基因治療載體研究現(xiàn)狀及前景

基因治療載體研究現(xiàn)狀及前景

基因載體主要有病毒載體和非病毒載體。病毒載體的基因轉(zhuǎn)運能力強,但其攜帶基因的大小數(shù)量有限,而且在臨床應(yīng)用上存在安全性問題。非病毒載體具有低毒、低免疫反應(yīng),外源基因隨機整合率低且攜帶基因大小類型受限制等優(yōu)點,已成為基因治療中的熱點和當(dāng)前藥劑學(xué)研究的前沿課題。隨著人類基因組計劃的完成和后基因組計劃的實施,功能基因不斷涌現(xiàn)。如何將所需的功能基因?qū)胧荏w細胞是基因研究中的關(guān)鍵步驟,因此開發(fā)安全有效的基因傳遞載體成為了當(dāng)前研究的重要工作之一。對于非病毒載體,其基因傳遞方法又可分為物理法和化學(xué)法。因此,無論是基因載體還是傳遞方法的發(fā)展都將對基因治療產(chǎn)生深遠的影響?！禞ournalofGeneMedicine》對2008年在臨床基因治療中所用載體的類型和各期基因臨床試驗的情況進行了調(diào)查。該調(diào)查發(fā)現(xiàn)在載體材料的使用中,腺病毒載體占24·9%,為各種載體之首,但進入III期臨床試驗的基因治療占3·2%。也就是說在基因治療的臨床應(yīng)用上,研究者變得更謹慎和小心,就目前基因治療的狀況而言,安全性,即致畸、致癌和致突變,靶向特異性及體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率等問題,已成為基因治療所遇到的瓶頸問題。因此,如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因藥物載體,如何提高非病毒性基因載體的靶向特異性和體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率,已經(jīng)是迫在眉睫的關(guān)鍵問題。

1基因載體的種類

基因治療載體可分兩大類:病毒性載體和非病毒性載體。

2病毒性載體

病毒性載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒、皰疹病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)用最早,研究也相當(dāng)深入,目前仍被廣泛應(yīng)用。雖其經(jīng)改造后去除了病原性,保留了高的基因轉(zhuǎn)染效率,但因制備困難、目的基因容量小、靶向特異性差,以及自身免疫原性和生物安全性問題,限制了它們的應(yīng)用。特別是1999年出現(xiàn)首例因使用腺病毒載體而致病人死亡的事件發(fā)生后美國許多科研機構(gòu)已停止使用病毒類載體,重點轉(zhuǎn)向非病毒類載體研究。

3非病毒載體的研究進展

理想的非病毒載體需要滿足以下條件:保護DNA不被細胞外DNA降解酶的降解;攜帶DNA穿透細胞膜;保護DNA在進入核前不被細胞內(nèi)容酶體和酶等降解;能有效將有活性的基因插入目的區(qū);可生物降解,從細胞中消除;無細胞毒性[1]。目前非病毒基因載體的研究主要集中于以下幾個方面:

陽離子多聚物載體陽離子多聚物/DNA混合物稱為polyplex。陽離子多聚物可濃縮富含陰離子的DNA,然后粘附到細胞表面的硫酸粘多糖上,被細胞內(nèi)吞進入細胞內(nèi),從而使質(zhì)粒表達。報道的陽離子多聚物種類很多,如聚乙烯亞胺,聚丙烯亞胺樹突狀物,聚酰胺樹突狀物,多聚賴氨酸、多聚組氨酸、多聚精氨酸、魚精蛋白、殼聚糖等以及上述聚合物的聚乙二醇修飾物。其中研究較早的是多聚賴氨酸,后來發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺性能更佳,是目前研究的熱點。PEI可抑制溶酶體,在吞噬泡酸性環(huán)境中質(zhì)子化、正電荷增加,對DNA提供更大的保護作用,有利于質(zhì)粒逃離吞噬泡[2]。PEI糖基化或聚乙二醇化增加了其生物兼容性,陽離子多聚物/DNA混合物經(jīng)PEG修飾后,可形成囊泡狀結(jié)構(gòu),屏蔽表面多余的正電荷,有利于體內(nèi)應(yīng)用。

納米顆粒載體納米顆粒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染具有其他非病毒載體所沒有的優(yōu)勢。首先,納米顆粒在一定范圍內(nèi)的顆粒數(shù)目對細胞的生長及活性無明顯影響,細胞毒性和遺傳毒性較其他載體低很多;同時納米載體不存在免疫原性,因而不會導(dǎo)致免疫反應(yīng)的發(fā)生。其次,納米顆粒傳遞基因的效率較高。很多納米材料作為載體傳遞基因的效率與脂質(zhì)體相當(dāng)甚至高于脂質(zhì)體。第三,由于自身體積小,納米顆?？梢栽谘苤须S血液循環(huán),并可通過血腦屏障到達身體各組織中。最后,納米顆粒在體內(nèi)的循環(huán)時間明顯長于普通大小的顆粒,在短時間內(nèi)不會很快被吞噬細胞清除,從而可以延長與細胞的接觸時間,提高轉(zhuǎn)染效率。同時,納米顆粒還可與DNA形成致密結(jié)構(gòu),使DNA不被核酸酶消化降解,有濃縮保護DNA的作用。目前研究較多的納米粒主要有無機納米粒、固體脂質(zhì)納米粒、可降解聚合物納米粒、天然高分子納米粒、有機硅納米粒等。

脂質(zhì)體脂質(zhì)體DNA復(fù)合物又稱為lipoplexes。應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因脂質(zhì)體分陽性、中性脂質(zhì)體、陰性脂質(zhì)體以及pH-敏感的脂質(zhì)體。陽性脂質(zhì)體,體外應(yīng)用較多,如商品化的Lipofec-tin。在脂質(zhì)和DNA的復(fù)合物中加入少量多聚賴氨酸或魚精蛋白復(fù)合物等可形成類似病毒樣的顆粒,減少了復(fù)合物間的凝聚,增加了對DNA的結(jié)合力,提高了脂質(zhì)體在體外的轉(zhuǎn)染效率。陽離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)一般包括疏水基團和氨基基團,增加分子中氨基基團的數(shù)目,以及增加氨基基團與疏水基團之間的距離有利于增加DNA的釋放能力。陽離子脂質(zhì)體與DNA形成的復(fù)合物顆粒大小從50nm到1um不等,體外細胞試驗,大顆粒的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于小顆粒。脂質(zhì)體經(jīng)聚乙二醇修飾后,可降低脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物顆粒之間的相互聚集,降低了與血液成分的相互作用,使脂質(zhì)體DNA復(fù)合物顆粒由大顆粒變成小顆粒,同時不影響脂質(zhì)體與細胞的親和力,但體外試驗,陽離子脂質(zhì)體聚乙二醇化降低了轉(zhuǎn)染效率[3]。另外,將脂質(zhì)體與配體結(jié)合形成導(dǎo)向脂質(zhì)體可增加轉(zhuǎn)染效率,如葉酸導(dǎo)向的pH-敏感脂質(zhì)體可用于葉酸受體表達增加的許多腫瘤細胞系[4],抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單抗偶聯(lián)的PEG化的中性脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒,體內(nèi)應(yīng)用,可廣泛轉(zhuǎn)染外周組織和腦[5]。

脂質(zhì)體是由磷脂雙層構(gòu)成的具有水相內(nèi)核的脂質(zhì)微囊,其作為抗癌藥物的載體對癌細胞,具有靶向性、無免疫原性、緩釋時間長、毒副作用低及載藥率高等優(yōu)點。由于脂質(zhì)體既能包封脂溶性藥物,又能包封水溶性藥物,在腫瘤治療中顯示出明顯的優(yōu)越性。近年來,國內(nèi)外研究者在脂質(zhì)體的制備工藝、表面修飾、靶向性等方面進行了廣泛研究,前體脂質(zhì)體、長循環(huán)脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體等新型脂質(zhì)體不斷涌現(xiàn),為脂質(zhì)體的臨床應(yīng)用開辟了廣闊前景。前體脂質(zhì)體是在普通脂質(zhì)體制劑中加入一定量的固相載體,通過不同的干燥工藝使其形成動性較好,易在水中分散或溶解的粉末[6]。North等[7]用脂質(zhì)體包裹腫瘤相關(guān)抗原BLP25制成腫瘤疫苗,用于治療非小細胞肺癌和前列腺癌患者,延長了患者的存活時間。Richards等人[8]將脂質(zhì)體包被的多柔比星對胃癌患者進行瘤周黏膜下注射,與單獨注射游離ADR比較,其在淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度明顯提高,而且持續(xù)時間長、毒副作用小、抗癌療效高。3·4聚乙烯亞胺研究表明,PEI在體內(nèi)外均有較高的轉(zhuǎn)染效率,但是PEI不易被細胞內(nèi)的酶代謝,易在核內(nèi)聚集,引起細胞毒性。因此,需對PEI進行改性,使聚乙烯亞胺表面聚乙二醇化,即“PEGylation”,以減小其毒性。其中將聚乙二醇與聚乙烯亞胺共聚、聚乙二醇與聚乙烯亞胺偶合和聚乙二醇對聚乙烯亞胺進行物理包裹等都是可選擇的策略。因為聚乙二醇的介入,使聚乙烯亞胺與DNA所形成的微粒在血液循環(huán)中穩(wěn)定性增加,防止微粒在生理條件下聚集和沉淀。Thomas等用不同分子量的聚乙二醇偶合于PEI25kDa上,發(fā)現(xiàn)PEG在PEI所形成的微粒有不同的結(jié)構(gòu)形式,如核殼結(jié)構(gòu)和均相結(jié)構(gòu),其中均相結(jié)構(gòu)微粒易被細胞吞噬。他們還將三元共聚化合物hy-PEI-g-PCL-b-PEG應(yīng)用于基因藥物的釋放,該共聚物的特點是可生物降解[9]。Kim將半乳糖和聚乙烯亞胺通過活性聚乙二醇的“橋”連接起來,同時利用活性VS-PEG-NHS將RGD短肽鍵合于載體材料,偶合配體的聚乙烯亞胺在基因轉(zhuǎn)染實驗中均顯示靶向細胞選擇性[10]。

3·5生物相容性載體材料為解決基因載體材料生物相容性的問題,天然高分子生物材料如膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖和海藻酸鹽等被用于基因藥物載體的研究。其中殼聚糖及其衍生物在基因載體系統(tǒng)的研究最為廣泛。Leong等[11]將殼聚糖先與DNA形成復(fù)合物微粒,把聚乙二醇偶合于復(fù)合物微粒上,將腫瘤細胞上具有靶向受體表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白偶合在復(fù)合物微粒上,形成一種組裝式、靶向性的轉(zhuǎn)基因藥物載體,該組裝式載體在HEK293細胞株上具有很高的轉(zhuǎn)染效率。Chong等[12]將聚乙烯亞胺偶合于殼聚糖上制成母體材料,然后把靶向于肝細胞的半乳糖基鍵合于母體材料上,制成具有靶向肝細胞的基因藥物載體。他們還將殼聚糖進行苷露糖化作為靶向于巨噬細胞的苷露糖受體,以作為鼻腔內(nèi)免疫體的輔助釋放系統(tǒng)。除殼聚糖外,植物多糖也是一類良好的載體材料。大量的藥理試驗證明,多糖類藥物主要作用于免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等。作為基因藥物載體,多數(shù)植物多糖的結(jié)構(gòu)本身不能與質(zhì)粒DNA結(jié)合,因此需要用化學(xué)方法對植物多糖的結(jié)構(gòu)進行修飾改性。由于植物多糖的糖苷環(huán)結(jié)構(gòu)中帶有豐富的羥基、羰基等,為載體本身的活化提供了可能性。Takeda[13]等報道了用天然裂褶多糖、聚乙烯亞胺和質(zhì)粒DNA三元復(fù)合物在抗原遞呈細胞上被細胞吞噬攝取的研究,用原子顯微鏡觀察了細胞的吞噬過程,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物易被細胞吞噬,說明糖羥基的存在易使復(fù)合物在細胞膜表面黏附及攝取。環(huán)糊精是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖,其中具有重要意義的是含有6、7、8個葡萄糖單元分子的A、B、C-環(huán)糊精。在基因藥物載體中,由于其所具有的活潑羥基基團,可以與聚陽離子材料結(jié)合,制成具有生物相容性、可生物降解的基因藥物載體系統(tǒng)。Davis等[14]報道用分子量為25kDa的直線型和樹枝狀聚乙烯亞胺,分別偶合于經(jīng)過活化的B-環(huán)糊精上,制得β-CyD-LPEI和β-CyD-bPEI,對所合成的載體材料進行體外細胞學(xué)實驗和體內(nèi)動物實驗。我們課題組用B-環(huán)糊精上的活潑羥基,用N,N’-二羰基咪唑?qū)Νh(huán)糊精進行修飾,將低分子量的聚乙烯亞胺偶合于B-環(huán)糊精上,得到了滿意的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率[15-17]。Li用B-環(huán)糊精為核,將聚乙二醇穿過B-環(huán)糊精的空穴,再將小分子的聚乙烯亞胺偶合于B-環(huán)糊精的表面羥基上,形成一個多功能的組合式基因藥物載體,所合成的載體材料極易溶于水體系中,且有很強的DNA縮合能力,在HEK293細胞上表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)染效率[18]。同時,用低分子量的聚乙烯亞胺經(jīng)N,N’-二羰基咪唑活化后,偶合于B-環(huán)糊精的7個羥基上,形成一個以B-環(huán)糊精為核、聚乙烯亞胺為側(cè)基的樹枝狀聚合物,為B-環(huán)糊精-聚陽離子材料在基因藥物的研究領(lǐng)域開創(chuàng)了新的方法。

多功能信封式納米載體多功能信封式納米載體[19]是由日本人Hi-deyoshiHarashima提出的基于程序組裝的一種新型的復(fù)合載體系統(tǒng)。理想的MEND是由壓縮的DNA核心和含有靶向因子及功能配體的脂質(zhì)信封外殼構(gòu)成。首先,采用多聚陽離子如PLL、PEI將DNA壓縮,這樣可以保護DNA不受核酸酶的降解,控制DNA復(fù)合物的大小及提高DNA的包封率。其次將多聚陽離子/DNA復(fù)合物通過與脂質(zhì)體間的水合作用和靜電相互作用包裹入脂質(zhì)體中。最后對脂質(zhì)體進行修飾達到不同的功能,如PEG化和靶向作用。這種新型的復(fù)合載體系統(tǒng)綜合了各種載體系統(tǒng)所具有的優(yōu)點,具有顯著的促進基因的細胞轉(zhuǎn)染潛在優(yōu)勢,因而有著廣闊的發(fā)展前景。

4配體介導(dǎo)的靶向載體

要使非病毒載體能在腫瘤細胞或特異組織中定向遷移并攜帶DNA進行細胞轉(zhuǎn)染,就需要在載體表面進行靶向基團修飾,使其具有靶向特異性。葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、半乳糖、TAT肽及膽甾醇等靶向配體偶合于載體上可以提高載體的靶向性。

4·1葉酸受體研究表明葉酸受體在大部分惡性腫瘤細胞表面均有過度表達。葉酸受體主要有α-FR、β-FR和γ-FR三種亞型,其中α-FR在卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌等一些上皮組織的惡性腫瘤細胞中高表達;β-FR在頭頸部鱗狀細胞癌及一些非上皮來源的癌組織中高表達;γ-FR分布很少,主要在血液組織出現(xiàn)惡變時有過度表達。葉酸受體的表達水平與腫瘤的發(fā)展階段有關(guān),早期腫瘤的葉酸受體表達較低,晚期及高度惡變的腫瘤受體表達增強。用殼聚糖為核心偶合聚乙二醇形成親水性的載體材料,再將葉酸偶聯(lián)于載體材料上,是一種有效改善殼聚糖性質(zhì)的方法。Yang等報道殼聚糖經(jīng)過聚乙二醇偶合后溶解性大為改善,再偶合葉酸配體后,該載體材料就成為一種具有一定靶向性的復(fù)合式基因載體[20]。

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體Wanger等將聚乙烯亞胺與轉(zhuǎn)鐵蛋白偶合制成Tf-PEI共聚物,對50種細胞進行了體外轉(zhuǎn)染實驗,發(fā)現(xiàn)Tf-PEI共聚物對10種腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染具有較高的選擇性;同時,對動物進行了體內(nèi)的研究,實驗結(jié)果表明其在腫瘤組織中的表達明顯高于其它組織器官。他們還用冷光共聚焦顯微鏡活體觀察了Tf-PEI/DNA和Tf-PEG-PEI/DNA復(fù)合物在荷瘤小鼠中的分布及在腫瘤部位的遷移、富集,為非病毒基因載體材料在動物體內(nèi)的研究奠定了基礎(chǔ)[21]。

短肽蛋白1988年Green和Franke研究小組[22]分別發(fā)現(xiàn)HIV-1的TAT短肽蛋白具有穿越細胞膜進入細胞的特性,隨后一批能跨膜的短肽蛋白相繼被發(fā)現(xiàn),如Antp、VP22及Transportan等。這類具有穿膜功能的短肽被科學(xué)家統(tǒng)稱為細胞膜穿透肽。CPPs不但自身具有穿透細胞膜的能力,而且能夠介導(dǎo)與其相連的各種載體材料跨膜進入細胞,這對于不能靠自身能力進入細胞的載體材料是個非常有意義的發(fā)現(xiàn)。因此,有許多課題組開展了短肽蛋白介導(dǎo)的穿膜體系研究,噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)篩選出許多具有靶向功能的短肽蛋白。Yang課題組將短肽TAT偶合于聚乙二醇-膽固醇載體材料上,形成雙功能靶向載體TAT-PEG-b-Cho,l其中TAT序列NH2-YGRKKRR-QRRR,結(jié)合FITC技術(shù)和量子點技術(shù)發(fā)現(xiàn),該組裝式載體在腫瘤細胞具有極高的轉(zhuǎn)染效率[23]。湯谷平課題組將TAT、MC10和CY11等功能性靶向短肽偶合于PEI-CD載體材料上,在體外細胞轉(zhuǎn)染實驗中