿，輕輕搖動(dòng)，在此12000r/min離心15min，取上清液。4、在上清液中加入2體積無(wú)水乙醇（-20℃）與0.1體積3M乙酸鈉（PH5.2），室溫下靜置10min。5、12000r/min離心15min，取沉淀。6、用70%乙醇洗三次沉淀，之后12000r/min離心10min。7、將沉淀真空干燥后，復(fù)溶于2ml去離子水水中。8、加RNaes搖勻后，在65℃中水浴30min。9、加等體積酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000r/min離心15min。10、取上清液，加入無(wú)水乙醇，3M乙酸鈉（PH5.2），12000r/min離心15min。11、去沉淀，重復(fù)（6）步后干燥復(fù)溶-20℃保存。五、結(jié)果及分析分析：DNA提取物電泳結(jié)果如圖3-1所示，可以清晰看到呈梯狀的明顯亮帶，上樣口物干凈，整體條帶清晰，說(shuō)明蛋白質(zhì)去除干凈，無(wú)雜質(zhì)殘留，DNA提取效果良好，可用作下一步實(shí)驗(yàn)原料使用。實(shí)驗(yàn)十一質(zhì)粒DNA的提取與純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌質(zhì)粒提取原理和方法，為之后實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備材料二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌質(zhì)粒多為一些雙聯(lián)、環(huán)狀的DNA分子，其大小范圍從1KB-200以上KB不等，他們是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒的存在能賦予菌體一些特殊的表型，這些表型主要有對(duì)抗生素的抗性、修飾酶等。由于有些質(zhì)粒與DNA分子量較小特別是與自身遺傳有關(guān)的DNA分子績(jī)效，可攜帶外援基因量較大，且轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、拷貝數(shù)高（松弛型質(zhì)粒）、還帶有選擇性標(biāo)記，因此質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)最主要的DNA載體。質(zhì)粒DNA的提取可以說(shuō)是以不同的方法，但基本步驟多為散步，第一細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增，第二細(xì)菌菌體的裂解，第三質(zhì)粒DNA的純化。菌體裂解方法不同，決定了質(zhì)粒DNA提取方法的差異，目前菌體裂解方法主要是煮沸法，SDS法，堿解法，Triton-溶菌酶法等。質(zhì)粒DNA的純化方法主要是梯度離心法，柱層析法等，但由于目前所用質(zhì)粒復(fù)制量極大，小量常規(guī)制備的質(zhì)粒既可以滿(mǎn)足內(nèi)切酶圖的繪制、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、特定DNA片段分離、常規(guī)亞克隆及探針等方面的工作需要，因此在實(shí)際工作中，除非有極特殊的要求，很少有人進(jìn)行質(zhì)粒DNA的梯度離心及柱層析純化。三、儀器與試劑：（1）培養(yǎng)用大腸桿菌菌體（2）超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、搖床、高速冷凍離心機(jī)、超級(jí)恒溫器或恒溫水浴、臺(tái)式離心機(jī)、取儀器一套、低溫冰箱或冰柜、冷凍真空干燥器、電泳儀、水平電泳槽。（3）SolutionI（50nM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0，10mMEDTAPH=8.0,高壓滅菌，4℃保存）、SolutionII（0.2MNaOH，1%SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用）、SolutionIII（5NKACPH4.8高壓滅菌，4℃保存）、3MNaACPH5.2高壓滅菌，4℃保存、氨芐青霉素25mg/ml、溶菌酶8mg/ml、氯仿/酚、異丙醇、四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、20ml培養(yǎng)菌體37℃20rpm過(guò)夜。2、取出菌液后4℃，5000r/min離心10min。3、取沉淀用預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，4℃，5000r/min離心10min。4、取沉淀加入1mlSolutionI，冰浴10min。5、重新懸浮，加入150ul溶菌酶木業(yè)，室溫5min。6、加入1.2mlSolutionII，冰浴5min。7、加入0、9ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，4℃，12000r/min，離心10min。8、取上清液，加入1.5ml異丙醇，-20攝氏度，冷藏15min。9、4℃，12000r/min，離心10min。10、取沉淀懸于200ulTE緩沖液中，加入40ul，3MNaAC。11、酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后4℃，12000r/min，離心10min。去沉淀后冷凍干燥，再懸浮于50ulTE中備用。五、結(jié)果及分析分析：質(zhì)粒提取結(jié)果如圖3-2所示，其中同一泳道內(nèi)的三個(gè)條帶分層明顯，符合質(zhì)粒的電泳圖，造成這一現(xiàn)象，是因?yàn)橘|(zhì)粒的三種不懂構(gòu)象導(dǎo)致的電場(chǎng)中的遷移速度有差異，最終遷移距離發(fā)生變化，圖3-2中條帶清晰，無(wú)雜帶，說(shuō)明質(zhì)粒DNA提取效果良好，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用作下一步實(shí)驗(yàn)使用。實(shí)驗(yàn)十二酶切技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)EcoRI，HindIII兩種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)λDNA的單酶切、雙酶切及部分酶切的操作，掌握內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)原理及步驟，為之后實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。二、實(shí)驗(yàn)原理限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類(lèi):Ⅰ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴(lài)于ATP的存在。Ⅰ類(lèi)酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類(lèi)酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。Ⅱ類(lèi)由兩種酶組成:一種為限制性?xún)?nèi)切核酸酶(限制酶)，它切割某一特異的核苷酸序列；另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。Ⅱ類(lèi)中的限制性?xún)?nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類(lèi)限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱(chēng)特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類(lèi)酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中,有的在對(duì)稱(chēng)軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱(chēng)軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱(chēng)粘性未端，如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'

3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'

DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性?xún)?nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性?xún)?nèi)切酶的活性。大部分限制性?xún)?nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性?xún)?nèi)切酶貯存液中時(shí)，會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性?xún)?nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性?xún)?nèi)切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性?xún)?nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性?xún)?nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc和2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜又稱(chēng)DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無(wú)性繁殖、基因文庫(kù)的構(gòu)建等工作中，建立限制性?xún)?nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。

構(gòu)建DNA限制性?xún)?nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性?xún)?nèi)切酶，通過(guò)綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來(lái)確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴(lài)于它的準(zhǔn)確性和精確程度。

在酶切