免疫學技術(單抗的制備)課件

免疫學技術—單克隆抗體的制備1123單克隆抗體單克隆抗體的定義單克隆抗體制備原理單抗制備方法及步驟4制備過程中注意事項、優(yōu)缺點及其應用5單抗的改進21單克隆抗體的定義3定義動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，具有不同基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應B細胞（漿細胞）和記憶B細胞，大量的漿細胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個制造一種專一抗體的漿細胞進行培養(yǎng)，就可得到由單細胞經(jīng)分裂增殖而形成細胞群，即單克隆。單克隆細胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。4

1975年Kohler&Milstein創(chuàng)立單克隆抗體技術，獲得1984年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎

創(chuàng)立者：5單抗概況1975年分子生物學家G.J.F.

Kohler和C.Milstein在細胞雜交技術的基礎上，創(chuàng)建立雜交瘤技術，使經(jīng)綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠的脾細胞，與小鼠的骨髓瘤細胞融合，并由此創(chuàng)建了第一個B細胞雜交瘤細胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。這是免疫學乃至醫(yī)學史上的一個里程碑。6單抗特點

一是特異性，針對特定的單一抗原表位，它具有高度的特異性，抗腫瘤抗體藥物的研究表明，其特異性主要表現(xiàn)為特異性結(jié)合、選擇性殺傷靶細胞、體內(nèi)靶向性分布以及具有更強的療效。二是多樣性，主要表現(xiàn)在靶抗原的多樣性、抗體結(jié)構(gòu)的多樣性、作用機制的多樣性等方面。三是定向性，抗體藥物可以定向制造，就是根據(jù)需要制備具有不同治療作用的抗體藥物?；谶@些特點，我們可以用來制成“生物導彈”運送藥物至病害部位，主要是癌細胞，從而達到治療效果。72單克隆抗體制備原理8原理9制備流程圖10制備流程113單抗制備方法及步驟12制備步驟1.致敏淋巴細胞的準備2.骨髓瘤細胞的準備3.飼養(yǎng)層細胞的準備4.細胞融合5.選擇性培養(yǎng)6.特異性抗體的檢測7.雜交瘤細胞的克隆化8.雜交瘤的凍存和復蘇9.單克隆抗體的大量制取10.單克隆抗體的純化13完全抗原：病毒、細菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于5000Da生物物質(zhì)半抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于5000Da物質(zhì)（半抗原需與BSA、OA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動物產(chǎn)生可應用的高效價的抗體）動物選擇：選擇體重18－20gBALB/C雌性小鼠，用制備抗原免疫。抗原免疫：方式——體內(nèi)、體外劑量——0.5-100g次數(shù)——視抗原而定間隔——視抗原而定佐劑——視抗原而定收集時間：末次加強免疫后72-96h收集步驟一致敏淋巴細胞的準備14常用骨髓瘤細胞系：SP2／0、NS1、P3.653融合時骨髓瘤細胞的選擇：a.處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于95％b.細胞株保持HGPRT（次黃嘌呤尿嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶）缺陷狀態(tài)步驟二骨髓瘤細胞的準備15常用飼養(yǎng)細胞：小鼠腹腔巨噬細胞，小鼠脾細胞，小鼠或大鼠胸腺細胞等。飼養(yǎng)細胞主要作用：可能在培養(yǎng)液中釋放某種生長刺激因子；滿足新生細胞對細胞密度的依賴性;減少聚苯乙烯培養(yǎng)板孔對新生細胞的毒性等步驟三飼養(yǎng)層細胞的準備16方法：電融合激光融合離心融合滅活的病毒融合

聚乙二醇融合法SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2～5步驟四細胞融合17步驟五選擇性培養(yǎng)HAT選擇培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA18HAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻19對檢測方法的要求：靈敏度高特異性強簡便快速常用檢測方法：ELISA、免疫熒光法步驟六特異性抗體的檢測20ELISA原理：將抗原包被于酶標板，與待檢雜交瘤細胞上清液反應，如該上清液中含有特異性的抗體（一抗Ab），即可與酶標二抗作用，加底物經(jīng)酶催化呈現(xiàn)顏色反應，通過檢測OD值判定結(jié)果。ELISA21目的：建立單一細胞克隆方法：有限稀釋法，顯微操作法，軟瓊脂培養(yǎng)法，F(xiàn)ACS法克隆建立的標準：連續(xù)兩次以上100%陽性孔步驟七雜交瘤細胞的克隆化22篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株。用HT培養(yǎng)液稀釋，使細胞濃度為50～60個/mL，于96孔培養(yǎng)板中每孔加0.1mL(五六個細胞/孔)。接種2排，剩余細胞懸液用HT培養(yǎng)液作倍比稀釋，再接種2排，如此類推，直至使每孔含0.5～2個細胞。按Poisson法計算，應有36％的孔為1個細胞/孔。培養(yǎng)7～10d后，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，爾后進行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養(yǎng)或凍存。有限稀釋法23特點：不需任何特殊設備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法有限稀釋法24將細胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個細胞的線形液滴，在萊塞光激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光，此信號由光電倍增管接收，再結(jié)合細胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號并與預定的信號對比，根據(jù)細胞熒光強度及細胞大小不同，將細胞分成不同級別，在電場中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中。FACS法效率最高價格昂貴25凍存：慢凍，分步凍存，室溫→-20℃→-70℃→液氮意義：防止污染及變異避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡復蘇：快融，取出立即浸入37-40℃水浴中，使其迅速融化步驟八雜交瘤的凍存和復蘇26動物體內(nèi)誘生：腹腔接種體外細胞培養(yǎng)：單層細胞培養(yǎng)法，懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，細胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)步驟九單克隆抗體的大量制取27取BALB/C雌性小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。腹腔接種28總體上講，雜交瘤細胞系并不是嚴格的貼壁依賴細胞，因此既可以進行單層細胞培養(yǎng)，又可以進行懸浮培養(yǎng)。雜交瘤細胞的單層細胞培養(yǎng)法是各個實驗室最常用的手段，即將雜交瘤細胞加入培養(yǎng)瓶中，以含10-15%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞濃度以1×106-2×106/ml為佳，然后收集培養(yǎng)上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。目前在雜交瘤細胞的大量培養(yǎng)中，主要有兩種類型的培養(yǎng)系統(tǒng)。其一是懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式的生物反應器，其中包括使用微載體；其二是細胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，包括中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。近來的研究表明，微載體培養(yǎng)法是雜交瘤細胞大量培養(yǎng)的理想途徑之一。體外細胞培養(yǎng)291.辛酸硫酸銨沉淀法原理：先加正辛酸沉淀雜蛋白，后加硫酸銨沉淀抗體。特點：成本較低，操作簡單；抗體活性損失??；抗體純度高；抗體回收率低；需要高速冷凍離心機。步驟十單克隆抗體的純化302親和層析法：原理：利用蛋白A或蛋白G通過共價鍵聯(lián)接到活化的固相載體上，吸附抗體，然后采用改變pH值的方法將抗體洗脫分離。特點：抗體純度高；純化速度快；抗體回收率低；抗體活性有損失；成本高，費用大。314制備過程中注意事項、優(yōu)缺點及其應用32用于免疫的動物，應選擇與親本骨髓瘤細胞同一品系的動物抗原免疫用的抗原盡量設法提高其純度，并保存其活性融合劑PEG對細胞有毒性，一般采用分析純規(guī)格。濃度越高，對細胞的毒性越大注意事項33操作中的污染，污染是雜交瘤技術中最常遇到的問題，它往往可使一個即將建株的細胞毀于一旦。雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細胞。免疫多次的多為IgG。注意事項34優(yōu)點：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導向治療局限性：

固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應強度不如多克隆抗體制備技術復雜、費時費工、價格較高單克隆抗體的優(yōu)缺點351.作為親合層析的配體單克隆抗體能與其相應的抗原特異性結(jié)合，因而能夠從復雜系統(tǒng)中識別出單個成分。只要得到針對某一成分的單克隆抗體，利用它作為配體，固定在層析柱上，通過親合層析，即可從復雜的混和物中分離、純化這一特定成分。與其它提取方法(沉淀法、高效疏水色譜法等)相比，具有簡便、快速、經(jīng)濟、產(chǎn)品活性高等優(yōu)點。單克隆抗體的應用362.作為生物治療的導向武器脂質(zhì)體是由既親水又親油的兩親磷脂組成的連續(xù)雙分子層微囊，內(nèi)含水相空間，可包裹水溶性物質(zhì)。包有細胞毒劑的脂質(zhì)體膜上偶聯(lián)抗體，可定向攻擊靶細胞，稱為免疫脂質(zhì)體。這種“導向治療”，在動物試驗與體外試驗中已獲得滿意效果。另外，可將化療藥物、細菌毒素、植物毒素或放射性同位素等細胞毒劑與抗腫瘤抗原的單克隆抗體直接交聯(lián)，利用其導向作用，使細胞毒劑定位于腫瘤細胞把它直接殺傷。這不僅提高了抗體的療效，也可降低細胞毒劑對正常細胞的毒性反應。如應用抗T細胞單抗和柔紅霉素結(jié)合物，在體外對非T淋巴細胞就無殺傷作用。但是，要把這種方法應用于臨床，目前還存在不少技術難關，包括人體對鼠源單抗的排異問題等。單克隆抗體的應用373.作為免疫抑制劑抗人T淋巴細胞單抗(McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應。其作用機理有賴于McAb的種類及其免疫學特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應。此外，對用于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經(jīng)抗T細胞單抗加補體處理，能減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。單克隆抗體的應用384作為研究工作中的探針單克隆抗體只與抗原分子上某一個表位(即抗原決定簇)相結(jié)合，利用這一特性就可把它作為研究工作中的探針。此時，可以從分子、細胞和器官的不同水平上，研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關系，進而并可從理論上闡明其機理。如用熒光物質(zhì)標記單抗作為探針，能方便地確定與其結(jié)合的相應生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、酶等)在細胞中的位置和分布。單克隆抗體的應用396.作為醫(yī)學檢驗試劑(1)診斷各類病原體這是單抗應用最多的領域，已有大量診斷試劑商品供選擇。(2)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原的檢測用于腫瘤的診斷、分型及定位。盡管目前尚未制備出腫瘤特異性抗原的單抗，但對腫瘤相關抗原的單抗早就用于臨床檢驗。(3)檢測淋巴細胞表面標志用于區(qū)分細胞亞群和細胞的分化階段。(4)機體微量成分的測定應用單抗結(jié)合其它技術，可對機體的多種微量成分進行測定。單克隆抗體的應用405單克隆抗體的改進41絕大多數(shù)的mAb是用小鼠開發(fā)的，雖然可作為研究和診斷的工具，但它們至少在一定程度上不是理想的治療劑，因為他們在人類中有免疫原性。也就是說，小鼠抗體引入到病人體內(nèi)，將被病人的免疫系統(tǒng)識別為外源物質(zhì)，并將發(fā)生有損治療抗體利用的人抗鼠抗體（HAMA）應答產(chǎn)生原因42鼠的抗體可被修飾成遺傳上更接近人的抗體。特別是鼠的IgG重鏈和鼠的輕鏈的恒定區(qū)在DNA水平上可以用人IgG1重鏈和輕鏈的恒定區(qū)所取代，以創(chuàng)建一個只有可變區(qū)（V）來源于鼠類的嵌合抗體。這明顯地降低但并沒有消除此抗體的免疫原性。另一種方法包括測定小鼠抗體重鏈和輕鏈的V區(qū)序列，然后將這些鏈的高變區(qū)的DNA序列插入人的IgG重鏈和輕鏈基因中。這樣產(chǎn)生的抗體95％是人的，僅結(jié)合區(qū)是源于鼠的。單克隆抗體的人源化和嵌合體嵌合抗體人源化抗體4344通過人的B細胞和骨髓瘤細胞融合，已經(jīng)制成了人的抗體，雖然這曾是十分困難的，并且通常在融合前需要用EB病毒感染以無限增殖B細胞。這種方法由于使用病毒而不理想，產(chǎn)生的mAb的特異性是有限的，抗體