植物細胞工程技術原理專家講座

第11章植物組織培養(yǎng)

（PlantTissueCulture)植物細胞工程技術原理專家講座第1頁主要內(nèi)容組織培養(yǎng)理論基礎組織培養(yǎng)技術操作影響組織培養(yǎng)效果原因植物細胞工程技術原理專家講座第2頁第一節(jié)組織培養(yǎng)技術操作組織培養(yǎng)技術流程？組織培養(yǎng)1選擇植物材料2培養(yǎng)基5培養(yǎng)(溫度控制等）4接種3滅菌植物細胞工程技術原理專家講座第3頁一、培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基組成成份培養(yǎng)基分類培養(yǎng)基配制植物細胞工程技術原理專家講座第4頁1、培養(yǎng)基組成成份最早風眼蘭柵欄組織Knop溶液+蔗糖存活不分裂1934年White番茄根離體培養(yǎng)成功（1937年發(fā)覺B族維生素作用，創(chuàng)建White培養(yǎng)基）1948年Skoog和崔真煙草莖段培養(yǎng)發(fā)覺腺嘌呤或腺苷可解除生長素對芽生長抑制作用培養(yǎng)基組成：水、無機鹽、糖、有機物、植物激素、其它添加物等。植物細胞工程技術原理專家講座第5頁1、培養(yǎng)基組成成份糖：碳源，維持培養(yǎng)基滲透壓3%（2~6%）無機鹽：普通有10~20種，分為大量元素和微量元素兩類。大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo一個離子普通由一個以上無機鹽提供，以確保離子平衡，防止因為培養(yǎng)物吸收差異引發(fā)pH變動。植物細胞工程技術原理專家講座第6頁1、培養(yǎng)基組成成份有機物：維生素類

VitB1（硫胺素）VitB6（鹽酸吡哆醇）VitB3（煙酸）VitB5（泛酸鈣）

肌醇

氨基酸

CH（水解酪蛋白）、LH（水解乳蛋白）

ME（麥芽提取物）、YE（酵母浸出物）植物細胞工程技術原理專家講座第7頁1、培養(yǎng)基組成成份植物激素：生長素類：誘導細胞分裂和根分化；IBA、IAA、NAA、2,4-D

0.1mol/LNaOH配制細胞分裂素類：促進細胞分裂和分化不定芽6-BA、KT、ZA、2iP

0.5或1mol/LHCl配制植物細胞工程技術原理專家講座第8頁1、培養(yǎng)基組成成份其它添加成份：固化劑（gellingagent）：瓊脂用量普通為7-10g/L，即0.7-1%（W/V）太大，培養(yǎng)基過硬；太小，培養(yǎng)基不易凝固。吸附劑：活性碳，適合用于培養(yǎng)中輕易形成不利于生長分泌物培養(yǎng)物。植物細胞工程技術原理專家講座第9頁pH變動高中化學：無機鹽溶液酸堿性判斷依據(jù)是，該鹽是否發(fā)生水解。強酸強堿鹽如NaCl中性；強酸弱堿鹽如NH4Cl酸性；強堿弱酸鹽如Na2CO3堿性。大學：植物對礦質(zhì)元素吸收是以離子形式進行，以交換吸附方式發(fā)生，陽離子和H+發(fā)生交換吸附；陰離子和HCO3-13種必需礦質(zhì)元素吸收量存在以下關系：大量元素：N＞K＞Ca＞Mg=P＞S；微量元素：Cl=Fe＞Mn＞B＞Zn＞Cu=Mo(NH4)2SO4中，吸收量N＞S，培養(yǎng)基中H+多，生理酸性鹽，pH減小KNO3中，N＞K，HCO3-多，生理堿性鹽，pH增大。植物細胞工程技術原理專家講座第10頁2、培養(yǎng)基分類按性質(zhì)分：基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基加激素按狀態(tài)分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基植物細胞工程技術原理專家講座第11頁2、培養(yǎng)基分類基本培養(yǎng)基按照組成成份又可分為很各種，常見如MS、Miller、B5、N6、T、LS、H、KM8P等。依據(jù)其鹽濃度大致可分為四類：富鹽平衡培養(yǎng)基：MS高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：B5、N6中鹽培養(yǎng)基：Miller，大量元素濃度為MS二分之一低鹽培養(yǎng)基：White，生根培養(yǎng)植物細胞工程技術原理專家講座第12頁3、培養(yǎng)基選擇查閱文件資料，參考已經(jīng)有研究結(jié)果選擇基本培養(yǎng)基確定激素種類和濃度（配方）自己試驗植物細胞工程技術原理專家講座第13頁4、培養(yǎng)基配制（1）、母液配制：母液：實際是一個貯存液，比實際使用溶液濃度高。方便，準確。以KNO3為例：1L培養(yǎng)基需要量為19g，在配制母液時，增加為10倍量即190g，這么用母液配制培養(yǎng)基時，只要1/10母液量就能夠了。植物細胞工程技術原理專家講座第14頁4、培養(yǎng)基配制（1）、母液配制：普通把母液分成大量元素、微量元素、有機物等幾類進行配制。大量元素配制成10-20×母液微量元素配制成100-200×母液有機普通配制成100×母液激素單獨配制成1mg/ml母液

植物細胞工程技術原理專家講座第15頁4、培養(yǎng)基配制2、培養(yǎng)基配制稱取適量糖（固體培養(yǎng)基還需要瓊脂），溶解依據(jù)要配制培養(yǎng)基體積按百分比加入所需體積母液（如有瓊脂則需煮沸至澄清）加入激素，定容（熱不穩(wěn)定激素需滅菌后加入）調(diào)整pH值為5.8~6.0（這一步一定要最終操作）植物細胞工程技術原理專家講座第16頁二、滅菌滅菌、消毒、防腐物理方法：熱力滅菌干熱160度2h玻璃和金屬器皿濕熱高壓蒸汽滅菌都適用電離輻射：各種射線一次性器械和物品如注射器紫外滅菌：紫外線照射20~30min空氣和物體表面消毒植物細胞工程技術原理專家講座第17頁二、滅菌化學方法：重金屬鹽如0.1%HgCl2氧化劑如高錳酸鉀、10%NaClO表面活性劑：酒精、潔爾滅甲醛等植物細胞工程技術原理專家講座第18頁二、滅菌過濾除菌：適合用于不能經(jīng)過高溫高壓滅菌物質(zhì)，應用各種細菌過濾器滅菌。針頭式濾器、正壓式金屬濾器植物細胞工程技術原理專家講座第19頁二、滅菌接種室和培養(yǎng)室：定時熏蒸滅菌熏蒸劑慣用甲醛加高錳酸鉀，普通每100ml甲醛加5g高錳酸鉀植物細胞工程技術原理專家講座第20頁三、外植體選取及接種培養(yǎng)1、外植體（explant）選取外植體：是指用于離體培養(yǎng)活植物組織、器官等材料。用于外植體分離母體植物材料普通有三種起源：一是生長在自然環(huán)境下植物；二是有目標地培育在溫室控制環(huán)境條件下生長植物；三是無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)植物。植物細胞工程技術原理專家講座第21頁二、外植體選取及接種培養(yǎng)1、外植體（explant）選取依據(jù)培養(yǎng)需求選擇植物部位

多年生植物注意樹齡和季節(jié)

在不影響培養(yǎng)目標前提下盡可能選擇自然繁殖器官作外植體植物細胞工程技術原理專家講座第22頁2、外植體滅菌1、慣用消毒劑及特點消毒劑使用濃度(%)消毒時間(min.)效果殘液去除難易次氯酸鈣/納105～30好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～10最好最難過氧化氫10～125～15很好最易抗菌素4～50mgl-130～60很好較難植物細胞工程技術原理專家講座第23頁不一樣外植體在滅菌劑濃度、時間、程序上有所區(qū)分2、外植體滅菌消毒劑篩選設計？植物細胞工程技術原理專家講座第24頁2、外植體滅菌滅菌程序及篩選外植體清洗整理殺菌劑滅菌無菌水清洗不一樣外植體在滅菌劑濃度、時間、程序上有所區(qū)分準備室超凈臺上70%酒精1minNaClO/HgCl2洗4~5次植物細胞工程技術原理專家講座第25頁3、接種用解剖刀、鑷子將外植體分割成適當大小于酒精燈旁打開培養(yǎng)瓶蓋用滅過菌鑷子將外植體接入培養(yǎng)基中蓋培養(yǎng)瓶蓋，注明材料、日期等信息。培養(yǎng)植物細胞工程技術原理專家講座第26頁4、培養(yǎng)溫度：24℃左右普通材料20~30℃光照：早期弱光，后期強光；光周期普通12~16小時氣體調(diào)整（O2）：植物細胞工程技術原理專家講座第27頁四、常見污染及原因污染原因：培養(yǎng)基、器具滅菌不徹底；培養(yǎng)材料消毒滅菌不徹底；無菌操作不過關；培養(yǎng)時污染（與培養(yǎng)室相關）。常見