實驗二基因克隆一

實驗二基因克隆一第1頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康恼莆栈蚪MDNA制備的原理和方法了解DNA限制性內(nèi)切酶作用特點和酶切消化的操作步驟第2頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理1.基因組DNA的提取和純化

真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu)第3頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分離、純化原則保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性；排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染；無雜核酸分子的污染（如純化DNA分子時應(yīng)去除RNA分子）；第4頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月基因組DNA制備的基本思路勻漿組織，破碎細胞去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子沉淀核酸去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)純化干燥溶解第5頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白酶K和SDS破碎細胞

在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分子分離，EDTA抑制細胞中DNase活性，蛋白酶K將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。酚/氯仿抽提去除與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)

酚是很強的蛋白質(zhì)變性劑，氯仿能加速有機相與水相分離，溶解去除殘留的酚，且可以去除蔗糖等，在氯仿中加入少量異戊醇可減少蛋白質(zhì)變性過程中產(chǎn)生的大量氣泡。乙醇和醋酸鉀沉淀核酸核酸為水溶性，在有機溶劑和高鹽存在下，核酸在水中的穩(wěn)定性被破壞，呈不溶狀態(tài)而沉淀下來。第6頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項盡量在低溫下進行操作；避免物理因素對核酸的機械剪切；防止過酸、過堿引起核酸降解，控制pH值范圍（pH值5-9），并要保持一定離子強度；防止核酸的生物降解；細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。因此，所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。進行核酸分離時最好新鮮生物組織或細胞樣品，若不能馬上進行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70℃冰箱中。第7頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月2.DNA限制性內(nèi)切酶酶切分析第8頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程第9頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC18的酶切圖譜第10頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的限制性內(nèi)切酶酶一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶；來源于原核生物，功能類似高等動物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲；水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵；第11頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性內(nèi)切酶酶分子識別位點切割位點限制作用是否需用ATPⅠ類三亞基雙功能酶二分非對稱至少在識別位點外1000bpYesⅡ類內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)在識別位點中或靠近識別位點無特異性NoⅢ類二亞基雙功能酶5-7bp非對稱在識別位點下游24-26bpYes限制性內(nèi)切酶可分為三類第12頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月Ⅱ類限制性內(nèi)切酶Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'

第13頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的命名法用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱。用一個字母代表菌株或型；如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，例子——HindⅢ：流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d，第三個發(fā)現(xiàn)的酶稱為。第14頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗注意事項限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μgDNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當延長。酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。許多實驗制備的DNA不易于降解，需適當增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則酶活性將受影響。

第15頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳檢測示例第16頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗步驟10*NEBuffer 2uL質(zhì)粒DNA 2uLXbaI 0.5uLSalI 0.5uLH2O 13uL10*BSA 2uLTota