Gallios流式細(xì)胞儀操作規(guī)程

高端流式細(xì)胞儀Gallios操作規(guī)程BeckmanCoulter醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室2022年12月Gallios操作規(guī)程注意：重新開機(jī)前先確認(rèn)是否已經(jīng)關(guān)機(jī)30分鐘以上，以保護(hù)激光器。一、開機(jī)前檢查1.檢查鞘液桶并確認(rèn)：外置鞘液桶是否充足，需充滿1/3以上鞘液，鞘液為加有萬分之一NaN2的超純水。旋緊外置和內(nèi)置鞘液桶蓋子，管路與桶蓋連接，無扭曲。檢察廢液桶并確認(rèn)：及時(shí)清空廢液桶，可酌情在廢液桶內(nèi)加入少量次氯酸鈉原液，旋緊廢液桶蓋子，管路與桶蓋連接，無扭曲。3.檢查清洗液桶，確認(rèn)加滿清洗液。二、開機(jī)1.開啟液流車電源箱開關(guān)，啟動(dòng)計(jì)算機(jī)。2.在出現(xiàn)的Window窗口對(duì)話框中輸入用戶名（adminstrator）和密碼（password）。3.點(diǎn)擊桌面，此時(shí)405nm、488nm、635nm激光器自動(dòng)開啟，如實(shí)驗(yàn)需要561nm激光器，可在儀器后方打開該激光器的電源。點(diǎn)擊（工作站）圖標(biāo)，在用戶登錄對(duì)話框中，選擇登陸的用戶名service1，輸入密碼service5(密碼會(huì)定期更換)，點(diǎn)擊“Next”。4.下一窗口，點(diǎn)擊“Connect”，啟動(dòng)流式細(xì)胞儀。注意：如流式細(xì)胞儀重新啟動(dòng)后，再次關(guān)機(jī)必須等待30分鐘以上，以保護(hù)激光器。打開電源箱門，做如下檢查：AIRFILTER,VACUUMFILTER必需干燥無水；WATERTRAP液體不能超過1/3；VACUUMTRAP液體不能超過1/4；檢查SYSTEMVACUUM表，確認(rèn)在-17~-30in.Hg；檢查SYSTEMPRESURE表，確認(rèn)在28~32PSI之間。注意：如SYSTEMPRESURE表計(jì)數(shù)不在上述范圍內(nèi)，拉出PRESUREADJUSTER鈕，調(diào)節(jié)壓力至30±2，將按鈕復(fù)位。（第5條一般由儀器管理員每天檢查）6.激光預(yù)熱10-15分鐘，觀察流式細(xì)胞儀主機(jī)前的指示面板，“STATUS”指示燈變?yōu)榫G色如圖標(biāo)示，且軟件提示“AwaitingSample”，執(zhí)行Prime，排除管路氣泡后，既可以開始檢測(cè)標(biāo)本。三、檢測(cè)標(biāo)本以人雙色淋巴細(xì)胞亞群為例，介紹Gallios流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙色樣本流程。1.實(shí)驗(yàn)試劑：?jiǎn)慰寺晒饪贵w：①Isotypecontrol（IgG1-FITC/IgG1-PE）；②CD3-FITC/CD19-PE;③CD3-FITC/CD4-PE;④CD3-FITC/CD8-PE;⑤CD3-FITC/CD16+56-PE。紅細(xì)胞裂解液：即用型，室溫保存（18-25℃）；0.01MPBS；Immunotrol質(zhì)控血或者EDTA抗凝血。2.樣本制備：A取5支流式試管，編號(hào)為1、2、3、4、5，分別將100μl抗凝全血或Immunotrol質(zhì)控血加入1-5號(hào)試管中，小心不要將血掛在試管內(nèi)壁上；B在各管中依次加入20μl的IgG1-FITC/IgG1-PE、CD3-FITC/CD19-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/CD8-PE、CD3-FITC/CD16+56-PE，渦旋混勻后，室溫避光孵育20分鐘；C取出試管，每管加入500μl紅細(xì)胞裂解液OptiLyseC，渦旋混勻，室溫避光10分鐘；300g（約1200rpm）離心5min，棄去上清液；D每管加入2ml的PBS，渦旋混勻，300g離心5min，棄去上清液；E每管加入0.5mlPBS混勻，4℃避光1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)；若不能及時(shí)上機(jī)，加入0.5ml含1-2%多聚甲醛的PBS溶液，置于4℃冰箱保存，24h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。3.建立雙色方案：A選擇“File”“New”“NewProtocol”B選擇參數(shù)：點(diǎn)擊工具欄中的“CytometerControl”鍵，選擇“Acq.Setup”選項(xiàng)卡，點(diǎn)擊“Parameters…”進(jìn)入?yún)?shù)選擇對(duì)話框，依實(shí)驗(yàn)選擇所需的參數(shù)，點(diǎn)擊“OK”，為方案選擇保存路徑，命名為“2CLymI”本實(shí)驗(yàn)所選參數(shù)為FS-INT-LIN；SS-INT-Lin；FL1-INT-Log；FL2-INT-Log。C建立該實(shí)驗(yàn)方案所需圖形：本實(shí)驗(yàn)需要二個(gè)圖（請(qǐng)同學(xué)們思考：不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰獛追鶖?shù)據(jù)顯示圖，怎樣組合雙參數(shù)散點(diǎn)圖）①SS/FS雙參數(shù)點(diǎn)圖：?jiǎn)螕艄ぞ邫谥械模–olorDotPlot）鍵，X軸選擇“SSINTLIN:SSINTLIN”,Y軸參數(shù)選擇“FSINTLIN:FSINTLIN”，Gate參數(shù)選擇“Ungated”，如需在圖形中直接顯示細(xì)胞相對(duì)百分含量，可在“Show%onplot前的方框中打“√”，如下圖。單擊OK。單擊（PolygonalRegion）鍵，在FS/SS點(diǎn)圖中畫多邊形門A，用來圈定淋巴細(xì)胞。②FL1/F2雙參數(shù)散點(diǎn)圖：?jiǎn)螕艄ぞ邫谥械模–olorDotPlot）鍵，X軸參數(shù)選擇“FL1INTFL1LOG”,Y軸參數(shù)選擇“FL2INTFL2LOG”，Gate參數(shù)選擇“A”，如下圖左，單擊OK。在工具欄中選擇鍵，，在FL1/FL2點(diǎn)圖中第一個(gè)對(duì)數(shù)格處畫十字象限，如下圖右。③將鼠標(biāo)移至該圖左下角，出現(xiàn)“Σ”時(shí)，單擊鼠標(biāo)左鍵，顯示統(tǒng)計(jì)。單擊工具欄“Σ”圖標(biāo)，可編輯統(tǒng)計(jì)項(xiàng)，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)所需數(shù)據(jù)要求在彈出的窗口中選擇Number、%Gated、X-Mean、Y-Mean，并在“ReportOptions”下面的“MeanCalculationMathod”選項(xiàng)前打“√”，在“SelectNumeric”下面選擇“Percent”，在“Precision”處指定小數(shù)點(diǎn)后位數(shù)（最多4位）如下圖。D設(shè)定坐標(biāo)軸名稱：?jiǎn)螕舨藛螜凇癋ile”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在彈出的對(duì)話框中選擇“Parameters”欄中的“FL1INTLOG”,在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“IgG1-FITC”；選擇“FL2INTLOG”，在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“IgG1-PE”，單擊“OK”；E單擊工具欄上的保存方案F單擊菜單欄“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在彈出的對(duì)話框中選擇“SelectParametertoedit”欄中的“FL1INTLOG”,在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“CD3-FITC”；選擇“FL2INTLOG”，在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“CD19-PE”，單擊“OK”；G單擊菜單欄“File”→“SaveProtocolAs…”，在彈出的對(duì)話框中輸入“2CLymCD3-19”，單擊“Save”；H單擊菜單欄“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在彈出的對(duì)話框中選擇“SelectParametertoedit”欄中的“FL1INTLOG”,在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“CD3-FITC選擇“FL2INTLOG”，在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“CD4-PE”，單擊“OK”；I單擊菜單欄“File”→“SaveProtocolAs…”，在彈出的對(duì)話框中輸入“2CLymCD3-4”，單擊“Save”；J單擊菜單欄“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在彈出的對(duì)話框中選擇“SelectParametertoedit”欄中的“FL1INTLOG”,在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“CD3-FITC”；選擇“FL2INTLOG”，在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“CD8-PE”，單擊“OK”；K單擊菜單欄“File”→“SaveProtocolAs…”，在彈出的對(duì)話框中輸入“2CLymCD3-8”，單擊“Save”；L單擊菜單欄“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在彈出的對(duì)話框中選擇“SelectParametertoedit”欄中的“FL1INTLOG”,在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“CD3-FITC”；選擇“FL2INTLOG”，在對(duì)應(yīng)的“Stain”欄中輸入“CD16+56-PE”，單擊“OK”；M單擊菜單欄“File”→“SaveProtocolAs…”，在彈出的對(duì)話框中輸入“2CLymCD3-16+56”，單擊“Save”。4.建立實(shí)驗(yàn)組合（Panel）A單擊菜單欄“File”→“New”→“NewPanel…”，在彈出的對(duì)話框中“PanelName”欄中輸入組合名稱“2CLym”，在“NoofTest”欄中輸入“5”（表示為5個(gè)檢測(cè)管做組合），在“ExporttheresultsofthispaneltotheReportGenerator”單擊“Next”；B在新彈出的窗口設(shè)置第1管檢測(cè)選項(xiàng)：選擇“Useplotsandgatsfromprotocol”，在其下拉方案中選擇“2CLymisotype.PRO”，選擇“UseInstrumentSettings”和“UseRegionsfromthisprotocol”，點(diǎn)擊“Next”;C在新彈出的窗口設(shè)置第2管檢測(cè)選項(xiàng)：選擇“Useplotsandgatsfromprotocol”，在其下拉方案中選擇“2CLymCD3-19.PRO”，選擇“Useinstrumentsettingsfromprevioustest”和“UseRegionsfromthisprotocol”，點(diǎn)擊“Next”;D其余3管分別在下拉方案中選擇“2CLymCD3-4.PRO”、“2CLymCD3-8.PRO”、“2CLymCD3-16+56.PRO”，其余的選項(xiàng)不變，最后點(diǎn)擊“Finish”5.數(shù)據(jù)獲取條件設(shè)定：A在“File”“WorkspacePreferences”，彈出對(duì)話框中選“LMDFileName”選項(xiàng)卡，選擇“SampleID1”、“SampleID2”、“Y2KDate”、“TagNumber”和“Starteachpanelat001”，點(diǎn)擊“OK”B點(diǎn)擊“View”“CustomizeWorklistColumns”在彈出對(duì)話框中選擇選擇“Panl”、“Protocol”、“RegionSource”、“Cytocytings”、“TubID”、“CarouselNo”、“l(fā)ocation”、“SampleID1”、“SampleID2”，點(diǎn)擊“OK”C獲取停止條件設(shè)定：選擇工具欄中的“”在“AcquisitionSetup”選項(xiàng)卡中完成①設(shè)置獲取時(shí)間：“Limits”中點(diǎn)擊“SetTimes”，在彈出的對(duì)話框中的將“AcquisitionTime(s)”設(shè)為300；“ElapsedTime(s)”設(shè)為500②細(xì)胞總數(shù)設(shè)定：在“Limits”中的“MaximumEvents”（總細(xì)胞數(shù)）設(shè)定為100000③門內(nèi)細(xì)胞數(shù)設(shè)定：即設(shè)定某一群細(xì)胞獲取一定數(shù)量后停止。如我們?cè)O(shè)定獲取淋巴細(xì)胞2000停止，在方案右鍵點(diǎn)擊中任何一張Gating到淋巴細(xì)胞的圖形上。本實(shí)驗(yàn)在FL1/FL2的散點(diǎn)圖上點(diǎn)擊右鍵，選擇“Format”，彈出對(duì)話框中選擇“StopandSave”選項(xiàng)卡，在“UseStopCondition”前打√，在“MaximumEvents”處設(shè)定為2000。時(shí)間和細(xì)胞數(shù)三個(gè)限制同時(shí)設(shè)定，最先滿足任一條件即停止獲??；D單擊，在“SetupMode”前打“√”，在“Baselineoffset”前不打“√”，將樣本管充分混勻，置上樣盤某一位置，在軟件下方“AcquisitionManager”輸入1號(hào)樣本管所在轉(zhuǎn)盤號(hào)，如“1”和位置，如“1”；E設(shè)定閾值：在“AcquisitionSetup”選項(xiàng)卡中設(shè)定閾值，扣除碎片。通常以FS為閾值，設(shè)定為100，該參數(shù)可根據(jù)點(diǎn)圖中碎片的多少進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，在保證目的細(xì)胞群完整的前提下，盡量扣除碎片。注意：到此處為止，所有的實(shí)驗(yàn)方案、進(jìn)樣工作組都已經(jīng)設(shè)置完畢，如果之后要進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)，可以直接調(diào)用該方案，不必重復(fù)設(shè)置。調(diào)用原有的實(shí)驗(yàn)方案：從File中點(diǎn)擊openprotocal→打開適合的實(shí)驗(yàn)方案→再點(diǎn)擊File→Saveprotocalas重新保存到最新日期文件夾中；新建進(jìn)樣工作組：點(diǎn)擊Newworklist“”，再點(diǎn)擊“”添加樣品管(樣品管可自行命名，比如：sampleID1:學(xué)生名，sampleID2：熒光燃料名稱)，按編號(hào)1、2、3、、、、依次將樣品管放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的測(cè)樣卡槽中。F單擊，儀器自動(dòng)從第一個(gè)樣品開始檢測(cè)，第一個(gè)樣品為同型對(duì)照（有些是純陰性對(duì)照）。（請(qǐng)同學(xué)們思考：同型對(duì)照或純陰性對(duì)照起什么作用？準(zhǔn)備同型對(duì)照樣品或純陰性對(duì)照要注意哪些事項(xiàng)？需要利用同型對(duì)照調(diào)節(jié)儀器的哪些參數(shù)？）單擊“Cytometercontrol”，進(jìn)行參數(shù)條件設(shè)置，電壓調(diào)節(jié)：?jiǎn)螕簟癡olts”，調(diào)節(jié)FS和SS的電壓（Volts）和增益（Gain）（如下圖A和B；或選中“CytometerControl/AcquisitionSetup”中“QuickSet”,用圖形的快速滾動(dòng)條調(diào)節(jié)）使SS/FS散點(diǎn)圖分群清晰，分布良好，調(diào)節(jié)A門位置，使其圈定淋巴細(xì)胞（如下圖C和D）。調(diào)節(jié)FL1和FL2電壓，使FL1/FL2點(diǎn)圖中的細(xì)胞群體位于左下象限，點(diǎn)擊，保存實(shí)驗(yàn)條件。去掉“SetupMode”前“√”，收集數(shù)據(jù)。ABCDG1號(hào)樣本管收集結(jié)束，自動(dòng)檢測(cè)2號(hào)管，(請(qǐng)同學(xué)們思考：為什么以CD3-FITC/CD19-PE做第二個(gè)樣品？它起什么作用？用它來對(duì)儀器調(diào)節(jié)什么？)在“SetupMode”和“QuickComp”前打“√”，在“Baselineoffset”前不打“√”。熒光散點(diǎn)圖上出現(xiàn)快速調(diào)節(jié)滾動(dòng)條，直接拉動(dòng)垂直滾動(dòng)條，調(diào)節(jié)FL2-FL1%的補(bǔ)償，使FITC單陽(yáng)細(xì)胞落到右下象限，使B3和B4區(qū)內(nèi)細(xì)胞群平均熒光強(qiáng)度Y-Mean一致（差值<0.1）。拉動(dòng)水平滾動(dòng)條，調(diào)節(jié)FL1-FL2%的補(bǔ)償，使PE單陽(yáng)細(xì)胞群落到左上象限，使B1和B3區(qū)內(nèi)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度X-Mean一致（差值<0.1），點(diǎn)擊，保存條件。在“Baselineoffset”前打“√”，收集數(shù)據(jù)，到淋巴細(xì)胞2000，自動(dòng)停止。H2號(hào)樣本管數(shù)據(jù)收集完畢，儀器按照當(dāng)前的參數(shù)條件，自動(dòng)依次收集3、4、5號(hào)樣本管數(shù)據(jù)。5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)報(bào)告設(shè)置A打開Gallios軟件，選擇“WorkOffline”，進(jìn)行脫機(jī)分析。選擇“File”“New”“NewProtocol”，單擊工具欄中的（ColorDotPlot）鍵，畫SS/FS和FL1/FL2散點(diǎn)圖。在SS/FS上作多邊形門A，在FL1/Fl2上做十字門并Gating到門A。B創(chuàng)建FLOWPAGE：①選擇工具欄或者“Insert”“BlankFlowPAGE”②鼠標(biāo)左鍵選中以上繪制好的參數(shù)圖，拖到FlowPAGE上③選擇“Insert”“FlowPAGETextbox”，在FlowPAGE上預(yù)定輸入文本的位置點(diǎn)擊鼠標(biāo)左鍵，鍵入文本。C在右側(cè)的資源導(dǎo)航欄“ResourceExplorer”，點(diǎn)擊，之后點(diǎn)擊登陸用戶名的文件夾如“user”，即顯示所有收集的數(shù)據(jù)。左鍵點(diǎn)擊“2CISOTYPE001.LMD”，拖到散點(diǎn)圖上。調(diào)整A門圈淋巴細(xì)胞，沿陰性細(xì)胞群邊緣調(diào)節(jié)十字門位置。單擊，在彈出的對(duì)話框中選擇“AnalysisProtocol”文件夾，為方案命名（2CLymANA.PRO），點(diǎn)擊“Save”保存方案D按上述步驟依次代入分析第2、3、4、5管數(shù)據(jù)，F(xiàn)Lowpage圖形自動(dòng)更新注意：FlowPage上的圖形和工作區(qū)中的圖形是同步的，所以當(dāng)您拖曳一個(gè)新的LMDData到工作區(qū)時(shí)，打印頁(yè)中的圖形也會(huì)隨之更新注意：不推薦學(xué)生們?cè)诰€上使用該工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以免占用機(jī)時(shí)，或造成工作站不穩(wěn)定。對(duì)今后使用儀器獲得數(shù)據(jù)的學(xué)生，另行拷貝Ka