核酸分子雜交與應(yīng)用

核酸分子雜交與應(yīng)用2023/7/141第1頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子雜交：來源相同或不同的DNA甚至DNA與RNA分子變性后，在合適的條件下通過堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交體的過程稱核酸分子雜交(molecularhybridization)。核酸分子雜交技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，也是臨床分子檢驗的重要技術(shù)。2023/7/142第2頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/143第3頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針的標(biāo)記探針(probe)是指用放射性核素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的核酸片段。標(biāo)記物放射性標(biāo)記非放射性標(biāo)記生物素標(biāo)記地高辛標(biāo)記熒光素標(biāo)記2023/7/144第4頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月探針的種類DNA探針：雙鏈或單鏈DNA探針是最常用的核酸探針。長度在幾百堿基對以上。DNA探針又分為：基因組DNA探針：有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針，多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。cDNA探針：以mRNA為模板經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的互補(bǔ)于mRNA的DNA鏈。2023/7/145第5頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月探針的種類DNA探針優(yōu)點：1、一般克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖；2、DNA探針不易降解3、DNA的標(biāo)記方法比較成熟。2023/7/146第6頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月探針的種類RNA探針：可以是標(biāo)記分離的RNA，也可以是重組質(zhì)粒在RNA聚合酶作用下的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。其優(yōu)點是：RNA探針為單鏈，復(fù)雜性低，與靶序列雜交反應(yīng)效率極高因不存在重復(fù)序列，因此特異性高本底低缺點：2023/7/147第7頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月探針的種類寡核苷酸(oligo)探針：由17～50mer組成的短探針。優(yōu)點：可根據(jù)需要人工合成相應(yīng)的序列；因片段短，只有一個核苷酸突變，其Tm值也有明顯變化，特別適用于點突變的檢測雜交速度快特異性強(qiáng)缺點：所帶標(biāo)記物少靈敏度低；片段短雜交體不穩(wěn)定2023/7/148第8頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月探針的標(biāo)記切口平移法標(biāo)記原理：是目前實驗室是最常用的一種脫氧核糖核酸探針標(biāo)記法。利用大腸桿菌DNA聚合酶1的多種酶促活性將標(biāo)記的dNTP摻入新合成DNA鏈中使探針被標(biāo)記。帶缺口(nick)的線狀、超螺旋及環(huán)狀雙鏈DNA均可作為切口平移法的模板。2023/7/149第9頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月DNaseIDNAPolI,α-32P-dNTP2023/7/1410第10頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1411第11頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記步驟1、取1μgDNA溶于少量無菌蒸餾水中2、加入μl10x切口平移緩沖液，混勻

10x切口平移緩沖液

0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mol/LMgSO41mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)500μg/ml牛血清白蛋白2023/7/1412第12頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記步驟3、加入除標(biāo)記核苷酸外的其他三種脫氧核糖核苷酸溶液(也可以是多種標(biāo)記核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。

以下操作要在同位素工作室中有防護(hù)措施的情況下進(jìn)行操作4、加入100μCi(10μl)標(biāo)記的核苷酸溶液。注：應(yīng)貯存在－20oC冰箱中，使用前在室溫下放置15～30分鐘融化。要盡量減少凍融次數(shù)。2023/7/1413第13頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記步驟5、加入無菌蒸餾水，至終體積為46.5μl，混勻6、加入0.5μl稀釋的DNaseI溶液，混勻7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混勻注：以上操作均在冰浴中進(jìn)行8、置14～16oC水浴中保溫1～2小時9、加入2μl0.5mol/LEDTA終止反應(yīng)10、純化標(biāo)記的DNA探針2023/7/1414第14頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月單鏈DNA探針的標(biāo)記2023/7/1415第15頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月探針的標(biāo)記隨機(jī)引物法標(biāo)記原理：隨機(jī)引物是含有各種可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸序列雜交，起到聚合酶促反應(yīng)的引物作用。將待標(biāo)記的探針模板與隨機(jī)引物一起退火，合成標(biāo)記探針。2023/7/1416第16頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1417第17頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記步驟1、冰浴中，在一微量離心管內(nèi)順序加入下列溶液，并混勻

20mmol/LDTT1μl5mmol/LdATP、dGTP、dTTP1μl10x隨機(jī)引物緩沖液1μl

標(biāo)記dCTP3μl

水1μl2023/7/1418第18頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記步驟2、取200ng雙鏈DNA溶于1μl蒸餾水中，在蠟?zāi)ど吓c1μl隨機(jī)引物充分混勻，吸入一毛細(xì)玻璃管中，用火封嚴(yán)兩端。置沸水浴中30分鐘并迅速置冰水浴中1分鐘。將DNA轉(zhuǎn)入上述離心管中3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混勻并離心，室溫反應(yīng)3小時以上2023/7/1419第19頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記步驟4、取10μl終止緩沖液，置－20oC保存?zhèn)溆媒K止緩沖液

50mmol/LTris.Cl(pH7.5)50mmol/LNaCl5mmol/LEDTA0.5%SDS2023/7/1420第20頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月隨機(jī)引物標(biāo)記法特點1、除能進(jìn)行雙鏈DNA標(biāo)記外，也可用于單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記。當(dāng)用RNA為模板是，操作方法同上，但必須采用反轉(zhuǎn)錄酶。2、標(biāo)記活性高，只需25ng樣品DNA，可在3小時內(nèi)使40％～60％以上甚至90％的標(biāo)記dNTP摻入到探針DNA鏈上3、操作方便2023/7/1421第21頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1422第22頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月3’末端標(biāo)記末端標(biāo)記屬于部分標(biāo)記。特點是可得到全長DNA片段，但標(biāo)記活性不高。3’末端標(biāo)記法包括限制酶切和聚合酶合成兩個過程，3’標(biāo)記有兩種方式：大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標(biāo)記法T4DNA聚合酶標(biāo)記法2023/7/1423第23頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標(biāo)記法：標(biāo)記反應(yīng)步驟：(1)在反應(yīng)管中依次加入下列試劑并混勻DNA1μg10xKlenow片段緩沖液2μl2mmol/L3種dNTP(無dATP)1μl[α-32P]dATP30μCi加水至25μl10xKlenow片段緩沖液2μl0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mmol/LMgSO4

1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)500μg牛血清白蛋白2023/7/1424第24頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)加入1單位Klenow聚合酶片段，室溫反應(yīng)30min。(3)加入12μl0.5mol/LEDTA以終止反應(yīng)。酚/氯仿抽提1次。(4)SephadexG－50柱層析或乙醇沉淀法分離標(biāo)記的DNA片段。大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標(biāo)記法：2023/7/1425第25頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項：(1)要根據(jù)不同限制酶產(chǎn)生的不同粘性末端選擇不同的標(biāo)記核苷酸。(2)選擇適當(dāng)?shù)南拗泼讣唉?32P-dNTP,利用DNA聚合酶IKlenow片段的末端填充活性，可以選擇性地將DNA雙鏈之中一條鏈特異地標(biāo)記。(3)此方法不能直接用于3’凸出末端DNA的標(biāo)記。2023/7/1426第26頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月CCTAGGAATTCAATTCCCTAGGEcoRIBamHI加入DNA聚合酶，dNTP(其中一種為標(biāo)記核苷酸)AATTCCCTAGG2023/7/1427第27頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月T4DNA聚合酶標(biāo)記法T4DNA聚合酶具有兩種功能，5’→3’聚合活性和3’→5’外切活性。當(dāng)反應(yīng)體系中缺乏dNTP時，T4DNA聚合酶主要表現(xiàn)為外切酶活性。利用這一特性可產(chǎn)生5’凸出的DNA片段，然后加入dNTP，其中之一為標(biāo)記核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出標(biāo)記探針。2023/7/1428第28頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月T4DNA聚合酶，無dNTP加入dNTP,其中一種為標(biāo)記核苷酸2023/7/1429第29頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記反應(yīng)步驟：(1)在反應(yīng)管中加入下列試劑并混勻DNA0.2~0.5μg1xT4DNA聚合酶緩沖液2μl加水至20μl(2)加入所需的限制酶，并在適當(dāng)條件下溫育(3)加入適量T4DNA聚合酶。(4)當(dāng)切除了所需數(shù)量的核苷酸后，加入1μl2mmol/L四種核苷酸(其中一種為標(biāo)記核苷酸)，37oC保溫一小時。(5)SephadexG－50柱層析或乙醇沉淀法分離標(biāo)記的DNA片段。2023/7/1430第30頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5’末端標(biāo)記標(biāo)記原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使ATP分子上的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5’－OH基團(tuán)上。因此采用γ-32P-ATP為底物，即可將DNA樣品5’端標(biāo)記。但核酸樣品5’端必需是去磷酸的。2023/7/1431第31頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月PP磷酸酶T4多核苷酸激酶ATPPP2023/7/1432第32頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記反應(yīng)步驟：(1)堿性磷酸酶的預(yù)處理：堿性磷酸酶(CIP)硫酸銨懸液4oC下在Eppendorf離心管中離心1分鐘。棄上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一個月以上。(2)將DNA樣品溶解于少量10mmol/Ltris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：2023/7/1433第33頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月10xCIP緩沖液5μlCIP緩沖液適量加水至48μl置37oC30分鐘。加入第二份CIP，繼續(xù)保溫30分鐘，即可脫去5’端磷酸基團(tuán)。0.01U的CIP，可脫去1pmol5’磷酸基團(tuán)(1.6μg4kb線性DNA的5’端數(shù)相當(dāng)于1pmol)。10xCIP緩沖液Tris.Cl(pH9.0)10mmol/LMgCl21mmol/LZnCl210mmol/L亞精胺2023/7/1434第34頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)加入40μlH2O，10μl10xSTE，5μl10％SDS。加熱至68oC，15分鐘。10xSTE

100mmol/LTris.Cl(pH8.0)1mol/LNaCl10mmol/LEDTA酚/氯仿及氯仿各抽提兩次除CIP，SephadexG－50層析脫鹽后乙醇沉淀。取脫鹽后的脫5’磷酸DNA1～50pmol溶于少量水中，然后加入下列試劑進(jìn)行5’末端標(biāo)記：2023/7/1435第35頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月加水至50ul，混勻，37oC保溫1小時。加入2ul0.5mol/LEDTAz終止反應(yīng)，酚/氯仿抽提后乙沉淀。SephadexG－50層析分離后得5’標(biāo)記的DNA探針。γ-32P-ATP50pmol(150uCi)T4多核苷酸激酶10～20U10x激酶緩沖液10ul2023/7/1436第36頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項：(1)T4多核苷酸激酶對多種雜質(zhì)非常敏感，要求必需達(dá)到一定的純度；脫磷酸后要用SephadexG50層析除去小分子及離子。(2)亞精胺即可促進(jìn)γ-32P-ATP的摻入，又能抑制核酸酶的活性

。(3)脫磷酸的DNA樣品最好經(jīng)電泳純化以除去其中存在的低分子質(zhì)量的核酸，否則會競爭性抑制目標(biāo)DNA的標(biāo)記

。2023/7/1437第37頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月探針的線純化凝膠過濾柱層析法利用凝膠的分子篩效應(yīng)，將標(biāo)記的DNA與小分子彼此分開。因標(biāo)記的探針量很小，一般用離心柱層析法。乙醇沉淀法2023/7/1438第38頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子雜交的種類和方法核酸分子雜交的基本原理：DNA分子由兩條互補(bǔ)的單鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的力有三：1、兩條鏈間互補(bǔ)堿基的氫鍵；2、堿基間的堆積力(范德華力)；3、中和鏈內(nèi)的負(fù)電荷。變性：在理化因素作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)間的氫鍵斷裂，兩條鏈解開形成單鏈的過程。2023/7/1439第39頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1440第40頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月變性溫度(Tm)：核酸分子熱變性時，從開始變性到變性結(jié)束，是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的，當(dāng)變性進(jìn)行到核酸分子解鏈一半時的溫度，稱變性溫度，也稱融解溫度。2023/7/1441第41頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1442第42頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月影響變性的因素：1、堿基組成DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。在1×SSC溶液中，兩者之間的關(guān)系可以用經(jīng)驗公式表示：Tm＝(G+C)%×0.41+69.3其中，69.3為無G＋C存在時的Tm值。(G+C)%每增加1％，Tm約上升0.41oC。2023/7/1443第43頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月影響變性的因素：2、溶液的離子強(qiáng)度DNA鏈骨架上的磷酸基團(tuán)帶有較多的負(fù)電荷，它們之間的靜電相斥作用是其雙鏈的不穩(wěn)定因素之一。在無鹽的水中，DNA在室溫下就會變性，加入鹽后，正離子可以封閉磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，使DNA穩(wěn)定性增加，Tm值升高。2023/7/1444第44頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月影響變性的因素：3、pH值pH值在5～9范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。在高pH值下，可使堿基失去形成氫鍵的能力。當(dāng)pH大于11.3時所有氫鍵均被破壞，DNA完全變性。4、變性劑可以干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30oC

。2023/7/1445第45頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)性：變性核酸分子在合適的條件下重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱復(fù)性。熱變性的DNA溶液在低于Tm值25oC的溫度下維持相當(dāng)長的一段時間，則可使之恢復(fù)到天然的雙鏈結(jié)構(gòu)狀態(tài)。復(fù)性的速度受以下因素影響：1、DNA濃度DNA濃度越大復(fù)性速度越快；2、DNA的分子質(zhì)量大分子質(zhì)量的DNA擴(kuò)散速度慢，復(fù)性速度慢；2023/7/1446第46頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月3、溫度溫度過高，有利于DNA變性而不利于復(fù)性；4、離子強(qiáng)度5、DNA分子的復(fù)雜性DNA總量一定時，基因組越復(fù)雜，其中特定順序的拷貝數(shù)越少，互補(bǔ)順序的濃度越低，復(fù)性反應(yīng)速度越慢。2023/7/1447第47頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月分子雜交技術(shù)就是利用了核酸分子的變性與復(fù)性原理，使變性的核酸分子與檢測核酸分子在堿基互補(bǔ)的條件下形成雜交雙螺旋的過程。探針(probe)：在核酸變性實驗中，為使雜交體與單鏈核酸分子區(qū)分開來所使用的帶有標(biāo)記的單鏈核酸分子。2023/7/1448第48頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子雜交分類：以雜交分子分類：DNA與DNA雜交；DNA與RNA雜交；RNA與RNA雜交。以探針標(biāo)記分類：以雜交介質(zhì)分類：液相雜交與固相雜交。固相雜交：菌落雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交及基因芯片等技術(shù)。2023/7/1449第49頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月液相雜交(solutionhybridization)：是一種比較原始的分子雜交技術(shù)。待測分子與探針在雜交液中完成反應(yīng)，利用層析方法將雜交分子與末雜交分子分開后用液閃儀進(jìn)行計數(shù)或利用紫外吸收特性變化分析雜交結(jié)果的分子雜交類型。液相雜交又分為：RNA酶保護(hù)分析法、核酸酶S1保護(hù)分析法。2023/7/1450第50頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA酶保護(hù)分析法(RPA)：利用RNaseA和RNaseT1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護(hù)的特點，用體外轉(zhuǎn)錄合成的放射性標(biāo)記的RNA探針與待檢mRNA進(jìn)行液相雜交，使互補(bǔ)序列RNA探針和待測RNA形成雜交體，用RNase降解非雜交部分RNA后分析雜交結(jié)果。2023/7/1451第51頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA酶保護(hù)分析法的應(yīng)用：mRNA定量mRNA未端定位內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置2023/7/1452第52頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1453第53頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA酶保護(hù)分析法的主要步驟：1、制備待測RNA從細(xì)胞或組織中提取總RNA或mRNA；2、RNA探針標(biāo)記采用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備和標(biāo)記探針；3、分子雜交：將待測樣品RNA和RNA探針在液相中雜交，雜交前將樣品和探針變性，破壞二級結(jié)構(gòu)；4、RNA酶消化單鏈RNA；5、電泳分析雜交分子。2023/7/1454第54頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶S1保護(hù)分析法(nucleaseS1protectionassay)：原理與RNA酶保護(hù)分析法的原理類似，核酸酶S1能專一性地降解單鏈DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA雜交雙鏈。采用M13體系克隆和擴(kuò)增特定基因的單鏈DNA片段，在合成過程中加入核素標(biāo)記物，即可合成出高放射性的單鏈DNA探針。將探針與待測RNA樣品在液相中進(jìn)行雜交，形成DNA/RNA雜交雙鏈。酶解后進(jìn)行分析。2023/7/1455第55頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶S1保護(hù)分析法可用于基因轉(zhuǎn)錄起始位點分析及內(nèi)含子剪切位點分析。液相雜交的優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便。液相雜交的缺點：過量未雜交探針難以除去，產(chǎn)生高背景；同源與異源核酸均可形成雙螺旋結(jié)構(gòu)使得雜交結(jié)果難以分析。2023/7/1456第56頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月固相雜交：將欲分析的樣品先結(jié)合在固相支持物上，再與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交結(jié)果可用儀器或放射自顯影技術(shù)分析雜交結(jié)果。固相支持物的選擇：可用于固相支持物的種類很多。一種良好的固相支持物應(yīng)具備以下幾個特性：2023/7/1457第57頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1、具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力；2、與核酸分子結(jié)合后不影響與探針的結(jié)合；3、與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定牢固；4、非特異性吸附少；5、具有良好的機(jī)械性能便于操作。2023/7/1458第58頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月硝酸纖維素濾膜優(yōu)點：具有較強(qiáng)的吸附單鏈DNA或RNA的能力，特別是在高鹽濃度下，其結(jié)合能力可達(dá)80～100μg/cm2。吸附的單鏈核經(jīng)真空烘烤后，依靠疏水性相互作用而結(jié)合在硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜具有雜交信號本底低的特點廣泛用于各種雜交實驗。缺點：與單鏈核酸的結(jié)合能力不十分牢固，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜時(特別是在高溫下)DNA會出現(xiàn)脫膜現(xiàn)象，硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆使操作不便。2023/7/1459第59頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月尼龍膜：是目前較理想的一種核酸固相支持物，它有多種類型，不同類型的膜上網(wǎng)孔大小不同。經(jīng)正電荷基團(tuán)修飾后與核酸的結(jié)合力更強(qiáng)。尼龍膜與核酸的結(jié)合能力為350～500

μg/cm2。經(jīng)烘烤或紫外線照射后，特別是紫外線照射，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上帶正電荷的基團(tuán)相互交聯(lián)，使結(jié)合更加牢固。2023/7/1460第60頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月Southern印跡雜交：2023/7/1461第61頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1462第62頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1463第63頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1464第64頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月Southern印跡雜交過程1、DNA樣品的酶切和電泳2、電泳膠的處理3、DNA的轉(zhuǎn)移4、DNA的固定5、DNA膜的雜交2023/7/1465第65頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交過程1、預(yù)雜交：為了減少非特異性雜交反應(yīng)，在雜交前應(yīng)進(jìn)行預(yù)雜交，將非特異性DNA位點封閉。常用的封閉物有兩類：其一是變性的非特異性DNA，大多采用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封閉DNA上的非特異位點；封閉膜上與非特異性DNA結(jié)合位點。2023/7/1466第66頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月預(yù)雜交液的配制6×SSC（1×SSC為0.15mol/LNaCl和o.o15mol/L檸檬酸）5×Denhardt’s溶液0.5％SDS100μg/ml變性的鮭魚精子DNA50％甲酰胺(可不用)50×Denhardt：聚蔗糖(Ficoll400)5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白(組分V)5g加水至500ml，分裝后保存于－20oC2023/7/1467第67頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月10mg/ml鮭魚精DNA：超聲法或用注射器通過6號針頭反復(fù)抽打?qū)NA打斷。煮沸后置－20oC保存，使用前置沸水浴中煮沸5分鐘后速置冰浴中。甲酰胺：使用前用DowexXG8混合床陰陽離子交換樹脂處理1小時，小量分裝后置－70oC保存。2023/7/1468第68頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月膜的處理：將結(jié)合了DNA(或RNA)的硝酸纖維素膜或尼龍膜浸泡于6×SSC溶液中2分鐘，使其充分濕潤。預(yù)雜交：將濕潤的濾膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入預(yù)雜交液，盡量排除其中的氣泡后用封口機(jī)封口。2023/7/1469第69頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月溫育：將雜交袋浸入適當(dāng)溫度的恒溫水浴中(不加甲酰胺時用68oC；加入50％甲酰胺時，恒溫42oC)，溫育1～2小時，也可延長至12～16小時。保溫過程中應(yīng)不斷搖動塑料袋，以趕走蓋在濾膜表面的氣泡，否則這些氣泡將阻礙雜交液與濾膜的接觸。(如果將預(yù)雜交液加熱到適當(dāng)溫度后再加入塑料袋內(nèi)，可以減少氣泡產(chǎn)生)。2023/7/1470第70頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2、雜交：雜交反應(yīng)是單鏈核酸探針與待測核酸分子中的特異基因序列在一定的溫度下雜交復(fù)性的過程。雜交包括以下過程：1、雜交液配制：同預(yù)雜交液2、探針變性：放射性標(biāo)記的探針為雙鏈時，于100oC加熱5分鐘變性并迅速在冰水浴中將探針驟冷。單鏈探針無須變性2023/7/1471第71頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月3、打開預(yù)雜交袋棄去預(yù)雜交液，加入雜交液及變性的探針。排除氣泡后重新封好口4、在與預(yù)雜交相同溫度下，保溫8～16小時2023/7/1472第72頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月洗膜：是將濾膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針分子從濾膜上洗去的過程，非特異性雜交體穩(wěn)定性較低，解鏈溫度較低，在一定溫度下，非特異性雜交體解鏈而被洗掉，而特異性雜交體則保留在濾膜上。雜交體的解鏈溫度主要取決于雜交體的同源性和溶液的離子強(qiáng)度兩個要素，同源性越高離子強(qiáng)度越高，雜交體的穩(wěn)定性越高。2023/7/1473第73頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月洗膜的操作如下：1、雜交完畢，取出雜交袋，剪去一角，棄去所有的雜交液，取出膜并迅速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS溶液中，室溫下不斷振蕩。注意不要使濾膜干燥。2、5分鐘后，將濾膜轉(zhuǎn)移至一盛有大量2×SSC和0.1%SDS