組學(xué)研究技術(shù)課件

Chapter10

基因組學(xué)研究技術(shù)Capter1Chapter10Capter1物理圖譜基因轉(zhuǎn)錄圖譜基因組功能分析技術(shù)生物信息學(xué)技術(shù)主要內(nèi)容物理圖譜主要內(nèi)容物理圖譜物理圖譜物理圖譜（physicalmap）測(cè)定DNA分子，繪制構(gòu)成基因組的全部基因的排列和間距。

即直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組的實(shí)際位置。目的把基因的遺傳信息在染色體上的相對(duì)位置線性而系統(tǒng)地排列出來物理圖譜（physicalmap）染色體上每個(gè)DNA片段的順序以已知核苷酸序列的DNA片段（STS）為“路標(biāo)”，以堿基對(duì)（bp，kb，Mb）作為基本測(cè)量單位（圖距）的基因組圖。

物理圖譜染色體上每個(gè)DNA片段的順序物理圖譜物理圖的距離依作圖方法而異

★

輻射雜種作圖的計(jì)算單位為厘鐳(cR)

★

限制性片段作圖與克隆作圖圖距單位為堿基對(duì)(bp)。【cR(厘鐳):在確定的輻射劑量下染色體斷裂的百分率?！课锢韴D的距離【cR(厘鐳):在確定的輻射劑量下染色體斷裂物理圖譜要素

序列

位置長(zhǎng)的序列中

▲物理圖：標(biāo)明各個(gè)序列的路標(biāo)

▲通過分子雜交的辦法利用DNA雙鏈互補(bǔ)特點(diǎn)一個(gè)DNA片段雜交在這個(gè)位置說明這個(gè)位置的結(jié)構(gòu)與它相似~即這個(gè)位置的標(biāo)記

以序列作為標(biāo)記的位置物理圖譜要素組學(xué)研究技術(shù)課件物理作圖的方法

★限制酶作圖(RestrictionMapping)

★

基于克隆的基因組作圖(clone-basedmapping)

★熒光原位雜交

(Fish,Fluorescentinsituhybridization)

★

序標(biāo)位作圖(STS，Sequencetagedsite)物理作圖的方法物理圖譜的意義獲得分布于整個(gè)基因組的30000個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequencetaggedsite,STS），使基因組每隔100kb距離就有一個(gè)標(biāo)記在此基礎(chǔ)上構(gòu)建覆蓋每條染色體的大片段DNA克隆

如：物理圖譜的意義●酵母人工染色體

（yeastartificialchromosome,YAC）●細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）●人工附加染色體

（humanartificialepisomalchromosome,HAEC）●人工噬菌體染色體

（P1bacteriophageartificialchromosome,PAC）等連續(xù)克隆(Contig)●酵母人工染色體限制酶作圖

DNA鏈的限制性酶切片段的排列順序即酶切片段在DNA鏈上的定位限制性內(nèi)切酶在DNA鏈上的切口是以特異序列為基礎(chǔ)的，核苷酸序列不同的DNA，經(jīng)酶切后就會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段，構(gòu)成獨(dú)特的酶切圖譜(RestrictionMapping)。又稱DNA物理圖譜

DNA分子結(jié)構(gòu)的特征之一

限制酶作圖DNA鏈的限制性酶切片段的排列順序DNA是很大的分子，限制酶產(chǎn)生用于測(cè)序反應(yīng)的DNA片段只是其中的極小部分，這些片段在DNA鏈中所處的位置關(guān)系~即DNA物理圖譜解決的問題DNA物理圖譜是順序測(cè)定的基礎(chǔ)

指導(dǎo)DNA測(cè)序的藍(lán)圖

Why???DNA是很大的分子，限制酶產(chǎn)生用于測(cè)序反應(yīng)的D限制性作圖

▼將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對(duì)位置只能應(yīng)用于較小的DNA分子

▼上限取決于作圖分子中限制酶位點(diǎn)的頻率

▼采用6堿基對(duì)識(shí)別順序的限制酶適合﹤50KbDNA分子的精確作圖限制酶作圖

限制性作圖限制酶作圖基本原理

把龐大的DNA先“敲碎”，再拼接以Mb、kb、bp作為圖距以STS（sequencetagssite）探針序列為路標(biāo)主要是把含有STS對(duì)應(yīng)序列的DNA的克隆片段連接成相互重疊的“片段重疊群（contig）基本原理把龐大的DNA先“敲碎”，再拼接主要是把組學(xué)研究技術(shù)課件（1）完全降解

選擇合適的限制性內(nèi)切酶完全降解待測(cè)DNA鏈(同位素標(biāo)記)

凝膠電泳分離→→自顯影→→獲得圖譜即組成該DNA鏈的酶切片段數(shù)目和大小基本步驟（1）完全降解選擇合適的限制性內(nèi)切酶基本步驟同位素標(biāo)記32P限制性內(nèi)切酶電泳同位素標(biāo)記32P限制性內(nèi)切酶電泳

末端標(biāo)記待測(cè)DNA的一條鏈(同位素)

酶部分降解控制反應(yīng)條件使DNA鏈上酶切口隨機(jī)斷裂避免所有切口斷裂的完全降解電泳分離→→自顯影比較自顯影圖譜根據(jù)片段大小及彼此間的差異排出酶切片段在DNA鏈上的位置（2）部分降解末端標(biāo)記待測(cè)DNA的一條鏈(同位素)（2）部分降解12比較排出酶切片段12比較排出酶切片段完整的物理圖譜應(yīng)包括基因組的不同載體DNA克隆片段重疊群圖大片段限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)圖

DNA片段或一特異DNA序列（STS）的路標(biāo)圖基因組中廣泛存在的特征型序列等的標(biāo)記圖（如CpG序列、Alu序列，isochore）

【具有mosaic結(jié)構(gòu),稱為isochore。即基因組是由一些較長(zhǎng)的大片段（平均長(zhǎng)度>>300Kb）組成,GC含量相對(duì)均勻,而在這些大片段的兩端GC含量是躍變的,而不是漸變的】

完整的物理圖譜應(yīng)包括組學(xué)研究技術(shù)課件熒光原位雜交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)將探針用熒光標(biāo)記，與細(xì)胞分裂中期的染色體雜交，用熒光顯微鏡觀察信號(hào)所處的位置，將探針標(biāo)定在連鎖圖上。熒光原位雜交將探針用熒光標(biāo)記，與細(xì)胞分裂中期的染色體雜交熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）熒光原位雜交

（fluorescentinsituhy熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）熒光原位雜交

（fluorescentinsituhy熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）熒光原位雜交

（fluorescentinsituhy熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）熒光原位雜交

（fluorescentinsituhy用DNA纖維分析水稻第4號(hào)染色體用DNA纖維分析水稻第4號(hào)染色體基于克隆的基因組作圖

大片段DNA的克隆載體◆

YAC:酵母人工染色體230-1700Kb◆

BAC:細(xì)菌人工染色體300Kb◆PAC:P1人工染色體300Kb◆

Cosmids:30Kb

重疊群(Contig)

：相互重疊的DNA片段組成的物理圖

Contig組建方法:染色體步移指紋作圖基于克隆的基因組作圖大片段DNA的克隆載體重疊群(克隆作圖構(gòu)建全基因組DNA基因文庫(kù)構(gòu)建指定單一染色體的基因文庫(kù)PCR檢測(cè)STS分子標(biāo)記根據(jù)重疊STS標(biāo)記繪制克隆連鎖圖提取基因組DNA

流式細(xì)胞儀分離染色體打斷打斷克隆作圖構(gòu)建全基因組DNA基因文庫(kù)構(gòu)建指定單一染色體的基因染色體步移原理染色體步移原理chromosomewalking酶切，插入A基因探針篩選亞克隆片段重新篩選亞克隆片段重新篩選λ亞克隆1相鄰λ亞克隆2chromosomewalking酶切，插入A基因探針亞克指紋：確定DNA樣品所具有的DNA片段一個(gè)克隆的指紋

即表示該克隆所具有的限定的順序特征克隆指紋分析原理

如果2個(gè)克隆彼此重疊它們一定含有相同的序列克隆指紋主要用于重疊群(Contig)的構(gòu)建指紋：確定DNA樣品所具有的DNA片段克隆指紋分析原理指紋分析方法

限制性帶型(restrictionpatterns)指紋重復(fù)順序DNA指紋(repetitiveDNAfingerprints)STS目錄作圖(STS

contentmapping)

重復(fù)DNAPCR(repetitiveDNAPCR)

或分散重復(fù)順序PCR指紋

(interspersedrepeatelement

PCR,IRE-PCR)

指紋分析方法限制性帶型(restrictionpatt限制性片段指紋重疊順序DNA指紋STS指紋Contig限制性片段指紋重疊順序DNA指紋STS指紋Contig序標(biāo)位(STS)作圖

長(zhǎng)度:100-500bp

序列已知,可以設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)單拷貝,在染色體上的位置是唯一的

EST

(Expressedsequencetag)

可以作STS

STS：sequencetagsit序標(biāo)位(STS)作圖長(zhǎng)度:100-500bpSTSSTS作圖原理成套片段2個(gè)標(biāo)簽同時(shí)出現(xiàn)在6個(gè)大片段中只有2個(gè)大片段有2個(gè)標(biāo)簽STS作圖原理成套片段2個(gè)標(biāo)簽同時(shí)出現(xiàn)在6個(gè)大片段中只有2染色體DNASTS作圖原理染色體DNASTS作圖原理尋找STS的方法

表達(dá)順序標(biāo)簽(expressedsequencetag，EST)

從cDNA中找到的小段順序基因家族成員間共有的序列不能用于STSSSLP

（simplesequencelengthpolymorphisrns）隨機(jī)基因組順序?qū)ふ襍TS的方法表達(dá)順序標(biāo)簽(expressedse表達(dá)順序標(biāo)簽EST

隨機(jī)挑選cDNA克隆進(jìn)行單向、一步大規(guī)模測(cè)序所獲得的部分cDNA序列即EST

●

EST是一個(gè)cDNA克隆快速大規(guī)模測(cè)序后所獲得的３’端和５’端部分cDNA隨機(jī)片段●

每個(gè)EST長(zhǎng)度約200～600bp

代表了一個(gè)單拷貝基因的部分cDNA表達(dá)序列表達(dá)順序標(biāo)簽EST●EST是一個(gè)cDNA克隆快速大規(guī)模測(cè)大多數(shù)EST的長(zhǎng)度不足400bpWhy？？？一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列可能包含多個(gè)序列重疊的EST一個(gè)基因mRNA剪接點(diǎn)不同可以獲得多個(gè)cDNA克隆那么，EST既可能對(duì)應(yīng)于一個(gè)cDNA的某一部分又可能代表mRNA的不同剪接方式

大多數(shù)EST的長(zhǎng)度不足400bpWhy？？？一個(gè)基基因轉(zhuǎn)錄圖譜

（transcriptionmap）基因轉(zhuǎn)錄圖譜（transcriptionmap）轉(zhuǎn)錄圖譜(基因圖譜)

在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。即利用EST作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜。（genemap）轉(zhuǎn)錄圖譜(基因圖譜)即利用EST作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳Ortranscriptionmap:在人類基因組中鑒別出占2%至5%的全部基因的位置結(jié)構(gòu)與功能?；驹恚旱鞍踪|(zhì)推測(cè)mRNA的序列，mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用其與所測(cè)序列進(jìn)行雜交，鑒別出與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的基因。Ortranscriptionmap:基本原理

生物性狀和疾病→→由結(jié)構(gòu)或功能蛋白質(zhì)決定已知的蛋白質(zhì)→→由mRNA編碼

mRNA反轉(zhuǎn)錄→合成cDNA→

即EST的cDNA片段用這種穩(wěn)定的cDNA或EST→→作為“探針”進(jìn)行分子雜交鑒別出與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的基因基本原理生物性狀和疾病→→由結(jié)構(gòu)或功能蛋白質(zhì)決定基本原理或用PolyA互補(bǔ)的寡聚T

或克隆載體的相關(guān)序列作為引物對(duì)mRNA雙端尾側(cè)的幾百個(gè)bp進(jìn)行測(cè)序得到EST（表達(dá)序列標(biāo)簽）基本原理或用PolyA互補(bǔ)的寡聚T表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）克隆測(cè)序獲得EST表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）克隆測(cè)序獲得EST基本過程細(xì)胞/組織高質(zhì)量mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆3‘和5’端探針估計(jì)全長(zhǎng)和復(fù)雜性雜交陣列文庫(kù)克隆3‘和5’端全長(zhǎng)候選基因純化克隆證實(shí)5’端基本過程細(xì)胞/組織高質(zhì)量mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆3‘和基因圖譜的意義1、能為估計(jì)人類基因的數(shù)目提供可靠的依據(jù)。2、提供不同組織、不同時(shí)期基因表達(dá)的信息（數(shù)目、種類及結(jié)構(gòu)功能）。3、提供結(jié)構(gòu)基因的標(biāo)記，可以作為篩選基因的探針，有直接的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。4、鑒定病態(tài)基因（如癌基因）的變異位置?；驁D譜的意義

單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）

人類是一個(gè)具有多態(tài)性的群體。不同的群體和個(gè)體在生物學(xué)性狀（對(duì)疾病的易感性／抗性）上的差別，是進(jìn)化過程中基因組與環(huán)境相互作用的結(jié)果單核苷酸多態(tài)性人類是一個(gè)具有多態(tài)性的群體。不同

不同個(gè)體間在基因水平上的單核苷酸變異，平均每1000對(duì)堿基出現(xiàn)一個(gè)SNP,2個(gè)無關(guān)個(gè)體間有300萬SNPs.不同個(gè)體間在基因水平上的單核苷酸變異，SNP作圖的一般步驟包括：

①獲取DNA序列；

②

從DNA序列確定序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequencetaggedsites，STSs）；

③掃描STSs或ESTs確定候選SNPs；

④

確定SNPs；

⑤將SNPs定位于染色體特定位置。SNP作圖的一般步驟包括：①獲取DNA序列；特異雜交特異雜交SNP不同于罕見的單堿基突變（Mutation）

◆

SNP等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率≧1％

◆

位于基因的編碼序列中的SNP稱為cSNP

如果cSNP引起蛋白質(zhì)重要部位AA變異導(dǎo)致其功能發(fā)生改變

◆

位于基因調(diào)控序列中的SNP影響基因的表達(dá)調(diào)控

◆

SNP因連鎖不平衡所形成的單倍型用于關(guān)聯(lián)研究（Associationstudies）確定與之聯(lián)鎖的生物學(xué)性狀相關(guān)序列SNP不同于罕見的單堿基突變（Mutation）

連鎖分析與基因定位疾病的關(guān)聯(lián)研究多基因疾病的基因定位個(gè)體識(shí)別和親子鑒定發(fā)病機(jī)理的研究個(gè)體用藥生物進(jìn)化和生物間相互關(guān)系SNP應(yīng)用連鎖分析與基因定位SNP應(yīng)用【例1】

鐮刀型貧血癥（sickle-cellanemia）血紅蛋白的β珠蛋白基因

17位的A突變?yōu)門

導(dǎo)致Val變Glu

血紅蛋白構(gòu)型改變攜氧能力大大降低，引發(fā)嚴(yán)重貧血SNP與臨床直接導(dǎo)致遺傳病【例1】鐮刀型貧血癥（sickle-cellanemia【例2】靜脈血栓（venousthrombosis）凝血因子5（factorV）基因

1691位的G突變?yōu)锳

導(dǎo)致Arg變?yōu)镚lu

封閉了抗凝血因子APC(activatedProteinC)

對(duì)factorV的切割位點(diǎn)促使血栓形成【例2】靜脈血栓（venousthrombosis）關(guān)聯(lián)分析（Associationstudies）

：如果某一因素可增加某種疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)即與正常對(duì)照人群相比該因素在疾病人群中的頻率較高

那么，該因素與疾病相關(guān)聯(lián)如非遺傳因素吸煙與肺癌相關(guān)遺傳因素中，APOE4與Alzheimer`s相關(guān)SNP與遺傳標(biāo)記研究復(fù)雜性狀與疾病的遺傳，以及群體的基因識(shí)別

[老年癡呆/阿爾海默癥]關(guān)聯(lián)分析（Associationstudies）：SNP遺傳標(biāo)記用于遺傳分析或關(guān)聯(lián)分析的特征核酸位點(diǎn)SNP數(shù)量多，分布廣泛SNP適于快速、規(guī)模化篩查SNP等位基因頻率的容易估計(jì)易于基因分型遺傳標(biāo)記同樣藥物的劑量對(duì)病人甲有效對(duì)病人乙不起作用對(duì)病人丙則可能有副作用藥物的療效與副作用方面，病人的反應(yīng)差異很大

Why？？？病人遺傳學(xué)上存在差異（單核苷酸多態(tài)性SNP）導(dǎo)致對(duì)藥物產(chǎn)生不同的反應(yīng)SNP與個(gè)體用藥同樣藥物的劑量SNP與個(gè)體用藥【例

】細(xì)胞色素P450酶與大約25%廣泛使用的藥物的代謝有關(guān)如果病人該酶的基因發(fā)生突變就會(huì)對(duì)降壓藥異喹胍產(chǎn)生明顯的副作用

那么，查明病人的SNP圖譜檢測(cè)病人是那一個(gè)或多個(gè)基因發(fā)生突變對(duì)癥下藥→→→個(gè)體醫(yī)療?！纠考?xì)胞色素P450酶美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)提供（NationalInstitutesofHealth）★與癌癥和腫瘤相關(guān)的候選SNP數(shù)據(jù)庫(kù)：

/GAI★適于生物醫(yī)學(xué)研究的dbSNP多態(tài)數(shù)據(jù)庫(kù)：

/SNPSNP公用數(shù)據(jù)庫(kù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)提供SNP公用數(shù)據(jù)庫(kù)基因組功能分析技術(shù)基因組功能分析技術(shù)基因分離技術(shù)

差異基因分離技術(shù)

SAGE

(SerialAnalysisofGeneExpression)

基因芯片技術(shù)遺傳連鎖分析位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析；基因分離技術(shù)差異基因分離技術(shù)

雙雜交技術(shù)蛋白組學(xué)基因封閉技術(shù)（反義核酸、核酶、RNAi、基因剔除）

基因替代技術(shù)（基因轉(zhuǎn)移、可控性基因表達(dá)）

蛋白修飾技術(shù)生物信息學(xué)分析技術(shù)基因功能研究技術(shù)雙雜交技術(shù)基因功能研究技術(shù)◆

變性高壓液相色譜(DHPLC)(denaturinghigh-performanceliquidchromatography)◆

基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflight)◆

DNAChip◆

SSCP(單鏈構(gòu)像多肽性)◆

動(dòng)態(tài)特異等位基因雜交

（dynamicallele-specifichybridization）SNP大規(guī)模分離檢測(cè)技術(shù)◆變性高壓液相色譜(DHPLC)SNP大規(guī)模分離檢測(cè)技新基因功能研究策略新基因功能研究策略基因表達(dá)系列分析SAGE

（serialsanalysisofgeneexpression）

1995Velculescu及其同事年創(chuàng)立基因表達(dá)系列分析原理來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鑒定一個(gè)轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽（tag）；通過簡(jiǎn)單的方法將這些標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（concatemer），對(duì)每個(gè)克隆到載體的多聯(lián)體進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達(dá)的基因種類，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達(dá)豐度（abundance）。原理1.將5μg含有oligodT（引物）的磁珠與RNA混合。2.合成雙鏈cDNA。

3.用NlaⅢ酶消化形成一條鏈末端有標(biāo)簽的產(chǎn)物。

4.將樣品分成兩份，連接成含有識(shí)別序列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。5.用MmeI切割每一個(gè)樣品形成約60bp的標(biāo)簽。SAGE步驟磁珠磁珠磁珠磁珠磁珠磁珠識(shí)別序列識(shí)別序列標(biāo)簽1.將5μg含有oligodT（引物）的磁珠與RNA混合6.延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標(biāo)簽。

7.PCR擴(kuò)增。8.用NlaⅢ酶切130bp產(chǎn)物釋放34bp雙鏈標(biāo)簽。9.連接片斷形成串聯(lián)體。

10.克隆到pZErO-1+里，并測(cè)序。

連接擴(kuò)增6.延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標(biāo)簽。

7.PCRSAGE實(shí)例SAGE實(shí)例錨定酶辟分AE一半結(jié)合結(jié)頭B一半結(jié)合結(jié)頭A標(biāo)簽酶辟分TE標(biāo)簽酶辟分TE