近紅外漫反射光譜法快速測定當歸中阿魏酸及亞油酸

近紅外漫反射光譜法快速測定當歸中阿魏酸及亞油酸顧志榮;張亞亞;丁軍霞;王亞麗;孫宇靖【摘要】以反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定的當歸中阿魏酸及亞油酸含量作為參考值，利用TQAnalyst8.0軟件的偏最小二乘法(PLS腱立了快速、準確測定當歸中阿魏酸及亞油酸含量的定量模型.結(jié)果表明，阿魏酸校正集的相關(guān)系數(shù)(R)為0.9721,校正均方差(RMSEC)為0.5942,預(yù)測均方差(RMSEP)為0.6747.亞油酸校正集的相關(guān)系數(shù)為0.9673,校正均方差為0.4573,預(yù)測均方差為1.0682.驗證集中阿魏酸及亞油酸的平均預(yù)測回收率分別為101.98%和102.03%.該方法操作簡單、快速，所建模型預(yù)測結(jié)果準確、可靠，可用于中藥當歸中阿魏酸及亞油酸的含量測定.【期刊名稱】《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》【年(卷)，期】2015(027)005【總頁數(shù)】6頁(P849-853,889)【關(guān)鍵詞】當歸;近紅外漫反射光譜;定量模型;阿魏酸;亞油酸【作者】顧志榮;張亞亞;丁軍霞;王亞麗;孫宇靖【作者單位】甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心;甘肅中醫(yī)學院當歸研究所,蘭州730000;甘肅中醫(yī)學院當歸研究所，蘭州730000;甘肅中醫(yī)學院當歸研究所，蘭州I730000;甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心;甘肅中醫(yī)學院當歸研究所，蘭州I730000;甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心;甘肅中醫(yī)學院當歸研究所，蘭州730000【正文語種】中文【中圖分類】R282.5;O657.3當歸［Angelicasinensis（Oliv.）Diels］為傘形科多年生草本植物，主產(chǎn)于甘肅定西及隴南一帶，云南、湖北亦有栽培［1］?，F(xiàn)代研究表明，揮發(fā)油、有機酸及多糖［2］是其最主要的藥效組分。當歸中有機酸主要有阿魏酸、亞油酸、煙酸等［3］。阿魏酸具有抗氧化、清除自由基以及抗紫外線等作用，其含量是2010年版中國藥典中當歸質(zhì)量控制的特征性指標［4］，多用HPLC進行測定。但該法前處理復(fù)雜、儀器操作繁瑣、分析時間較長，且阿魏酸在水中穩(wěn)定性差，見光、受熱極易分解，易與當歸中阿魏酸松柏酯相互轉(zhuǎn)化［5］。亞油酸是人體無法合成的必須脂肪酸，其功能性多不飽和鍵具有降低血清膽固醇的作用［6］,但其在空氣中易發(fā)生自氧化。NIR是正在迅速發(fā)展的一種綠色分析技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化工、煙草、制藥和食品工程等領(lǐng)域［7］。NIR兼?zhèn)淞丝梢妳^(qū)光譜分析信號容易獲取與紅外區(qū)光譜分析信息量豐富兩方面的優(yōu)點，但也有譜帶重疊多、吸收強度低等缺點，在定量分析中必需在一定波段內(nèi)利用化學計量學方法建立數(shù)學模型，才能確定成分含量與光譜間的關(guān)系［8］。本研究首先采用RP-HPLC測得當歸藥材中阿魏酸與亞油酸的含量值，然后采用NIR對當歸藥材在近紅外光譜區(qū)域的特征吸收進行實驗研究，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化定量校正模型，實現(xiàn)當歸藥材中阿魏酸與亞油酸含量的快速、準確測定。1材料與方法1.1原料、試劑及主要儀器145批當歸藥材，采集于甘肅及云南14個縣級主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)甘肅中醫(yī)學院藥學院晉玲教授鑒定為Angelicasinensis（Oliv.）Diels。阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:131187-100504）;亞油酸對照品（美國迪瑪公司，批號：245-12-06）;甲醇（色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司）,超純水(自制，電阻率＞18.2MQ)。Nicolet-6700型傅立葉變換近紅外光譜儀(配有積分球模塊、RESULT3.0光譜采集軟件和TQAnalyst8.0化學計量學軟件，美國Thermo公司);Agilent1100LC/DAD系統(tǒng)(包括G1312A二元梯度洗脫泵，G1316A柱溫箱，G1315BDAD檢測器，G1313A進樣器和Agilent化學工作站，美國Agilent公司)。1.2實驗方法1.2.1樣品NIR光譜的采集將當歸樣品粉碎，過50目篩，預(yù)先置于紅外燈下干燥至恒重。采集條件:積分球漫反射方式，掃描范圍10000-4000cm-1，掃描32次，分辨率8cm-1，溫度20°C,空氣相對濕度70%，以空氣為參比，每批樣品重復(fù)采集3次，取平均光譜。1.2.2異常光譜的剔除利用TQAnalyst8.0化學計量學軟件中的Dixon檢驗剔除異常光譜。1.2.3阿魏酸及亞油酸含量的測定采用RP-HPLC測定當歸中阿魏酸及亞油酸的含量，作為建立模型的化學參考值。精密稱取樣品粉末約0.5g，加70%甲醇20mL,超聲(15C,800W,50kHz)提取45min,濾過，上清液定容至25mL容量瓶中，進樣前用0.45pm微孔濾膜過濾。色譜條件:WatersX-BridgeC18(250mmx4.6mm,5pm)色譜柱，以水(A)-甲醇(B)為流動相進行梯度洗脫(0~5min,10%~20%B;5~15min,20%~50%B;15~35min,50%~80%B;35~55min,80%~90%B)，體積流量0.8mL/min，進樣體積10pL,柱溫30C,阿魏酸及亞油酸的檢測波長分別為280nm及206nm。方法學考察顯示所采用的儀器及方法誤差符合要求。每份樣品平行測定3次，取平均值。以外標法計算2種成分的含量。1.2.4近紅外光譜模型的建立利用PLS(偏最小二乘法)建立當歸中阿魏酸及亞油酸的定量校正模型。以隨機選擇的30%的樣品作為驗證集，其余70%作為校正集。以相關(guān)系數(shù)(R)、校正均方差(RMSEC)、預(yù)測均方差(RMSEP)和交叉驗證均方差(RMSECV)作為評價校正模型優(yōu)劣的指標［7］。采用交叉驗證法驗證所建模型的穩(wěn)健性，采用獨立的驗證集對所建模型的預(yù)測能力進行檢驗。通過TQAnalyst8.0化學計量學軟件的自動優(yōu)化功能結(jié)合樣品近紅外光譜圖篩選建模波段。采用內(nèi)部交互驗證法(internalcrossvalidation)篩選潛變量個數(shù)。2結(jié)果與分析2.1當歸樣本的近紅外光譜特征分析145批當歸樣本的近紅外原始光譜見圖1。一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜見圖2、圖3。由圖可見，一階導(dǎo)數(shù)光譜能夠清楚地反映出樣品中的主要吸收峰位，而二階導(dǎo)數(shù)光譜反而將噪聲放大。一階導(dǎo)數(shù)光譜中的主要特征峰:6896cm-1為O-H的—級倍頻吸收峰，6079cm-1為C-H的一級倍頻吸收峰，5352cm-1為C=O的二級倍頻吸收帶，5000cm-1為O-H的合頻吸收峰，4545cm-1為N-H的合頻吸收峰，4347cm-1為C-H的合頻吸收帶［9,10］。圖1145批當歸樣本近紅外原始光譜圖Fig.1OriginalNIRspectraof145batchesofsamples圖2經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜圖Fig.2Thespectraprocessedbyfirstderivation圖3經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜圖Fig.3Thespectraprocessedbysecondderivation2.2樣品集的劃分及化學參考值測定結(jié)果Dixon檢驗剔除了4個異常光譜，從剩余的141批樣品中隨機抽取42批作為驗證集，用于檢驗?zāi)Ｐ偷念A(yù)測能力，其余99批作為校正集，用于建立模型。對照品及當歸樣品的HPLC色譜圖見圖4,樣品集中阿魏酸及亞油酸的含量分布見表1。由表1可知，阿魏酸和亞油酸的含量分布范圍較廣，具有很好的代表性，能夠滿足建模的要求。圖4混合對照品(A)與當歸樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.4HPLCchromatogramsofmixstandards(A)andsample(B)注:1:阿魏酸;2:亞油酸Note:1:ferulicacid;2:linolicacid表1樣品中阿魏酸及亞油酸的含量分布Table1Contentdistributionofferulicacidandlinolicacidofsamples注-平均值S-標準偏差。Note:-average;S-standarddeviation.2.3光譜波段的篩選由圖1可見，不同當歸樣本的NIR譜圖十分接近，無法直接判定各成分含量與個別波長點的吸光度之間的相關(guān)性，必須在一定的區(qū)間內(nèi)建立數(shù)學模型來確定近紅外光譜和成分含量之間的關(guān)系［11,12］。結(jié)合TQAnalyst8.0定量分析軟件的自動優(yōu)化結(jié)果和樣品紅外光譜圖，選定阿魏酸的建模區(qū)間為7502.4-6799.9及4456.85-4246.32cm-1波段，亞油酸的建模區(qū)間為8724.7~5000及4427.9-4246.7cm-1波段。此區(qū)間信息量豐富，能充分反映出樣品的性質(zhì)和組成，避免了采用全譜建模的大量計算。2.4光譜預(yù)處理方法的選擇為減少噪聲、信號本底、基線漂移、樣品顆粒不均勻以及光散射等對光譜的干擾，保證模型的可靠性和準確性，本實驗在阿魏酸及亞油酸的分析譜區(qū)間內(nèi)，分別考察了未處理光譜(None)、一階導(dǎo)數(shù)光譜(FD)、二階導(dǎo)數(shù)光譜(SD)，以及一階導(dǎo)數(shù)光譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜與多元散射校正(MSC)、標準正態(tài)變量校正(SNV)、Savitsky-Golay(SG)平滑和Norris導(dǎo)數(shù)濾波平滑相結(jié)合的方法。結(jié)果見表2?？芍x用—階導(dǎo)數(shù)和Savitzky-Golay平滑以及多元散射校正和對光譜進行預(yù)處理所得模型的預(yù)測效果最佳。表2不同光譜預(yù)處理方法的建模結(jié)果Table2Theresultsofdifferentspectrapreprocessingmethods2.5潛變量個數(shù)的確定采用PLS建立定量模型，潛變量個數(shù)(factor)的選擇對模型預(yù)測能力的影響較大。潛變量個數(shù)太多，所建模型包含太多的測量噪音，出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象;潛變量個數(shù)太少，導(dǎo)致建模信息不全，模型預(yù)測能力差［13］。由圖5及圖6可知，隨著潛變量個數(shù)的增加，R2(%)不斷增加，RMSECV不斷減小，當阿魏酸及亞油酸的潛變量個數(shù)分別達到5和4后都趨于穩(wěn)定。圖5阿魏酸模型的潛變量個數(shù)與RMSECV及R2的關(guān)系Fig.5FactorrelationshipwithRMSECVandR2offerulicacidmodel圖6亞油酸模型的潛變量個數(shù)與RMSECV及R2的關(guān)系Fig.6FactorrelationshipwithRMSECVandR2oflinolicacidmodel2.6定量模型的建立及評價綜合上述分析，本實驗選定阿魏酸的建模區(qū)間為7502.4~6799.9及4456.85~4246.32cm-1波段，亞油酸的建模區(qū)間為8724.7~5000及4427.9~4246.7cm-1波段，采用Savitzky-Golay平滑、多元散射校正和一階導(dǎo)數(shù)相結(jié)合對光譜進行預(yù)處理，阿魏酸及亞油酸的潛變量個數(shù)分別取5和4,由此建立PLS定量模型。由相關(guān)圖(圖7)可見，模型預(yù)測值與參考方法測得的真實值之間具有較好的相關(guān)性。所建阿魏酸模型的R為0.9721,RMSEC為0.5942,RMSEP為0.6747;采用交叉驗證法判斷阿魏酸模型的穩(wěn)健性，交叉驗證R為0.9364,RMSECV為1.0244。所建亞油酸模型的R為0.9673,RMSEC為0.4573,RMSEP為1.0682;采用交叉驗證法判斷亞油酸模型的穩(wěn)健性，交叉驗證R為0.8925,RMSECV為1.2236。由此可見，所建模型比較理想。以驗證集樣品的近紅外光譜預(yù)測值與HPLC測定值的比值作為預(yù)測回收率［14］。通過定量校正模型，驗證集樣品中阿魏酸含量的預(yù)測值在0.23-2.54mg/g之間，百分偏差在-7.69%~9.88%之間，平均百分偏差1.98%，預(yù)測回收率在92.31%~109.88%之間，平均預(yù)測回收率101.98%;驗證集樣品中亞油酸含量的預(yù)測值在0.013-0.297mg/g之間，百分偏差在-5.00%~11.67%之間，平均百分偏差1.34%，預(yù)測回收率在95.00%~111.67%之間，平均預(yù)測回收率102.03%。上述結(jié)果表明，驗證集樣品中阿魏酸與亞油酸含量的預(yù)測值分布范圍與真實值基本相符，平均百分偏差均較小，平均預(yù)測回收率均在100%附近，因此利用近紅外漫反射光譜技術(shù)快速測定當歸中阿魏酸與亞油酸的含量是可行的。3結(jié)論與展望圖7阿魏酸及亞油酸的定量校正模型所得預(yù)測值與真實值之間的相關(guān)圖Fig.7Correlationbetweenactualcontentandpredictedcontentofferulicacidandlinolicacid本研究采集全國14個當歸主產(chǎn)縣共145批當歸藥材進行NIR光譜采集，建立PLS數(shù)學模型對阿魏酸和亞油酸行含量測定，結(jié)果令人滿意。與常規(guī)HPLC、GC等含量測定方法相比，本法樣品預(yù)處理簡單、操作簡便、快速無損、準確可靠，可以節(jié)省大量的分析時間，特別適合大量樣品及在某些條件下不穩(wěn)定樣品的快速測定，在中藥及復(fù)方制劑中質(zhì)量控制成分的快速檢測和質(zhì)量評價中具有廣闊的發(fā)展前景［15］。同時，本法作為一種間接測定含量的方法，其準確性受化學參考值、樣本量及其代表性、儀器因素以及人為因素等的影響。首先，建模樣本的收集和準備非常重要，樣本集各種化學成分的含量范圍必須涵蓋所有可能遇到的樣本中相應(yīng)組分的含量范圍，且含量要盡可能分布均勻。中藥化學成分極其復(fù)雜，只能通過收集足夠多的樣本來盡量涵蓋實際分析中可能遇到的各種樣品［16］。其次，化學參考值盡量要選取準確度與靈敏度較高的經(jīng)典方法進行測定，增加所建模型的可靠性。只有這樣，才可通過直接掃描待測樣品的近紅外光譜圖并立刻獲得樣本中相應(yīng)成分的含量。參考文獻【相關(guān)文獻】QianYY，WangYL，SaRN，etal.MetabolicfingerprintingofAngelicasinensisduringgrowthusingUPLC-TOFMSandchemometricsdataanalysis.ChemCentr，2013，7:42-47.SunHG（孫紅國），ZhangM（張蔓），JiP（紀鵬），etal.IsolationandpurificationofAngelicapolysaccharideandanalysisofitsmonosaccharidecomposition.NatProdResDev（天然產(chǎn)物研究與開發(fā)），2014，26:480-485.HookIL.DangguitoAngelicasinensisroot:arepotentialbenefitstoEuropeanwomenlostintranslation?Areview.JEthnopharmacol，2014，152:1-13.ChinesePharmacopoeiaCommission（國家藥典委員會）.PharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina（中華人民共和國藥典）.Beijing:ChinaMedicalSciencePress,2010.VolI,124.LiSQ（李韶菁），ZhangYC（張迎春），SuPY（蘇培瑜）,etal.Advancesinresearchofonconiferylferulate.ChinJExpTraditMedForm（中國實驗方劑學雜志），2011,17:229-231.ZhangCE（張春娥）,ZhangH（張惠），LiuCY（劉楚怡），etal.Researchprogressoflinoleicacid.CereOilsProc（糧油加工），2010,5:18-21.WangY（王遠），QinMJ（秦民堅），QiJ（戚近）,etal.AnalysisofpolysaccharidescontentsinOphiopogonjaponicusbyNIR.SpectroscSpectralAnal（光譜學與光譜分析），2009,29:2677.YangY（楊陽），DaiT（代濤），WangXK（汪學楷），etal.Nearinfraredspectroscopymathematicalmodelsofcholicacid.ChemResAppl（化學研究與應(yīng)用），2011,23:204-207.LiBX（李波霞）.TheapplicationofinfraredSpectroscopyandchemometricstoqualitationandquantitativestudymodelsofCodonopsispilosulaeandAngelicaesinensis.Lanzhou:LanzhouUniversity（蘭州大學），MSc.2007,23-24.LuWZ（陸婉珍）.ModernNear-InfraredSpectroscopicTechniques（現(xiàn)代近紅外光譜分析技術(shù)）（H）.Beijing:ChinaPetrochemicalPress（中國石化出版社），2006.30-32.ZhouY（周蕓），ZhangXL（張曉玲），WuYJ（吳永江），etal.DeterminationofproanthocyanidinsandtotalphenolicsintheseedpodofNelumbonuciferaGaertnbynearinfrareddiffusereflectancespectroscopy.ChinJPharm（中國藥學雜志）,2013,48:221-224.ZhouM（周旻）,WangTZ（王天志），YeLM（葉利明），etal.DeterminationofberberineinPhellodendronChineseSchneidfromSichuanusingnearinfr