反相液相色譜法測定性疾病食品中多種磺胺類藥物殘留

反相液相色譜法測定性疾病食品中多種磺胺類藥物殘留

磺胺類藥物是氨基苯磺胺（sn）的衍生物，是肉類中常見的抗炎藥物。隨著某些磺胺類藥物毒副作用的突出和人們安全意識的提高，所有國家都對磺胺類藥物的上市有嚴(yán)格的要求。例如，聯(lián)合國藥物管理局、歐盟、日本和中國的許多國家要求動物產(chǎn)品中磺胺類藥物的總量和氨基丙烯酸磺酸鹽的單一藥物含量不得超過0.1mg。因此，我們必須監(jiān)控動物、家禽和其他野生動物產(chǎn)品中磺胺類殘留，特別是磺酰胺（sd）、磺酰胺酰胺（sm2）、磺酰胺對甲氧吡啶（smr）和磺胺類藥物的快速檢測方法。多種磺胺類藥物殘留的液相色譜分析大都采用梯度洗脫,樣品用固相萃取柱凈化。本實(shí)驗(yàn)采用簡單的液-液萃取、等度洗脫方式對磺胺(SN)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMR)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺喹惡啉(SQX)等六種磺胺類藥物殘留進(jìn)行分析。1材料和方法1.1檢測儀器和色譜核心設(shè)備美國Waters高效液相色譜系統(tǒng),包括1525泵、2487紫外雙波長檢測器、7725i手動進(jìn)樣器和Empower色譜工作站。磷酸、正丙醇、無水硫酸鈉均為分析純;乙腈、正己烷均為色譜純。1.2流動相、流速:乙腈-0.2%h3po4流動相,流動相1.色譜柱:KromasilC18柱(250×4.6mm,5μm);流動相:乙腈-0.02%H3PO4(體積比28:72),波長:268nm,流速:1.0ml/min,樣量:20μl。以保留時間定性,峰面積定量。1.3smr、酰胺氯咯嗪、酰胺羥基惡啉sqx、白砂糖的制備磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液:稱取磺胺(SN)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMR)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺喹惡啉(SQX)標(biāo)準(zhǔn)品(購自美國Sigma公司,純度不小于99%)各(5.0±0.7)mg,分別置于六個25ml棕色容量瓶中,用甲醇超聲溶解,并定容至刻度,混勻,4℃避光存放。配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,按1.3進(jìn)行測定,結(jié)果見表1,混合對照品色譜圖見圖1。1.4提取乙腈提取液分別稱取2.5g勻漿試樣,置于兩個10ml離心管中,各加入8ml乙腈和5g無水硫酸鈉,均質(zhì)后以3000r/min離心5min,將上清液(乙腈層)移入分液漏斗中,離心后的沉淀物加入8ml乙腈搖勻,超聲波提取30s,于3000r/min離心5min,合并乙腈提取液。在乙腈提取液中加入16ml乙腈飽和正己烷溶液,振搖5min,將底層乙腈液移入梨形瓶中,加入10ml正丙醇,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干,用氮?dú)獯蹈伞Ｔ跉埩粑镏屑尤?.0ml乙腈-水溶液(1+1)超聲30s溶解殘渣,將溶解液移入10ml離心管中,加0.5ml乙腈飽和正己烷溶液,以3000r/min離心5min,棄去正己烷層,將底層乙腈水溶液用0.45μm微孔濾膜過濾,收集濾液作為試樣溶液,供高效液相色譜法測定,豬肝樣品色譜圖見圖2。2結(jié)果與分析2.1色譜條件選擇分別考察了乙腈-磷酸緩沖鹽、乙腈-水及乙腈-磷酸溶液對六種磺胺的分離效果:以乙腈-磷酸溶液體系效果最佳,因?yàn)橐译?水中加入的磷酸可有效抑制色譜峰拖尾。當(dāng)磷酸濃度為0.02%且乙腈-0.02%磷酸溶比例為28:72時,各組分較好地分離,并且等度洗脫可保證各組分保留時間完全重現(xiàn),有利于樣品分析。2.2精密度實(shí)驗(yàn)選取一種濃度的混和標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)樣20μl,重復(fù)進(jìn)樣6次,得出六種磺胺的峰面積,其RSD在1.1%～2.7%之間。2.3主體市場中胺氧化酶含量檢測結(jié)果同時稱取六份豬肝樣品,參照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定,結(jié)果磺胺含量(mg/kg)為:1.16、1.23、1.26、1.24、1.19、1.30,平均結(jié)果為1.23mg/kg,RSD為4.05%;磺胺嘧啶含量(mg/kg)為:1.75、1.77、1.81、1.91、1.71、1.79,平均結(jié)果為1.79mg/kg,RSD為3.80%;磺胺二甲嘧啶等其余四種沒有檢出。2.4重建和回收率實(shí)驗(yàn)對豬肝樣品加入高中低濃度的混合對照品,回收率結(jié)果及RSD值見表2。2.5方法二波長面積比如樣品檢測出陽性,可改變流動相比例進(jìn)一步證實(shí),比較樣品色譜峰保留時間是否和標(biāo)準(zhǔn)色譜峰一樣改變,也可利用儀器的雙波長檢測的功能,設(shè)置第二波段,比較樣品及標(biāo)準(zhǔn)在兩個波長下的面積比是否一致。如有二極管陣列檢測器,可借助于三維圖譜及多波長同時檢測進(jìn)行確認(rèn)。2.6乙腈系磺胺類磺胺類藥物一般采用二氯甲烷進(jìn)行提取,但二氯甲烷有可能提取出類脂物,濃縮后不容易脫脂。乙腈是提取磺胺的合適溶劑,它在沉淀樣品中蛋白質(zhì)方面優(yōu)于甲醇等,故本法采用乙腈將樣品中的磺胺類提取出來,再用乙腈飽和的正已烷除去脂溶性雜質(zhì),以脫去脂肪,減少雜質(zhì)的干擾。加入正丙醇的目的是加快蒸餾的速度,并且能夠減少藥物的損失,提高回收率。最后將乙腈層減壓濃縮至干用1:1乙腈-水溶解,再用乙腈飽和的正已烷萃取脫脂一次后,直接上機(jī),無需過固相萃取柱,大大簡化了實(shí)