PCR技術(shù)及測序課件

PCR技術(shù)及原理PCR技術(shù)及原理1PCR反應(yīng)原理PCR技術(shù)是利用DNA在體外高溫時破壞氫鍵，變性成單鏈，低溫時引物與單鏈按堿基配對原則結(jié)合，再調(diào)溫至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5′-3′）的方向合成互補鏈。即：

復(fù)性延伸變性PCR反應(yīng)原理PCR技術(shù)是利用DNA在體外高溫時破壞氫鍵，變2PCR反應(yīng)過程PCR反應(yīng)過程3熒光定量PCR熒光定量PCR是在一般PCR擴增反應(yīng)進行的同時加入特異性熒光探針（寡核苷酸）兩段分別標(biāo)記一個熒光基團和一個淬滅基團，探針完整時熒光基團發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收，擴增時Taq聚合酶5′-3′外切酶活性將熒光基團酶切降解，使之分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)收到熒光信號。每擴增一條DNA鏈就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與產(chǎn)物形成完全同步。熒光定量PCR4基因測序技術(shù)1.第一代：Sanger鏈終止法、Gilbert化學(xué)降解法2.第二代：454、Illumina、SOLiD3.第三代：HelicoBioSciencePacificBioscienceSMRTTOxfordNanoporeTechnologiesIonTorrent基因測序技術(shù)5Sanger鏈終止法測序原理由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP，ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。Sanger鏈終止法測序原理由于ddNTP的2’和3’都不含6Gilbert化學(xué)降解法測序原理用特異的化學(xué)試劑修飾DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈。該法設(shè)計四組特異的反應(yīng)：①G反應(yīng)，用硫酸二甲酯使鳥嘌呤上的N7甲基化，加熱引起甲基化鳥嘌呤脫落，導(dǎo)致多核苷酸鏈可在該處斷裂；②G+A反應(yīng)，用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂；③T+C反應(yīng)，用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基；④C反應(yīng)，在有鹽存在時，只有C與肼反應(yīng)，并被哌啶除去。這樣一來，同一個末端標(biāo)記的DNA片段在四組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別得到部分降解，每一組反應(yīng)特異地針對某一種或某一類堿基，生成四組放射性標(biāo)記的分子，從共同起點（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點，每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。最后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離此后組產(chǎn)物，再從放射自顯影片上即可讀出序列。Gilbert化學(xué)降解法測序原理用特異的化學(xué)試劑修飾DNA分7454測序1.文庫制備：454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性后用雜交引物進行PCR擴增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫454測序1.文庫制備：454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和ill8454測序2.乳液PCR：將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反應(yīng)空間以進行DNA擴增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”（水包油），基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個磁珠。這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結(jié)合在磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，所以保證了每個與磁珠結(jié)合的小片段都能獨立進行PCR擴增，并且擴增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反應(yīng)完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來。進過擴增，每個小片段都將被擴增約100萬倍，從而達(dá)到下一步測序所要求的DNA量。454測序2.乳液PCR：將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直9454測序3.焦磷酸測序：測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法來固定每個磁珠的位置，以便檢測接下來的測序反應(yīng)過程。測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測序反應(yīng)。測序反應(yīng)以磁珠上大量擴增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時由PTP板另一側(cè)的CCD照相機記錄，最后通過計算機進行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果。由于每一種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來判斷被測分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測序反應(yīng)進入下一個循環(huán)。454測序3.焦磷酸測序：測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合10Illumina測序1.文庫構(gòu)建：利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫。2.Flowcell:當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時候會隨機附著在flowcell表面的channel上。每個Flowcell有8個channel，每個channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對，并能支持DNA在其表面進行橋式PCR的擴增。Illumina測序1.文庫構(gòu)建：利用超聲波把待測的DNA樣11Illumina測序3. 橋式PCR擴增與變性：橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增。經(jīng)過不斷的擴增和變性循環(huán)，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個束都含有單個DNA模板的很多份拷貝，進行這一過程的目的在于實現(xiàn)將堿基的信號強度放大，以達(dá)到測序所需的信號要求。4.測序：向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測序法）。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP3’-OH保護基團，以便能進行下一輪的測序反應(yīng)。Illumina測序3. 橋式PCR擴增與變性：橋式PCR以12SOLiD測序1.文庫構(gòu)建：片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。2.EmulsionPCR：Solid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsionPCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um。在擴增的同時對擴增產(chǎn)物的3’端進行修飾，這是為下一步的測序過程作的準(zhǔn)備。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域。3.連接酶測序：Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3’-XXnnnzzz-5’。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5’末端分別標(biāo)記了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨特測序法，兩個堿基確定一個熒光信號，相當(dāng)于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時，就會發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號后，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進行切割，這樣就能移除熒光信號，以便進行下一個位置的測序。不過值得注意的是，通過這種測序方法，每次測序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在測到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n-1進行第二輪測序。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個堿基（圖6-a.8）。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測序位置往3’端移動一個堿基位置，因而就能測定第0、1位和第5、6位……第二輪測序完成，依此類推，直至第五輪測序，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了兩次。SOLiD測序1.文庫構(gòu)建：片段打斷并在片段兩端加上測序接頭13SOLiD測序示意圖SOLiD測序示意圖14PCR技術(shù)及測序ppt課件15HelicoBioScience該測序是基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在3'末端加上poly(A),以及在poly(A)的末端進行熒光標(biāo)記和阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測序的位點加入聚合酶和被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀測模板位點上是否有熒光信號，然后化學(xué)裂解核苷酸上的燃料并釋放。加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進行下一輪反應(yīng)。HelicoBioScience16PacificBioscienceSMRTT該測序也是基于邊合成邊測序的原理，這項技術(shù)使用Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零級波導(dǎo))。測序的過程：被熒光標(biāo)記磷酸基團的核苷酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結(jié)合（每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標(biāo)記），被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標(biāo)記的磷酸集團被切割并釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個位置，下一個脫氧核苷酸連接到位點上開始釋放熒光脈沖，進行下一個循環(huán)。PacificBioscienceSMRTT該測序也是基于17OxfordNanoporeTechnologies大多數(shù)納米孔測序技術(shù)的基本原理是當(dāng)DNA分子或者它的組成堿基從一個孔洞經(jīng)過時而檢測到被影響的電流或光信號。OxfordNanopore測序技術(shù)是以α-溶血素來構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側(cè)的外表面，一種合成的環(huán)糊精做為傳感器共價結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面。這個系統(tǒng)被鑲嵌在一個脂雙分子層內(nèi)，為了提供既符合堿基區(qū)分檢測又滿足外切酶活性的物理條件，脂雙分子層兩側(cè)為不同的鹽濃度在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了流過納米孔原本的電流，腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號大小很相近，但胸腺嘧啶在環(huán)糊精停留是時間是其他核苷酸的2-3倍，所以每個堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開來。OxfordNanoporeTechnologies18納米孔測序納