ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題分析

ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題分析異常結(jié)果描述原因分析對策白板顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色。試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用檢查試劑的組分及批號，確認(rèn)未過期以及所有組分均屬對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。錯(cuò)加、漏加試劑底物、顯色劑A或B嚴(yán)格按說明書的步驟操作，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現(xiàn)象。洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈。終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜锞彌_液配制每次配制時(shí)都應(yīng)看清標(biāo)簽標(biāo)明物質(zhì)蒸餾水有問題確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未污染，與好蒸餾水比較。顯色弱、靈敏度低實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，包括陽性對照、質(zhì)控在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。試劑盒超過期，超過有效期的產(chǎn)品可能會(huì)產(chǎn)生很弱的信號；試劑盒沒有按規(guī)定進(jìn)行保存，受高溫影響；實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號，確認(rèn)試劑未過期。不要將試劑盒長時(shí)間置于常溫下，按使用規(guī)定儲藏。試劑、樣品用前未平衡至室溫從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡20分鐘左右。加入試劑的體積和時(shí)間有誤，移液器計(jì)量不準(zhǔn)，吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔；確定所使用的試劑體積正確，加入時(shí)間適當(dāng)。校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合。移液不宜太快，排放應(yīng)完全。洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈，確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未受污染。孵育時(shí)間及孵育溫度未達(dá)到要求，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱時(shí)注意溫度并及時(shí)調(diào)整。孵育溫度應(yīng)控制在37-38℃，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說明書操作。保溫期內(nèi)不宜多開門，以免影響保溫。洗板次數(shù)過多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求；洗滌沖擊力太大。浸泡時(shí)間太長；嚴(yán)格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，減小洗滌沖擊力，按說明書要求置留洗滌液時(shí)間和洗滌次數(shù)。顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入；顯色劑滴瓶垂直向下，持力均勻，滴速不宜過快，先加顯色劑A，后加顯色劑B，不可將A、B液混合后加入底物作用時(shí)間不夠；準(zhǔn)確定時(shí)。蒸餾水水質(zhì)有問題；測定蒸餾水配制試劑對酶免疫法的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，陰陽性對照正常，質(zhì)控正常，但臨床標(biāo)本感覺顯色較弱待測標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本，故結(jié)果可能是正常的如有懷疑，可復(fù)檢標(biāo)本加入疊氮鈉作為防腐劑酶免實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用proclin、硫柳汞等其他防腐劑陰陽性對照正常，但質(zhì)控、參考品或個(gè)別弱陽性標(biāo)本未能檢出。未達(dá)要求的孵育溫度及孵育時(shí)間可檢出強(qiáng)陽性標(biāo)本，但質(zhì)控或弱陽性標(biāo)本受溫度變化影響較大而被未檢出質(zhì)控品或標(biāo)本避免反復(fù)凍融。標(biāo)本在一周內(nèi)使用的，可存于2-8℃，如需長期保存，應(yīng)置于-20℃以下保存。質(zhì)控品應(yīng)小量分裝，并置于-20℃以下保存。質(zhì)控品或標(biāo)本高溫放置過久，或被反復(fù)凍融致待測物滴度下降，而未能檢出重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配。儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配靈敏度過高、板底高、高背景終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或陰陽性對照、質(zhì)控正常，標(biāo)本陰性標(biāo)本OD值過高。整板的黃板現(xiàn)象可能是由于錯(cuò)加其他試劑造成，如同時(shí)操作兩對半試劑時(shí)，測HbsAb板用于測HBsAg等；實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號，確認(rèn)所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用酶標(biāo)對吸頭的污染以及對盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現(xiàn)象；避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈顯色劑在光照條件下放置過久，實(shí)驗(yàn)前已變藍(lán)顯色劑A、B未使用前避光保存孵育溫度過高或孵育時(shí)間過長；孵育溫度應(yīng)控制在37-38℃，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說明書操作。未按要求洗板。特別是洗滌時(shí)每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現(xiàn)象嚴(yán)格按說明書要求洗板花板，一般是由于臨床標(biāo)本的收集、處理和保存方法不當(dāng)造成放置時(shí)間（自然放置1~2h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）、離心時(shí)間（15min）應(yīng)引起注意。出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象樣品離心不完全，反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分；充分離心，3000rpm6分鐘以上。加樣時(shí)交叉污染；加標(biāo)本時(shí)盡量避免交叉污染。如盛標(biāo)本的試管周圍常有血痂，易脫落，應(yīng)遠(yuǎn)離酶標(biāo)板。手工洗板造成的交叉污染手工洗板時(shí)前3次注洗液后應(yīng)立即棄去，后幾次再設(shè)定浸泡時(shí)間，可減少交叉污染洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔疏通加液頭，使洗板時(shí)每孔均注滿洗液，吸液時(shí)殘留量要小。拍板時(shí)交叉污染洗板完畢拍板時(shí)用合適的吸水紙巾，不要把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。假陽性假陽性現(xiàn)象是一個(gè)綜合現(xiàn)象，可參考上文“靈敏度過高、板底高、高背景”中的分析。這里只列舉常見的原因及對策。計(jì)算Cutoff值時(shí)使用的公式不正確，導(dǎo)致計(jì)算得出的CutOff值過低，從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性CutOff值計(jì)算公式應(yīng)嚴(yán)格參照所屬產(chǎn)品的說明書，應(yīng)注意各個(gè)酶免產(chǎn)品的Cutoff值計(jì)算公式不盡相同洗板時(shí)未能注滿洗液或洗板次數(shù)、浸泡時(shí)間不夠，洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留導(dǎo)致花板、跳孔，假陽性增多嚴(yán)格按說明書要求洗板。調(diào)整洗板機(jī)時(shí)，應(yīng)注意有時(shí)儀器標(biāo)示的液量與實(shí)際液量并不相符，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整至每孔注滿。血清標(biāo)本處理不當(dāng)，如未除去細(xì)胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物可出現(xiàn)孔底由變藍(lán)的跳孔現(xiàn)象，此標(biāo)本重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往是陰性；放置時(shí)間（自然放置1~2h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）、離心時(shí)間（15min）應(yīng)引起注意廠家試劑質(zhì)量的變化造成國家標(biāo)準(zhǔn)要求提高靈敏度時(shí)，廠家試劑靈敏度也相應(yīng)提高，假陽率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的水質(zhì)問題防止蒸餾水污染加酶量過多（如50uL誤認(rèn)為100uL）或丙肝酶稀釋時(shí)加量過多加酶前檢查移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確，稀釋酶時(shí)思想要集中培養(yǎng)箱溫度超過37℃或酶結(jié)合物反應(yīng)時(shí)間或底物顯色時(shí)間超過放入板以前要檢查培養(yǎng)箱的溫度，準(zhǔn)確定時(shí)底物配制時(shí)間過長、或底物污染底物應(yīng)在酶反應(yīng)完畢即將洗滌前5分鐘配制，注意避光該批樣品放置時(shí)間過長，樣品污染樣品應(yīng)保持新鮮，或低溫保存，防止污染移液嘴重復(fù)使用，未洗凈或消毒不完全而用于加酶或底物移液嘴盡可能一次性使用重復(fù)性差1、樣品數(shù)量不一，加樣時(shí)間長短不一重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與第一次接近2、樣品加入后未混勻加樣后在混勻器上充分混勻3、酶標(biāo)儀濾光片不對或輸入波長不對TMB顯色用450/630波長4、酶標(biāo)儀測定重復(fù)性差校對酶標(biāo)儀5、洗滌不正確洗滌液注滿各孔但不要溢出。洗板時(shí)反應(yīng)板面向下，垂直用力甩凈內(nèi)容物（可多甩幾次），在干凈、無或少塵的吸水材料上拍干。洗板機(jī)洗板時(shí)不應(yīng)有堵孔，洗滌應(yīng)充分6、溫育條件不一致（一次用水育，一次用恒溫箱）恒溫箱溫育較水浴顯色深，OD值高出0.1-0.15,最好均