版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
第頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程一目的建立標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,以減少菌種污染和生長(zhǎng)特性的改變,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。二范圍本規(guī)程適用于質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室所用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。三內(nèi)容1.1試驗(yàn)菌株大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)64941]黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(F)98001]1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株1.1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種收藏機(jī)構(gòu)。1.1.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過(guò)復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后,即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。1.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)。1.1.2工作菌株1.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每?jī)蓚€(gè)月或定期轉(zhuǎn)種的工作菌株。1.1.2.2工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制,不得超過(guò)5代(從菌種收藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代),以防止過(guò)度的傳代增加表型變化的風(fēng)險(xiǎn)。因此必要時(shí),應(yīng)對(duì)工作菌株的純度和特性進(jìn)行確認(rèn)。1.2菌種確認(rèn)試驗(yàn)的主要內(nèi)容1.2.1菌種的純度確認(rèn)1.2.1.1純度檢測(cè):是指通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)菌種是否為純培養(yǎng)物。1.2.1.2試驗(yàn)內(nèi)容①菌落形態(tài):在特定的培養(yǎng)基上,將待檢測(cè)培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線,適宜培養(yǎng)后,同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似;對(duì)于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株,應(yīng)再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng),檢測(cè)是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。②鏡檢特征:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性;細(xì)胞形狀、大小、莢膜、芽孢等特征應(yīng)相似。1.2.2菌種的特性確認(rèn)1.2.2.1生化試驗(yàn):各種微生物具有各自的獨(dú)特的酶系統(tǒng),因而在代謝過(guò)程中所參與的物質(zhì)分解和合成代謝的產(chǎn)物也不同,這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生化特征。根據(jù)此特征,利用生物化學(xué)方法來(lái)鑒定不同的微生物的試驗(yàn)即為微生物的生化試驗(yàn)。1.3菌種的確定方法用無(wú)菌接種環(huán)粘取培養(yǎng)物,在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上劃線分離單個(gè)菌落,并在適宜條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落形態(tài),然后挑取單一純菌落,進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢,觀察其染色特性及菌形。再做生化試驗(yàn)或使用菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定菌種。1.3.1大腸埃希菌的確認(rèn)1.3.1.1菌落形態(tài)1.3.1.1.1取大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后,形成菌膜,管底有粘液狀沉淀,培養(yǎng)物有糞臭味。1.3.1.1.2取上述培養(yǎng)物接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上,35℃培養(yǎng)18~24h后,觀察結(jié)果。①曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色,菌落中心呈深紫色或無(wú)明顯暗色中心,圓形,稍凸起,邊緣整齊,表面光滑、濕潤(rùn),常有金屬光澤。②麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)呈鮮桃紅色或微紅色,菌落中心呈深桃紅色,圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤(rùn)。1.3.1.2革蘭染色、鏡檢1.3.1.2.1革蘭染色①以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上,取菌落形態(tài)(①、②)的培養(yǎng)物少許,制成均勻涂片,自然或微溫,再通過(guò)火焰2~3次干燥使固定。②滴加結(jié)晶紫染液,染色1min,水洗。③滴加碘液,媒染1min,水洗,以濾紙吸干余水。④滴加95﹪乙醇,脫色20~30s,至流出液無(wú)色,水洗。⑤滴加沙黃染液,復(fù)染1min,待干后,鏡檢。1.3.1.2.2染色結(jié)果應(yīng)是:革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色:革蘭陰性菌呈紅色。1.3.1.2.3鏡檢結(jié)果應(yīng)是:兩端鈍圓的短小直桿菌,單個(gè)或成對(duì),革蘭陰性,無(wú)芽孢,多有鞭毛,以周身鞭毛運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng),許多菌株有莢膜和微莢膜。1.3.1.3生化試驗(yàn)清的載玻片上,蓋上蓋玻片,置濕潤(rùn)的平皿內(nèi),置35~37℃培養(yǎng)1~3h,置顯微鏡下觀察,可見(jiàn)到由孢子長(zhǎng)出短小芽管。1.3.4.2.3鏡檢結(jié)果:革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌芽孢為厚膜孢子、菌絲、芽管。1.3.5黑曲霉菌的確認(rèn)1.3.5.1鏡檢:可見(jiàn)孢子,菌絲。1.3.6銅綠假單胞菌的確認(rèn)1.3.6.1取銅綠假單胞菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后,液面可形成菌膜,細(xì)菌在深層發(fā)育不良,呈微渾濁或透明狀,菌液上層為藍(lán)綠色。1.3.6.1.1取上述培養(yǎng)物接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18~24h后,觀察結(jié)果:呈扁平、無(wú)定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤(rùn),灰白色,周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。1.3.6.2革蘭染色、鏡檢1.3.6.2.1革蘭染色(見(jiàn)大腸埃希菌檢查法5.3.1.2)1.3.6.2.2鏡檢結(jié)果:銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無(wú)芽孢桿菌。單個(gè),成對(duì)或成短鏈排列。1.3.6.3氧化酶試驗(yàn)取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi),用無(wú)菌玻璃棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上,滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液,在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性,均判供試品未檢出銅綠假單孢菌。否則,應(yīng)進(jìn)行綠儂菌素試驗(yàn)。1.3.6.4綠儂菌素(Pyocyanin)試驗(yàn)取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)24小時(shí),加三氯甲烷3~5ml至培養(yǎng)管中,攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻,將三氯甲烷相移至另一試管中,加入1mol/L鹽酸試液約1ml,振搖后,靜置片刻,觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色,為綠儂菌素試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDF瓊脂培養(yǎng)基斜面同法做陰性對(duì)照,陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠儂菌素試驗(yàn)陽(yáng)性,判斷供試品檢出銅綠假單胞菌。上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠儂菌素試驗(yàn)陰性,應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn),確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。1.3.7生孢梭菌的確認(rèn)1.3.7.1取生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物2份,其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接后處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中。置厭氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)。取上述每一培養(yǎng)物0.2ml,分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上,置厭氧條件下培養(yǎng)48~72小時(shí)。若平板上有菌落生長(zhǎng),應(yīng)選2~3個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。1.3.7.2革蘭染色(見(jiàn)大腸埃希菌檢查法5.3.1.2)1.3.7.3過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)取上述平板上的菌落,置潔凈玻片上,滴加3%過(guò)氧化氫試液,若菌落表面有氣泡產(chǎn)生,為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭陽(yáng)性梭菌,有或無(wú)卵圓形或球形的芽孢,過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性,判斷供試品檢出梭菌,否則判供試品未檢出梭菌。1.3.8溶血性鏈球菌的確認(rèn)1.3.8.1把凍干菌種管、滅菌滴管、培養(yǎng)皿、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,移入微生物實(shí)驗(yàn)室的超凈工作臺(tái)上,待用。1.3.8.2將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒,稍干,用75%乙醇棉擦凈,放在滅菌培養(yǎng)皿內(nèi),待干。在無(wú)菌條件下,按使用說(shuō)明將凍干菌種配制成懸液,然后接種到液體或相應(yīng)培養(yǎng)基平板上,并連同剩余菌懸液一起放置于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。1.3.8.3挑取典型菌落接種哥倫比亞CAN血瓊脂平板
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 智能硬件創(chuàng)新企業(yè)評(píng)審
- 國(guó)際工藝品設(shè)備租賃協(xié)議
- 通信設(shè)備運(yùn)輸招投標(biāo)文件
- 會(huì)員消費(fèi)IC卡積分規(guī)則
- 無(wú)人機(jī)駕駛員聘用合同范本
- 執(zhí)行院務(wù)公開(kāi)管理辦法
- 鐵路工程供貨施工合同范本
- 金屬材料采購(gòu)授權(quán)委托書(shū)
- 通訊設(shè)備項(xiàng)目獎(jiǎng)勵(lì)政策
- 煤炭供應(yīng)商運(yùn)輸合作協(xié)議
- 2024年廣東省普通高中學(xué)業(yè)水平考試化學(xué)試卷(修改+答案)版
- 2024年小學(xué)生中華經(jīng)典誦讀知識(shí)競(jìng)賽參考題庫(kù)500題(含答案)
- 2024年四川遂寧開(kāi)祺資產(chǎn)管理有限公司招聘筆試參考題庫(kù)含答案解析
- 有機(jī)肥料及微生物肥料行業(yè)的環(huán)境影響與生態(tài)保護(hù)
- 提高檢驗(yàn)標(biāo)本合格率的品管圈課件
- 日拱一卒行穩(wěn)致遠(yuǎn)
- 幼兒園教育的德育培養(yǎng)
- 培訓(xùn)內(nèi)驅(qū)力的課件
- 管理后臺(tái)策劃方案
- 順豐SHL在線測(cè)評(píng)題庫(kù)
- 貴州省黔東南州2022-2023學(xué)年八年級(jí)上學(xué)期期末文化水平測(cè)試數(shù)學(xué)試卷(含答案)
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論