新片對(duì)血瘀作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

新片對(duì)血瘀作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

新縣片由廈門中藥廠有限公司生產(chǎn)，主要由腫脹風(fēng)、三七、大黃和珍珠膏等藥物組成，占2.11%。臨床應(yīng)用主要是清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛等。其中藥成分腫節(jié)風(fēng)有清熱祛風(fēng)、活血化瘀功能,三七中的三七皂苷亦有活血化瘀、改善微循環(huán)的作用。本實(shí)驗(yàn)主要是通過建立大鼠血栓、血瘀、血小板聚集模型及利用基因芯片來探討新癀片的活血化瘀機(jī)制。1材料和方法1.1u3000試劑新癀片:淡棕灰色的片,氣香、微腥,味苦,含吲哚美辛2.11%,批號(hào):111004;吲哚美辛:白色粉末,批號(hào):101206;均由廈門中藥廠有限公司提供。復(fù)方丹參滴丸,天津天士力制藥股份有限公司,批號(hào):111111。1.2scxk-4001SD大鼠,SPF級(jí),體重180~200g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(京)2007-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)在天津市新藥安全評(píng)價(jià)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)[合格證:SYXK(津)2011-0005],食用鼠專用料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)),飲用純凈水。1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備BT87-3型實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)血栓形成儀。LG-R-80C型血液黏度儀,由北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1灌胃給予同體積去離子水60只SD大鼠,雌雄各半。按照體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、新癀片(高、中、低)組、吲哚美辛組、復(fù)方丹參滴丸組,每組10只。每日灌胃給藥1次,連續(xù)給藥9d,對(duì)照組灌胃給予同體積去離子水。末次給藥后40min,腹腔注射45mg/kg戊巴比妥納麻醉動(dòng)物,大鼠仰臥位固定,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈。將血栓形成儀的刺激電極置于頸總動(dòng)脈近心端,溫度探頭置于遠(yuǎn)心端,刺激電流強(qiáng)度為2mA。刺激5min后,關(guān)閉刺激電極,3min后,調(diào)節(jié)溫控表至零位,記錄從刺激開始至動(dòng)脈溫度驟降所需的時(shí)間(s),即動(dòng)脈血栓形成時(shí)間。1.4.2造模和給藥,血樣采集70只SD大鼠,雌雄各半。按照體重隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、新癀片(高、中、低)組、吲哚美辛組、復(fù)方丹參滴丸組,每組10只。每日灌胃給藥1次,連續(xù)給藥10d。對(duì)照組及模型組灌胃給予同體積去離子水。末次給藥后1h,除對(duì)照組外,其余各組大鼠尾靜脈注射10%高分子右旋糖苷(HMWD)溶液0.3mL/100g。20min后,1%戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物,于造模后30min腹主動(dòng)脈取血約4mL加入加有抗凝劑肝素鈉的真空采血管中,混勻。取0.8mL全血,置入血液黏度儀中,測(cè)定切速為200s-1、30s-1、5s-1、1s-1時(shí)的黏度,將余下全血于離心機(jī)3000r/min離心10min,取0.8mL血漿,測(cè)定血漿黏度。1.4.3血小板固血液普通血選用60只SD大鼠,雌雄各半。分組及給藥劑量同“1.4.1”,連續(xù)給藥8d。末次給藥后40min,1%戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物,腹主動(dòng)脈取血約4mL加入真空采血管中(普通管),迅速加入新鮮配制的3.8%枸櫞酸那0.45mL混勻(血∶抗凝劑=9∶1)。于離心機(jī)800r/min離心10min,分離富血小板血漿;3600r/min離心10min,分離貧血小板血漿,作為儀器空白對(duì)照。取富血小板血漿250μL加入聚集管中,用血小板聚集儀測(cè)定加入10μL1mg/mL的ADP后的血小板聚集率。1.4.4灌胃給予同體積去離子水選用SD種大鼠60只,全雄,體質(zhì)量180~210g。按照體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、新癀片組(180mg/kg)、吲哚美辛組(3.8mg/kg)。每日灌胃給藥1次,連續(xù)給藥2周。對(duì)照組灌胃給予同體積去離子水。末次給藥后40min,1%戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物,每組取肝組織3份液氮保存,進(jìn)行基因表達(dá)芯片檢測(cè)。1.5ssr數(shù)據(jù)處理基因表達(dá)芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)采用dChip(Dec.2009version)分析軟件LowerBoundFoldChange方法分析表達(dá)差異1.5倍以上基因,其余所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均以(ue0af±s)表示,采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1新片對(duì)血栓形成的作用與對(duì)照組比較,新癀片高、低劑量組能顯著延長(zhǎng)大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間,中劑量雖然由于標(biāo)準(zhǔn)差大,統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異,但延長(zhǎng)體內(nèi)血栓形成時(shí)間達(dá)43.1%,結(jié)果表明新癀片能顯著抑制血栓形成,有顯著的活血化瘀作用,其抑制血栓形成的作用與陽性藥復(fù)方丹參滴丸相當(dāng)。陽性藥吲哚美辛在此劑量下不能顯著延長(zhǎng)大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間。見表1。2.2大鼠血漿黏度及全血黏度的變化與對(duì)照組比較,模型組血漿黏度及全血黏度顯著升高,表明造模成功。新癀片各劑量組均能顯著降低大鼠血漿黏度及全血黏度,有顯著的活血化瘀作用,其降低血黏度的作用與復(fù)方丹參滴丸相當(dāng),強(qiáng)于吲哚美辛。見表2、3。2.3血小板聚集試驗(yàn)與對(duì)照組比較,新癀片高、中、低劑量均能顯著減少大鼠血小板聚集率,顯著抑制ADP引起的血小板聚集,陽性藥復(fù)方丹參滴丸及吲哚美辛也能顯著減少大鼠血小板聚集率。與吲哚美辛組比較,新癀片高、中劑量組均有顯著性差異。新癀片抑制血小板聚集的作用與復(fù)方丹參滴丸比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。2.4減少肝組織內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)與對(duì)照組比較,新癀片及吲哚美辛能顯著減少肝組織內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶樣1蛋白、纖維蛋白原β鏈、凝固因子Ⅲ、A型內(nèi)皮素受體、血小板活化因子受體的基因表達(dá)。見表5。3內(nèi)皮素受體基因表達(dá)以直流電直接刺激血管,可致粗糙的血管內(nèi)膜損傷,暴露膠原組織,同時(shí)激活內(nèi)源性凝血系統(tǒng),且可釋放組織凝血活素激活外源性凝血系統(tǒng),形成血栓。靜脈注射高分子右旋糖酐能被紅細(xì)胞吸附,從而在紅細(xì)胞之間起著橋梁作用,導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集,出現(xiàn)微循環(huán)障礙。另刺激血小板引起血小板聚集,亦可促進(jìn)血管內(nèi)的凝血與血栓的形成。試驗(yàn)結(jié)果顯示,新癀片能顯著延長(zhǎng)大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間,顯著減少血瘀模型大鼠全血黏度及血漿黏度,顯著抑制ADP引起的血小板聚集。血小板活化因子(PAF)通過與靶細(xì)胞膜上的PAF受體結(jié)合而引起血小板聚集,中性粒細(xì)胞的聚集和釋放,產(chǎn)生大量的活性氧、白三烯等炎性介質(zhì)。結(jié)果顯示,新癀片能減少PAF受體的基因表達(dá),阻止了PAF與受體的結(jié)合。內(nèi)皮素(ET)是迄今所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管物質(zhì),有三種異構(gòu)肽:ET-1、ET-2及ET-3,其中ET-1對(duì)血管平滑肌的作用最強(qiáng),是ET家族中最活躍的肽,參與多種疾病的病理過程。內(nèi)皮素受體(ETR)有兩種亞型ETAR和ETBR。ETAR是引起血管平滑肌收縮的主要受體,研究表明,ETAR對(duì)人血管收縮的貢獻(xiàn)比ETBR大兩個(gè)數(shù)量級(jí),因次內(nèi)皮素是引起人血管收縮主要是由ETAR介導(dǎo)的。纖維蛋白原(Fg)是由肝臟合成的一種具有凝血功能的急性期反應(yīng)蛋白,可以作為凝血因子直接參與凝血,也可以與血小板膜糖蛋白結(jié)合,激活血小板,促使血小板聚集,從而加速血栓形成。Fg由α鏈、β鏈、Y鏈組成,其中β鏈的合成被認(rèn)為是Fg合成的限速步驟,與Fg表達(dá)密切的相關(guān)基因都位于β鏈的上游起動(dòng)子區(qū)域,如β-148C/T、β-455G/A等。研究表明,當(dāng)β-455位于A點(diǎn)時(shí),β鏈的轉(zhuǎn)錄增加了1.2~1.5倍,從而加速了Fg的表達(dá),進(jìn)而可能影響血栓的形成。結(jié)果表明新癀片能顯著減少內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶樣1蛋白、內(nèi)皮素A型受體、纖維蛋白原β鏈的表達(dá)。因此新癀片的活血化瘀作用主要是通過減少血小板活化因子受體、凝固因子Ⅲ的基因表達(dá)