遺傳咨詢師課件-遺傳標記檢測方法及連鎖分析-王磊

王磊復旦大學生物醫(yī)學研究院復旦大學現(xiàn)代人類學教育部重點實驗室wangleiwanglei@遺傳標記檢測方法及遺傳分析真實臨床案例1：一對河南夫婦連續(xù)兩次懷孕生下全身骨質松軟的胎兒后，來醫(yī)院就診，詢問提前干預方法(取自

2015.1.15號復旦附屬紅房子醫(yī)院內分泌門診)真實臨床案例2：一對連云港夫婦連續(xù)三次生下表現(xiàn)為吞咽困難的嬰兒，幾個小時候嬰兒死亡。第四次發(fā)現(xiàn)懷孕，就診詢問醫(yī)生胎兒情況

(取自2014.12月底復旦附屬紅房子醫(yī)院集愛中心)他們該怎么辦？遺傳咨詢分會成立的背景中國遺傳學會遺傳咨詢分會成立的背景出生缺陷全國約1600萬出生缺陷兒，發(fā)生率達5.6%世界性的嚴重公共衛(wèi)生和社會問題如何降低出生缺陷率？不孕不育全國不孕不育，發(fā)生率達12.5-15%不孕不育患者人數(shù)超過5000萬輔助生殖(IVF)一次成功率只有30%左右中國遺傳學會遺傳咨詢分會成立的背景如何篩選出“優(yōu)質”胚胎？惡性腫瘤我國腫瘤發(fā)生率約6.4%全國每年新發(fā)腫瘤約312萬，每分鐘有6人被診斷惡性腫瘤中國遺傳學會遺傳咨詢分會成立的背景如何有效預知并預防腫瘤？中國遺傳學會遺傳咨詢分會成立2015.2.9日遺傳咨詢分會成立的背景遺傳咨詢：是聯(lián)合人類基因組技術，人類遺傳學，為病人開展遺傳咨詢、基因診斷、遺傳病治療等相關醫(yī)學服務。遺傳咨詢必不可少！如何尋找疾病的基因？單基因遺傳病及致病基因的克隆有雀斑vs

無雀斑直發(fā)

vs

卷發(fā)左撇子13侏儒癥掌跖角化香港時尚模特女孩Chiu(白化病)短指癥Waardenburg神經(jīng)纖維瘤病人類的多指畸形癥史蒂芬·威廉·霍金肌萎縮性側索硬化癥英國維多利亞女王及其家族血友病魚鱗病單基因疾病(如鐮狀紅細胞貧血)主要發(fā)生在新生兒和幼兒階段多基因疾病(如精神分裂癥)主要發(fā)生在成人時期遺傳病是多種疾病和死亡的重要原因單基因疾病是指那些由于單個基因的突變而引起的遺傳病由于單基因病發(fā)生基本上受一對等位基因的控制，其遺傳方式符合孟德爾定律，因此又稱為孟德爾遺傳病顯性遺傳隱形遺傳Online

Mendelian

inheritance

in

Man常染色體顯性遺傳常染色體隱性遺傳x連鎖顯性X-連鎖遺傳Y染色體遺傳單基因疾病(孟德爾遺傳病)遺傳方式：2.性染色體遺傳1.常染色體遺傳X連鎖隱性常染色體顯性遺傳：致病基因在雜合狀態(tài)下即可致病患者的雙親中，有一個患者，患者的同胞中，有1/2的可能性為患者無病患個體的后代不會患此病在系譜中，疾病連續(xù)相傳，無間斷現(xiàn)象常染色體隱形遺傳：致病基因只有在純合狀態(tài)下才致病患者的雙親表型正常，但均為攜帶者， 患者的同胞對中有1/4的可能性為患者

在系譜中，患者的分布是散在的，通?？床坏竭B續(xù)傳遞的現(xiàn)象連鎖顯性遺傳女性患者的子女有1/2可能發(fā)病，男性患者的所有女性后代均發(fā)病，男性患者的男性后代均不發(fā)病在系譜中，疾病連續(xù)傳遞，無間斷現(xiàn)象

X-連鎖隱性遺傳往往只見到男性患者女性患者的父親亦為患者，母親為攜帶者Each

puzzle

piece

would

represent

a

set

of

genes

organizedin

a

specific

way,

similar

to

a

chromosome.One

way

to

think

about

genesThe

information

carried

in

genes

differs

slightly

from

person

to

persoThis

is

what

makes

each

of

us

unique.

As

a

result,

the

colors

of

thepuzzle

pieces

would

be

different

between

family

members.

The

childreceives

exactly

half

of

its

genetic

information

from

the

mother

andexactly

half

from

the

father.Finding

a

Gene

ontheChromosome

MapMother’s

geneFather’s

geneChild’s

geneGenetic

disorder

runs

in

families8

9

10

11

12Find

the

puzzle

piece

that

is

responsible

for

Disorder3246571Gene

cause

diseaseCollins

FS.

(1992)

Nature

genetics

1:3-6苯丙酮尿癥(PKU)：使得苯丙氨酸及苯丙酮酸積蓄并從尿中大量排出，臨床伴有智力低下，色素減少等。發(fā)病率1/16500STR

SNP等遺傳標記

，獲定位克?。和ㄟ^RFLP

、、取基因在染色體上的位置信息，然后采用各種方法克隆基因。先定位、后克隆、 不依賴于現(xiàn)有研究基礎基因定位方法家系連鎖分析法隨著人類基因組圖譜已經(jīng)繪制完成，物理定位法已被查找基因組圖譜所取代。但對許多尚未被克隆的致病基因而言，因基因序列未知，其在染色體上無從查找，家系分析成為最基本的定位方法。全外顯子測序法隨著全基因組測序技術的深入發(fā)展，全外顯子測序方法尋找致病基

因扮演著越來越重要的角色。家系連鎖分析法基本理論準備獨立遺傳independent

assortment完全連鎖complete

linkage交換重組重組型配子重組型配子親本型配子親本型配子基因在每條染色體內是直線排列的,染色體可以自由組合，而排在一條染色體上的基因是不能自由組合的。這種特點稱為基因的“連鎖”兩個基因間的重組率與它們的距離有關，相距越近重組率越小，重組率為1%時的遺傳距離為1cM，約相當于100萬bp。兩個基因間的重組率也是相對恒定的，重組率的大小反映基因座在染色體上相對距離。重組值可以通過新組合在整個后代中的比例來推算。重組率介于0-50%之間，但在遺傳圖上可以看到超過50cM的現(xiàn)象，這是因為兩個基因間發(fā)生了多次交換。38Ⅲ

-8Ⅳ

-6Ⅱ

-5Ⅲ-2Ⅳ-2Ⅱ

-2Ⅰ

-239連鎖分析：是基于家系研究的一種方法，是單基因遺傳病定位克隆方法的核心。他是利用遺傳標記在家系中進行分型，再利用數(shù)學手段計算遺傳標記在家系中是否與疾病發(fā)生共分離Chrom

.

1Chrom

.

2Chrom

.

3……遺傳標記遺傳標記第一代遺傳標記:限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionFragment

Length

Polymorphism,RFLP)。第二代遺傳標記:微衛(wèi)星(Microsatellite)，其重復單位長度一般為2－6個核苷酸。分布廣﹑數(shù)目多﹑具有高度多態(tài)性。第三代遺傳標記：單核苷酸多態(tài)性標記(SNP),數(shù)量龐大，分布廣泛。42微衛(wèi)星標記420M9-3663(上)和478B14-848(下)的基因分型圖Lod值(對數(shù)優(yōu)勢比)：兩個基因座按一定的重組率而相互連鎖的可能性與兩個基因座互不

連鎖的可能性之比，這個可能性之比的10作底的對數(shù)就是對數(shù)優(yōu)勢比LOD=log10

(likelihood

of

data

If

loci

linked

at

9/likelihood

ofdata

if

loci

unlinked

at

9=0.5)0≤9≤0.5LOD

score

=

Z

=

log10

[

θ4

(1-

θ

)+θ

(1-

θ

)4]-5

log

(010LOD值≥＋3被認為是兩個基因座肯定連鎖的證據(jù)。因為LOD值是以10為底區(qū)對數(shù)計算的，LOD值＋3表明大于或等于1000：1可能性，也就是說，所觀察到的連鎖不是偶然發(fā)生的。LOD值為－2則表示

100：1的連鎖機會，被認為是排除連鎖的證據(jù)。連鎖分析常用軟件Linkage

packageGenehunterCyrillicFastmap47D2s2177-1.943.133.673.663.132.261.16D2s335-2.182.893.453.462.972.151.10D2s2302-3.241.912.672.832.511.790.80D2s21886.186.095.705.194.082.831.41D2s23146.786.686.255.704.493.121.57D2s23106.786.686.265.704.493.131.57D2s22736.206.115.725.214.102.851.42D2s3642.092.061.911.731.320.860.34D2s1610.290.280.270.250.200.140.08D—2s3—15—

D2s117—

-2—.7—9-12.53-—0.—68

— —

0.—69—-2.94 -0.77—

1.—14

—0.22—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—LOD

SCORE

AT

θ

=—

—

—

—

—

——

—

—

——

—

——

—

——

—

——

——

—

——

—

——

—

——

—Marker0.00.010.050.10.20.30.4——

—

—

—

—————

—

————

————

————

——

————

———

—

———

—

———

—

——

—————1—.27—

—1.0—

0—.52—0.90

0.90

0.55—

—

—舉例“The

present

case

demonstrates

that

thelaw

operates

in

man

as

in

plants

andlower

animals.

The

abnormality

is

shown

here

to

be

a

dominant

character”HistoryFamily

and

BDA1

photosin

Farabee’s

dissertation無大家系怎么辦？全外顯子組測序舉例連鎖分析：需大家系；定位后隱藏有數(shù)個基因全外顯子組測序：生物信息學分析；致病位點遺傳異質性(Locus

heterogeneity)家系的連鎖分析+特定區(qū)域全外顯子組測序遺傳疾病的致病基因突變克隆孟德爾遺傳病致病基因的意義為揭示基因功能、調控方式提供最直接的證據(jù)為早診斷、產(chǎn)前診斷提供標志物為相關藥物開發(fā)提供藥物靶標多基因遺傳病及致病基因的尋找/GWAStudies/精神分裂癥糖尿病高血壓風濕性關節(jié)炎等老年黃斑變性肥胖多基因疾?。河啥鄠€基因與環(huán)境因子共同作用所引起的遺傳性疾病。它包括由一個主基因和其他基因加上環(huán)境因子共同作用所引起，以及由相當多的微效基因共同參與加上環(huán)境因子所引起。其遺傳方式復雜，很難在一個家族中確定正常個體和患病個體。只有通過對大量病人進行研究后，方能確定遺傳因子在多基因病發(fā)生中的作用。多基因遺傳要點：⒈數(shù)量性狀的遺傳基礎是兩對以上基因⒉這些基因之間沒有顯，隱性的區(qū)別，而是共顯性⒊每個基因對表型的影響很小，稱為微效基因⒋微效基因具有累加效應，即一個基因對表型作用很小，但若干個基因共同作用，可對表型產(chǎn)生明顯影響⒌每對基因的行為都遵循三大定律⒍不僅遺傳因素起作用，環(huán)境因素也具有明顯作用。大多數(shù)疾病是多基因疾?。喾N基因和環(huán)境共同作用的疾病－－－復雜的機制少數(shù)單基因疾病環(huán)境基因non-medelian

traitsMany

genesmodified

by

environmenteffectAssociation

studyClassical

medelian

traits2

or

more

allele

of

a

geneWith

little

or

noenvironment

effectLinkage

studyQualitative

traits

and

quantitative

traits質量性狀

數(shù)量性狀Complex

disease

and

quantitative

traitsCommon

disorders

are

quantitative

traits

！Obesity-----？Hypertension-----？Depression------？Schizophrenia,

autism,

arthritis,

et

al(

Endophenotype

or

intermediate

phenotype)Complex

disease:Mutiple

genes

with

subtle

effectsEnviroment

factorsQuantitative

traitsMethod

for

identifying

genes

in

complex

diseaseCase-control

designAssociation

study:

Family-based

designQuantitative

trait

associaHeritabilitySingle

Nucleotide

Polymorphism(SNP)(allele、genotype)Linkage

DisequlibriumHaplotypeTag-SNPHardy-

Weinberg

Equilibrium多基因疾病的遺傳率(度)

(heritability)在多基因遺傳病中，易患性的高低受遺傳基礎和環(huán)境因素的雙重影響，其中遺傳因素所起作用的大小程度稱為遺傳度或遺傳率。在多基因病中，遺傳率可高達70%-80%；遺傳率為

30%~40%或更低，表明環(huán)境因素在決定發(fā)病上更為重要，遺傳因素的作用不顯著。遺傳度：高血壓 MZ同病一致率：

0.6DZ同病一致率：0.30.6表6-7人類一些性狀的遺傳力性狀遺傳力性狀遺傳力身材0.81理科天賦0.34坐高0.76數(shù)學天賦0.12體重0.78文史天賦0.45口才0.68拼寫能力0.53IQ(Binet)0.68先天性幽門狹窄0.75IQ(Otis)0.80精神分裂癥0.80唇裂0.76糖尿病0.75高血壓0.62冠狀動脈病0.65Single

Nucleotide

Polymorphism人類基因序列的變異大多是單核苷酸的變異。不同人群中

SNP的頻率分布有差異，而這些差異可以代表某一人群的遺傳差異。因此，探測SNP的工作可以看作是對人類“遺傳路標”(genetic

signposts)的勘定。大多數(shù)SNPs是單純多態(tài)性purepolymorphic，但也有一些與疾病的發(fā)生有關聯(lián)causative

mutations一般而言，SNP是指在基因組內特定核苷酸位置上存在兩種 不同堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1％在人類基因組中大概每1000

個堿基就有一個SNP，人類基因組上的SNP

總量大概是3

×106

個。

The

most

commonsources of

genetic

variation

between

humanG

T

G

GTTIntronic

SNP

–

iSNP

–

does

not

cause

an

amino

acid

changeRegulatory

region

SNP–effect

amount

of

protein

expressed

or

if

expressed.Coding

region：Also

cover

synonymous(同義的)and

non-synonymousSNPTGGGTGT

G

T

G

T

GCoding

SNPSNP的類型Mis-

sense

SNPT

h

rT

h

rT

G

G

T

G

THisGlnSNP是繼人類基因組計劃之后又一國際研究競爭新熱點，是闡明基因組功能及特點的重要基礎。SNP是人類基因組DNA序列變異的主要形式，是決定人類疾病的重要遺傳基礎。以前是爭奪基因Linkage

Disequilibrium:A

1

A2

allele

at

locus

1:

PA1;

PA2B1

B2

allele

at

locus

2:

PB1;

PB2If

two

loci

are

independent,

thenPA1B1=

PA1*PB1;

PA1B2=

PA1*PB2………

..If

two

loci

are

dependent,

PA1B1

is

higher

or

lowerthan

PA1*PB1.Thus,

the

two

loci

are

said

to

be

in

LD

(0<D’<1)Haplotype:A

haplotype

is

a

combination

of

alleles

atdifferent

loci

that

are

transmitted

togetheTag-SNP

is

a

representative

SNP

in

a

regionthe

genome

with

high

LDTag-SNPs：Method

for

identifying

genes

in

complex

diseaseCase-control

designAssociation

study:

Family-based

designQuantitative

trait

associaRFLPSNPsmicrosateliteCase-Control

StudyStudy

design

is

very

important

!!Population

substructure

and

selection

biSample

selection

(phenotype

definition)Sample

SizeGenetic

architectureAppropriate

statistical

analysisReplication

of

positive

results

in

an independent

cohortPaper

1(Conventional

case

control

study)Paper

2(Extreme

selection)Family-based

designN=50AC:CC=50:50AC:CC=70:30A/C

or

C/CA/CC/C

病例與對照研究屬于回顧性研究，是觀察性研究中常用的一種設計方案，是在患有某病的病例組和不患有該病的對照組，或者是在具有某項特征的病例和不具有某項特征的病例中進行，調查過去或最近有無暴露于某因素的歷史，而該因素被疑為和該病的發(fā)生有聯(lián)系，或者調查是否存在某因素，而該因素疑為和疾病的某項特征有聯(lián)系。然后比較兩組的暴露情況或具有某因素的情況，驗證某因素和疾病是否確實存在聯(lián)系，聯(lián)系的性質和程度。病例與對照研究可用于對疾病致病因素或危險因素的調查，藥物有害作用的研究， 探討影響疾病預后的因素等研究。

隊列對照研究可采用前瞻性方式，以開始觀察的時間為始點，將被觀察的人群按其是否接觸可能的致病因素或措施，分為兩個群體，隨訪一定時期后，確定并比較各群體中，

新發(fā)生病例數(shù)或某種效應的差異。

隊列對照研究是群體研究中常用的方案，被觀察的人群是否接觸某種致病因素，是自然分配而形成的兩個群體，研究者既不能隨機安排，也不可能加以控制。研究對象要有足夠的觀察時間，在自然病程中要有充分的時間，使危險因素的作用能夠表現(xiàn)出來。全部被觀察者都必須進行隨訪，隊列中失訪人數(shù)增加，將會影響所觀察的結果。凡在群體中研究可能的致病因素或某項處理措施對固定人群的影響，均可使用隊列研究，常用于病因研究，治療性研究，預防性研究或預后研究。人類復雜疾病研究策略樣本選擇基因選擇SNP選擇分型方法選擇樣本選擇：Case-ControlFamily-basedPopulation-basedTwin

StudyCase-Control

StudyTwin

StudyTwin

study:Heritability

and

environmental

factorThe

additional

MZ

individual

can

elevate the

statistical

power

for

association

by to

~40%UCSD

Twin

project

(began

in

2001)5

years

follow

upHeritability

(h2

)

of

environmental

stress

BP

response

intwins:

The

“coldpressortest”

(“CPT”:

one

hand,

0oC

ice

water,

60

sec)using

Colin

Pilot

hardware

and

ATLAS/

ANS/

TDA

software

.Ice

bucket2.基因選擇胰島素信號通路激素合成代謝通路3.SNP選擇How

to

choose

SNPs?Tag-SNPs

(Haploview)Functional

SNPs

(NCBI

SNP)4.分型方法選擇分型方法直接測序Taqman探針Massarray分子量陣列技術GWAS：全基因組關聯(lián)分析Taqman探針Massarray分子量陣列技術

按照分子量來區(qū)分不同的核苷酸

dAMP=313.2

DadCMP

=

288.2

DadGMP

=

329.2

DadTMP

=

304.2

Da無需標記，無需電泳成本低，靈敏度高，精確定量MassARRAYm分子量陣列技術平臺.有FDA論證，可進行產(chǎn)前診斷的同類儀器僅有MassARRAYm分子量陣列技術平臺；. 美國西格諾公司(SEQUENOM

Inc)生產(chǎn)；.

基于飛行時間質譜(MALDI-TOF

MS)技術

按照分子量來區(qū)分不同的核苷酸

dAMP=313.2

DadCMP

=

288.2

DadGMP

=

329.2

DadTMP

=

304.2

Da無需標記，無需電泳成本低，靈敏度高，精確定量Maker：Sequenom

IncSetting

date

：2008Room

：307,

Mingdao

BuildingContact

ain

parameter：High

resolution,

High

accuracy,High

sensitivityApplication

：Genotyping,

epigenetics,

gene

expression實驗室：明道樓307聯(lián)系電話要技術指標：高分辨率、高靈敏度、高精度應用范圍：基因分型、甲基化、基因表達制造廠商：Sequenom

Inc安裝日期：2008Massarray分子量陣列技術平臺

基于多重PCR和單堿基延伸技術MassARRAY

iPLEX分型技術36重反應時，每個SNP分型成本遠低于測序成本MassARRAY

iPLEX分型技術PCR重數(shù)：1~40重(平均33.5)；每個反應所需基因組DNA：<10ng設計成功率：>95%；分型準確率：>99.7%；每天處理樣品數(shù)：>3000個；可進行定量分析*分子量陣列技術平臺主要技術指標檢測范圍：可對6-40bp核酸片段進行分子量測定和定量分 析。激光器:氮激光器20

Hz離子源:Smart光柵飛行距離:800毫米真空壓:5

x

10-6

mbar檢測器:電子倍增管高電壓關啟：數(shù)據(jù)讀取完成后，自動關閉高電壓。軟件：自動分析數(shù)據(jù)，直接提供生物學結果。Genome-Wide

Association

Study

(GWAS)通過酶反應的間接雜交直接雜交基于芯片的SNP檢測直接雜交法檢測SNP或突變

直接雜交方法中，靶序列(熒光PCR產(chǎn)物)根據(jù)他們與芯片上探針結合程度的不同區(qū)分，雜交條件需要嚴格控制。細微的序列差異(PM,MM，突變/差異堿基設計在OLIGO正中間)導致了