實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染的預(yù)防

/111-本站首頁(yè)免費(fèi)課件免費(fèi)試題整冊(cè)教案教育資訊計(jì)劃總結(jié)英語(yǔ)角幼兒教育文書(shū)寫(xiě)作海量教案免費(fèi)論文網(wǎng)站地圖設(shè)為首頁(yè)收藏本站語(yǔ)文科數(shù)學(xué)科英語(yǔ)科政治科物理科化學(xué)科地理科歷史科生物科中考備戰(zhàn)高考備戰(zhàn)高考試題中考試題教學(xué)論文作文園地教學(xué)論文經(jīng)濟(jì)論文理工論文管理論文法律論文行政論文藝術(shù)論文醫(yī)學(xué)論文文史論文農(nóng)科論文英語(yǔ)論文課程改革教育法規(guī)教育管理家長(zhǎng)頻道您現(xiàn)在的位置：3edu教育網(wǎng)免費(fèi)論文農(nóng)科論文環(huán)境工程正文3edu教育網(wǎng)，百萬(wàn)資源,完全免費(fèi)，無(wú)需注冊(cè)，天天更新!實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染的預(yù)防1實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)分區(qū)和布局1.1樣品準(zhǔn)備區(qū)該區(qū)域無(wú)壓力設(shè)置要求。該區(qū)域是用于對(duì)樣品進(jìn)行分樣，將樣品進(jìn)行研磨、粉碎、勻漿的區(qū)域。由于在這些粉碎、研磨和勻漿處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，因此，存在陽(yáng)性樣品污染后續(xù)操作的可能性。該區(qū)域與后面的區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格隔離,應(yīng)放在與后面的三個(gè)區(qū)域隔開(kāi)的獨(dú)立的房間中。在樣品準(zhǔn)備區(qū)內(nèi)還可設(shè)立一個(gè)專用的封閉區(qū)或房間用于樣品的接收和儲(chǔ)存。這個(gè)房間可以放置冰箱用于樣品儲(chǔ)存，應(yīng)該和樣品準(zhǔn)備區(qū)其它區(qū)域隔離開(kāi)。樣品準(zhǔn)備區(qū)域的人員不得進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)。1.2核酸提取區(qū)核酸提取區(qū)是進(jìn)行樣品核酸提取的區(qū)域。該區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，目的是防止核酸溢出造成污染。樣品準(zhǔn)備區(qū)又包括從樣品中進(jìn)行核酸提取和純化的區(qū)域以及將核酸加到包含PCR主反應(yīng)混合液管中的操作區(qū)域。添加完樣品后,PCR管的蓋子要盡可?能快地蓋好。使用PCR板和膠蓋時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照和含目標(biāo)序列的樣品要與待測(cè)樣本分開(kāi)操作,以避免模板添加時(shí)造成交叉污染。重要提示:這個(gè)房間里的一切物品不得帶入試劑準(zhǔn)備區(qū)。1.3擴(kuò)增和產(chǎn)品檢測(cè)區(qū)該區(qū)域是用來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PCR分析的。PCR儀放置在這個(gè)區(qū)域。房間保持負(fù)壓，目的是防止核酸溢出。在該區(qū)域人員一定要一直穿戴工作服和手套，在離開(kāi)房間前脫去，防止擴(kuò)增子污染其它地點(diǎn)。所有用于擴(kuò)增和產(chǎn)品檢測(cè)的設(shè)備要指定用于這個(gè)房間。PCR分析工作也設(shè)置在該區(qū)域，例如:酶切、測(cè)序、克隆等，但實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡可能把這些活動(dòng)隔在不同區(qū)域或不同房間，以降低擴(kuò)增產(chǎn)物的污染風(fēng)險(xiǎn)。如果沒(méi)有條件在該區(qū)域設(shè)立負(fù)壓,此區(qū)域必須建立排風(fēng)裝置。重要提示:這個(gè)房間的物品不能帶入樣品準(zhǔn)備區(qū)或試劑準(zhǔn)備區(qū)。2設(shè)備與耗材配置設(shè)備、耗材和實(shí)驗(yàn)工作服都應(yīng)分區(qū)存放。各區(qū)域應(yīng)該分別配備可調(diào)節(jié)移液器和帶濾芯的吸頭。如條件允許可用顏色標(biāo)識(shí)不同區(qū)域的物品架、吸量管、實(shí)驗(yàn)工作服以方便監(jiān)控不同區(qū)域間的物品變動(dòng)。此外,由于塵埃會(huì)在試驗(yàn)中產(chǎn)生抑制作用，不論在哪個(gè)工作區(qū)域，都應(yīng)全程使用防塵手套。各區(qū)域配置如下：2.1試劑準(zhǔn)備區(qū)一臺(tái)用于存放試劑的冰柜（-80°C和-20°C）和冷藏柜（-TC）,專用的渦流混勻器、小型離心機(jī)、專用的可調(diào)移液管、帶濾芯的吸頭、實(shí)驗(yàn)服和一次性手套。需要總是穿戴干凈的手套和實(shí)驗(yàn)服以控制污染。操作人員在核酸提取或擴(kuò)增'檢測(cè)區(qū)工作之前需要先在試劑準(zhǔn)備區(qū)工作，不能在這些區(qū)域操作之后再回到試劑準(zhǔn)備區(qū)。2.2樣品準(zhǔn)備區(qū)最好在該區(qū)域內(nèi)安裝強(qiáng)力吸塵系統(tǒng)，至少應(yīng)放置一臺(tái)手提式吸塵器，目的是將研磨、勻漿過(guò)程中的氣溶膠馬上吸走。一臺(tái)用于存放樣品的冰柜（-80°C和-20°C）和冷藏柜（由實(shí)驗(yàn)室接受的樣品所確定），各種粉碎機(jī)、勻漿器皿等。2.3核酸提取區(qū)一臺(tái)用于存放樣品的冰柜（-80°C和-20C）和冷藏柜（由實(shí)驗(yàn)室接收的樣品所確定）,一個(gè)提取樣品所使用的生物安全柜（如果沒(méi)有條件在獨(dú)立房間中設(shè)立該區(qū)域并且無(wú)法實(shí)現(xiàn)負(fù)壓設(shè)置或在實(shí)驗(yàn)室提取處理傳染性樣品時(shí)），一臺(tái)離心機(jī)（如用來(lái)進(jìn)行樣品提取），自動(dòng)提取儀，專用的可調(diào)移液管和阻止氣溶膠的或正向位移的吸頭，一個(gè)恒溫加熱器，專用的渦流混勻器，一個(gè)專用于懸掛實(shí)驗(yàn)室工作服及存放相應(yīng)的安全物品（洗眼器、急救盒、淋浴器）的區(qū)域。如果該區(qū)域也存放化學(xué)藥品，那么在這個(gè)區(qū)域應(yīng)配備適當(dāng)?shù)脑O(shè)備和設(shè)施用于存放這些藥品。該區(qū)域應(yīng)配有一臺(tái)帶或不帶計(jì)時(shí)器的紫外燈。2.4擴(kuò)增和產(chǎn)品檢測(cè)區(qū)-20°C的冷凍箱用于儲(chǔ)存擴(kuò)增產(chǎn)物和用于貯存試劑的冰箱，一臺(tái)離心機(jī)（進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)的要求），一臺(tái)PCR工作站（配有或未配計(jì)時(shí)器的紫外燈），擴(kuò)增和凝膠電泳，測(cè)序儀或其他擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)所需的任何設(shè)備，專用的可調(diào)移液管和帶濾芯的吸頭，專用的渦流混勻器，一個(gè)專用于懸掛實(shí)驗(yàn)室工作服及存放相應(yīng)的安全物品（洗眼器、急救盒、淋浴器）的區(qū)域。如果該區(qū)域也存放化學(xué)藥品，那么在這個(gè)區(qū)域應(yīng)配備適當(dāng)?shù)脑O(shè)備和設(shè)施用于存放這些藥品。該區(qū)域應(yīng)配有一臺(tái)帶或不帶計(jì)時(shí)器的紫外燈。3建立良好操作規(guī)范為了最大程度地減少污染應(yīng)建立良好操作規(guī)范，確保遵守良好操作規(guī)范是至關(guān)重要的。1）實(shí)驗(yàn)人員在上崗前，應(yīng)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的培訓(xùn)和考核，確保操作正確、熟練。應(yīng)熟練掌握各項(xiàng)操作步驟，盡量在短時(shí)間內(nèi)完成各項(xiàng)操作。在打開(kāi)Eppendorf管之前應(yīng)經(jīng)低速、短時(shí)離心（2000~3000g,約10s）,應(yīng)使用正確的方法打開(kāi)，不能用力崩開(kāi)，以減少和避免氣溶膠的產(chǎn)生。2）各區(qū)域要有明顯標(biāo)識(shí)，并使用單向流動(dòng)降低潛在污染。用顏色標(biāo)簽對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備、試劑、工作服和供應(yīng)品有助于保持單向流動(dòng)。實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)和筆記本也不能在每個(gè)房間之間進(jìn)行傳遞。實(shí)驗(yàn)室可以用電子數(shù)據(jù)報(bào)告以避免這種潛在污染的來(lái)源。3）在一天的工作中,實(shí)驗(yàn)員在擴(kuò)增和產(chǎn)品檢測(cè)室工作之后不能再返回試劑或樣品提取區(qū)。類似地，實(shí)驗(yàn)員在樣品提取區(qū)工作后不能返回試劑準(zhǔn)備區(qū)。如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)員不能不返回工作流向中上游的房間，實(shí)驗(yàn)員應(yīng)該先淋浴和更換衣服。若在一些極端情況下，一些耗材和試劑不能不返回工作流向中上游的房間,必須事先使用漂白劑和酒精對(duì)其進(jìn)行徹底清潔。返還的物品架在浸泡于蒸循水中轉(zhuǎn)移到潔凈區(qū)之前，應(yīng)浸泡在1%漂白劑溶液中過(guò)夜，如果破壞了工作流向,受影響的實(shí)驗(yàn)室房間和設(shè)備需進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的監(jiān)測(cè)。4）每間實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該配備專用實(shí)驗(yàn)室外套和無(wú)粉手套。實(shí)驗(yàn)者在任何時(shí)候都要穿工作服和佩戴手套。手套要經(jīng)常更換,在DNA提取過(guò)程中每一步之間都要更換。離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室之前要脫掉實(shí)驗(yàn)服，扔掉手套。更換實(shí)驗(yàn)服和手套降低了模板（PCR進(jìn)行需要的核酸）或擴(kuò)增核酸的污染可能性。在處理了陽(yáng)性對(duì)照樣品或含目標(biāo)序列的樣品后、處理了模板或擴(kuò)增核酸后，與外界皮膚接觸后，要更換手套。后者防止引入在皮膚上存在的酶,如降解核酸的DNA酶和RNA酶。5）定期清洗防護(hù)服可降低對(duì)工作區(qū)和PCR反應(yīng)的污染風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)服要和普通衣服隔離開(kāi)（如實(shí)驗(yàn)服不能帶回家,不能和其它衣服一起洗）。清洗時(shí),一個(gè)工作區(qū)域的工作服放在一起洗（如樣品核酸提取區(qū)的防護(hù)服不能和擴(kuò)增及產(chǎn)品檢測(cè)室的防護(hù)服一起洗）。負(fù)責(zé)清洗防護(hù)服的公司要確保分批清洗防護(hù)服，防止一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域的防護(hù)服和另一個(gè)區(qū)域的防護(hù)服混雜在一起清洗。清洗的時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)室PCR工作的工作量，工作量大的實(shí)驗(yàn)室可能每周或每天清洗防護(hù)服。制作陽(yáng)性對(duì)照時(shí)穿著的防護(hù)服要指定只用于這項(xiàng)工作時(shí)穿著,而旦清洗得要更勤。為了減少清洗，也可以使用一次性防護(hù)服。6）每次實(shí)驗(yàn)后，所有表面都要用0.6%的次氯酸鈉進(jìn)行清理。次氯酸鈉應(yīng)該當(dāng)天配制,將商業(yè)漂白劑與水進(jìn)行1：10的稀癖，將pH調(diào)到7。這個(gè)溶液可以抑制致病原，破壞核酸。殘留的漂白劑要用0.1%的硫代硫酸鈉和70%乙醇或等價(jià)物去除，否則可能會(huì)在不銹鋼或罩子上留下斑跡。商業(yè)產(chǎn)品是為去除核酸特別設(shè)計(jì)的，核酸酶也可以用于表面的清理。只要懷疑受到污染，熱循環(huán)機(jī)和離心機(jī)用稀釋的漂白劑清理（同3）。離心管的清洗根據(jù)制造商的說(shuō)明。貨架和托盤(pán)每次使用后在0.6%的次氯酸鈉溶液中浸泡后用水充分沖洗。凝膠梳和玻璃器皿使用后用中性洗滌劑或用水沖洗。4一些具體污染防控措施1）應(yīng)盡可能優(yōu)化和整合樣品DNA提取、反應(yīng)液配制的操作步驟，以減少污染機(jī)會(huì)。所有試劑應(yīng)以大體積、高濃度配制,然后稀釋和分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存,以避免污染。2）盡量使用一次性的、帶濾芯的加樣器吸頭，以減少氣溶膠的污染機(jī)率。3）UNG控制污染:使用尿嗟呢DNA-糖昔酶（UNG）,并用脫氧尿昔三磷酸（dUTP）代替脫氧胸甘三磷酸（dTTP）。其做法是將所有的擴(kuò)增反應(yīng)與UNG酶進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，可以去除殘留在DNA中的dU（但不影響DNA、gUTP或RNA）,產(chǎn)生數(shù)十或數(shù)百的無(wú)堿基位點(diǎn),DNA聚合酶會(huì)在這些位點(diǎn)處停滯。而且這些位點(diǎn)是不穩(wěn)定的，在熱循環(huán)中會(huì)發(fā)生斷裂，每一種損傷都會(huì)防止重?cái)U(kuò)增的發(fā)生。PCR產(chǎn)物越長(zhǎng),UNG去污染的效率就越高，但對(duì)短于100bp的PCR產(chǎn)物不能用UNG完全消除污染。4）紫外線控制污染。用紫外線使干燥的DNA失活以減少器材表面模板DNA污染的手段，機(jī)理是通過(guò)在相鄰的嗟嚏堿基之間形成環(huán)丁烷而造成DNA損傷，環(huán)「烷形成鏈內(nèi)的嗟呢二聚體，從而抑制了聚合酶介導(dǎo)的鏈延伸反應(yīng)。其缺陷是不能消除所有污染，而只能將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí),并且當(dāng)DNA片段小于300bp時(shí)效果較差。另外像加樣器、離心機(jī)等器材只有一小部分是向著光源的，這樣就不能被紫外線有效地去除污染。因而，紫外線照射僅可以為PCR實(shí)驗(yàn)室的無(wú)污染提供部分安全保障。5）應(yīng)該在日常樣品檢測(cè)中分析陽(yáng)性和陰性質(zhì)量控制對(duì)照結(jié)果，以說(shuō)明基于PCR方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。從污染控制角度，應(yīng)合理設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照1。1）陰性對(duì)照陰性對(duì)照是指應(yīng)對(duì)使用的每一套引物和探針進(jìn)行分析從而確定在樣品處理過(guò)程中，反應(yīng)預(yù)混液和樣品中不存在核酸污染。在反應(yīng)過(guò)程中，陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)則說(shuō)明檢測(cè)體系是成立的。兩種主要形式的陰性對(duì)照介紹如表1所列。（l）PCR陰性對(duì)照PCR陰性對(duì)照用于確保反應(yīng)預(yù)混液中沒(méi)有核酸污染。該對(duì)照是在配制主反應(yīng)混合液中加入模版的步驟時(shí)加入的，只是加入的不是待擴(kuò)增的模版而是加入分子生物學(xué)級(jí)別的水或緩沖液替代模版。陰性對(duì)照呈現(xiàn)陰性結(jié)果表明反應(yīng)預(yù)混液和試劑都沒(méi)有被污染。在每個(gè)PCR反應(yīng)批次的每套引物的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試樣品中按照1~5%的數(shù)量設(shè)置。一個(gè)PCR反應(yīng)批次是指一組樣品使用相同的PCR預(yù)混液和PCR儀，在相同的PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。（2）方法的空白對(duì)照設(shè)置方法的空白對(duì)照是為了檢查在樣品處理過(guò)程和PCR分析過(guò)程中是否有污染。這個(gè)控制步驟是通過(guò)使用滅菌水完成的,這份滅菌水與測(cè)試樣品一起經(jīng)過(guò)前處理，核酸提取,樣品轉(zhuǎn)移以及PCR反應(yīng)等步驟。每一樣品批次至少設(shè)置一個(gè)方法的空白對(duì)照。一個(gè)樣品批次是指測(cè)試樣品的整過(guò)實(shí)驗(yàn)步驟包括從樣品處理直到PCR反應(yīng)。不同種類的轉(zhuǎn)基因樣品，如果前處理和核酸提取步驟不同，就視為不同的樣品批次的樣品。2）環(huán)境質(zhì)控對(duì)照這種對(duì)照可每月進(jìn)行一次。具體方法是:在試劑準(zhǔn)備區(qū)，向主反應(yīng)混合液中加入滅菌水以替代模板。然后將這些PCR管放置在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品準(zhǔn)備區(qū)、核酸提取區(qū)中，將蓋子打開(kāi)，暴露15分鐘后蓋好。將這些PCR管同陰性對(duì)照一樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果任何一管出現(xiàn)陽(yáng)性