克氏原螯蝦游離氨基酸的測定

克氏原螯蝦游離氨基酸的測定

克氏原生蝦，俗稱紅沼澤水生螃蟹。這是一種淡水螃蟹。它屬于節(jié)肢動物門、甲殼類、足食動物、下足量、水中蝦科和其他種類。原產(chǎn)于墨西哥北部、美國南部,1918年日本從美國將其引進,作為牛蛙餌料,1929年再由日本傳入中國,在江、皖部分地區(qū)繁衍,后在長江流域擴散,被列為入侵物種的新甲殼類水生動物,近年來逐漸成長為我國淡水蝦類中的主要優(yōu)勢物種FAA又稱非蛋白氨基酸克氏原螯蝦是以植物性食物為主的雜食性動物。野生克氏原螯蝦一般攝食植物的嫩葉、植物碎片、底棲藻類、水生昆蟲、陸生昆蟲幼體、環(huán)節(jié)動物、小雜魚、貝類等,人工養(yǎng)殖克氏原螯蝦一般則食用以魚粉、α-淀粉、大豆蛋白、啤酒酵母等為主的人工配合飼料1材料和方法1.1化學(xué)試劑及試劑野生和養(yǎng)殖克氏原螯蝦于2013年9月購于江蘇淮安。鹽酸(分析純)、二水合5-磺基水楊酸(5-磺基水楊酸)(分析純)、檸檬酸三鈉(優(yōu)級純)、乙(丙)二醇甲醚(優(yōu)級純)、茚三酮(優(yōu)級純)國藥集團化學(xué)試劑有限公司;正己烷(分析純)上海試劑四廠昆山分廠;娃哈哈純凈飲用水杭州娃哈哈集團。1.2儀器與材料FJ-200高速分散均質(zhì)機上海標(biāo)本模型廠;AL204電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;AvantiJ-26xP真空冷凍離心機美國Beckman公司;L-8800氨基酸自動分析儀日立集團。1.3方法1.3.1冷凍離心檢測分別剝離蝦頭與蝦肉,將剝?nèi)〕龅奈r肉、蝦頭分別盛裝,保存于-78℃,待用。分別稱取5g左右樣品,加入0.02mol/L的鹽酸溶液15mL,充分均質(zhì)后用0.02mol/L的鹽酸溶液定容至50mL,分別在3000、5000r/min、4℃條件下冷凍離心10min。取2mL上清液加入2mL8%磺基水楊酸溶液去蛋白,在4℃冰箱中靜置15~30min后,在1000r/min、4℃條件下冷凍離心10min。取2mL離心后的上清液加入2mL正己烷,除去干擾因素,混合后在1000r/min、4℃條件下冷凍離心10min,取下層液體,過0.22μm濾膜后進樣測定。3組平行實驗,測定結(jié)果取平均值。1.3.2化合物的配制配制緩沖液時,按照組分表(表1)用電子天平精確稱質(zhì)量。苯甲醇易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象,因此本實驗不加;表面活性劑Brij-35配制,取25gBrij-35溶于100mL純水中(需加熱);在滴定前加入辛酸消泡。緩沖液配好后用0.45μm有機相濾膜過濾,其中緩沖液B4和B5用0.45μm水相濾膜過濾。反應(yīng)液R1中茚三酮為固體試劑,開封后密封避光保存,配制過程需避光操作。待茚三酮充分溶解于乙(丙)二醇甲醚后使用0.22mm微孔濾膜抽濾,上機鼓泡(>5min),加入硼氫化鈉,鼓泡(>30min),鼓泡壓力:34~40kPa,硼氫化鈉現(xiàn)用現(xiàn)稱,精確稱量,多加容易堵塞反應(yīng)柱。配制緩沖液R2時,如醋酸鈉不易溶解,可微熱至約60℃,以促進溶解。1.3.3檢測條件及進樣量分離柱(4.6mm×60mm),分離樹脂為陽離子交換樹脂,分離柱溫度57℃,檢測波長570nm,緩沖溶液流速0.40mL/min,反應(yīng)液流量0.35mL/min,反應(yīng)單元溫度135℃,進樣量20μL。用氨基酸分析儀自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。2結(jié)果與分析2.1對克氏原螯蝦蝦頭與蝦肉中游離氨基酸的影響克氏原螯蝦的食用口感鮮美,與FAA存在很大關(guān)系。在所有呈味氨基酸中,Glu鮮味最強,是重要的鮮味劑,有較高的營養(yǎng)價值,Glu被人體吸收后,易與血氨形成谷酰胺,能解除代謝過程中氨的毒害作用,因而能預(yù)防和治療肝昏迷,保護肝臟姚根娣從表3可以發(fā)現(xiàn),對克氏原螯蝦蝦肉呈味貢獻最大的是Arg,對克氏原螯蝦蝦頭呈味貢獻較大的為Lys、Arg、Glu、Ala和His,其TAV值均大于1,呈味作用顯著,同樣從圖1可以得知,對克氏原螯蝦蝦肉和蝦頭呈味有貢獻的游離氨基酸截然不同,其模式圖輪廓差異較大,說明蝦肉和蝦頭具有不同的風(fēng)味。2.2gla、arg、gly和ala在養(yǎng)殖克氏原螯蝦中的含量蝦肉味道的鮮美程度與呈味氨基酸的組成和含量有關(guān)。由表2可知,野生與養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉的主要FAA組成基本一致,含量最高的5種游離氨基酸均為:Arg、Gly、Ala、Glu和Thr,約占FAA總量的80.7%~81.3%,其中呈味氨基酸3種,必需氨基酸1種,無限制氨基酸。除Glu之外,其余4種FAA在養(yǎng)殖克氏原螯蝦中的含量均高于野生克氏原螯蝦,其中最高的為Arg,高出了1.293mg/g;養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉中的Gly和Ala也較野生克氏原螯蝦蝦肉中的含量高。野生與養(yǎng)殖克氏原螯蝦中的這5種FAA含量模式圖輪廓相似(圖2),但養(yǎng)殖克氏原螯蝦的模式圖面積卻大于野生克氏原螯蝦,說明在養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉中這幾種FAA含量普遍高于野生克氏原螯蝦。野生與養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉中的6種主要FAA的TAV模式圖輪廓基本相似(圖1),貢獻最大的是Arg,在養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉中的TAV值為6.77,呈味貢獻顯著,同樣在養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉中,Ala和His的TAV值也分別達到了1.48和1.29,對于蝦肉呈味有顯著影響,但在野生克氏原螯蝦中,Ala和His的TAV值分別只有0.99和0.56,呈味作用不顯著。由此可見,養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉比野生克氏原螯蝦蝦肉味道更鮮甜。2.3克氏原螯蝦蝦頭中的游離氨基酸同樣可以從表2可知,克氏原螯蝦蝦頭中的主要FAA組成也基本一致,含量最高的6種氨基酸均為:Lys、Arg、Ala、Leu、Phe和Glu,約占FAA總量的67.4%~67.9%,其中呈味氨基酸2種,必需氨基酸3種,限制氨基酸1種。除Ala含量略低(0.094mg/g)以外,其余5種主要FAA在野生克氏原螯蝦蝦頭中的含量均高于養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭,且組成含量相近。Ala、Arg和Lys在克氏原螯蝦蝦頭中的含量均超過10%,在野生克氏原螯蝦蝦頭中為12.7%、14.8%、14.8%,在養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭中為16.7%、15.2%、15.7%。野生克氏原螯蝦蝦頭中這6種主要FAA含量的模式圖的輪廓與養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭相似(圖2),且面積較大,說明在野生克氏原螯蝦蝦頭中這幾種FAA含量普遍大于養(yǎng)殖克氏原螯蝦。野生與養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭中對的6種主要游離氨基酸TAV模式圖輪廓也基本相似(圖1),貢獻較大的是Lys、Arg、Glu、Ala和His,在野生克氏原螯蝦蝦頭中的TAV值分別為2.61、2.61、2.34、1.87和1.47,在養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭中的TAV值分別為2.28、2.22、1.68、2.03和1.38,呈味貢獻顯著。由表3數(shù)據(jù)還可以發(fā)現(xiàn),Glu和Ala對野生和養(yǎng)殖克氏原螯蝦的呈味效果有不同影響,野生克氏原螯蝦蝦頭中Glu的TAV值大于養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭,而Ala的TAV值卻小于養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭。除了以上5種貢獻較大的游離氨基酸以外,在野生克氏原螯蝦蝦頭中,Val和Met由于其較低的味覺閾值,TAV值分別達到了1.23和1.04,對其呈味也有貢獻,而在養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭中,這2種游離氨基酸TAV值均小于1,對呈味沒有貢獻,這說明野生克氏原螯蝦蝦頭更鮮。3克氏原螯蝦蝦頭氨基酸組成與組成變化克氏原螯蝦蝦頭中FAA總量大于蝦肉中的FAA總量,這可能與蝦頭中含有性腺、肝胰臟等器官有關(guān),但無論在克氏原螯蝦蝦頭或是蝦肉中,Arg始終是占FAA總量比例最大的,與文獻[11-13]報道相一致,除此之外,Ala占FAA總量的比例相對比較穩(wěn)定,在野生和養(yǎng)殖克氏原螯蝦的蝦肉中和蝦頭中的百分含量均為13%左右?？耸显r蝦頭中呈味氨基酸、必需氨基酸和限制氨基酸含量均大于其在蝦肉中的含量,特別是必需氨基酸,其在蝦頭中的含量遠(yuǎn)大于在蝦肉中的含量,達到3~4倍。養(yǎng)殖克氏原螯蝦的FAA總量大于野生克氏原螯蝦,分別為14.3mg/g和13.6mg/g,可能與食物來源有關(guān)。但僅憑FAA含量還不夠?qū)耸显r蝦肉和蝦頭的特點進行定義,且本實驗只采集了一個地區(qū)的樣品,不具有普遍性,還需要通過對其他地區(qū)以及不同養(yǎng)殖方式的樣品進行大量的分析,才能得出更準(zhǔn)確的結(jié)論。對克氏原螯蝦蝦肉呈味貢獻最大的是Arg,其TAV值為4.18~6.77,Ala和His在養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉中的TAV值均大于1,對其呈味有重要貢獻,但其在野生克氏原螯蝦蝦肉中的TAV值均小于1,對呈味沒有貢獻;對克氏原螯蝦蝦頭呈味有貢獻的游離氨基酸較多,其中Lys和Arg貢獻較為突出,在野生克氏原螯蝦中的TAV值均為2.61,而對野生克氏原螯蝦蝦頭呈味有貢獻的Val和Met,在養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦頭中卻對呈味沒有產(chǎn)生影響。由此可見,對克氏原螯蝦蝦肉呈味有貢獻的游離氨基酸組成較為單一,而克氏原螯蝦蝦頭中對呈味有貢獻的游離氨基酸更為豐富?？耸显r蝦肉蛋白質(zhì)含量豐富,在均質(zhì)過程中容易產(chǎn)泡,對定容產(chǎn)生一定困難,直接影響測定結(jié)果的精確性,通過何種方法既可以有助于消泡,又不會影響游離氨基酸的提取,甚至能更好更便捷地提取,還有待更深的研究。FAA是水產(chǎn)品呈鮮味的主要成分,野生和養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉和蝦頭中共檢出15種FAA,除這15種FAA以外,還有幾種氨基酸尚未檢測出,或者特征峰沒有很好地分離,這也有待進一步系統(tǒng)地優(yōu)化、分離、測定。隨著經(jīng)濟的不斷增長,人們生活水平的提高,