生物芯片分類及應(yīng)用

一、

概念、分類及應(yīng)用1當(dāng)前第1頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)（一）、兩個概念生物芯片

主要指通過平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測?；蛐酒夹g(shù)是通過微陣列技術(shù),將高密度DNA片段陣列通過高速機(jī)器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術(shù)。2當(dāng)前第2頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)微陣列芯片（Microarray）微型實(shí)驗(yàn)室芯片(Lab-on-a-chip)液體芯片(Liquichip)（二）、生物芯片分類及應(yīng)用3當(dāng)前第3頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)Lab-on-a-chip微型實(shí)驗(yàn)室芯片是通過在芯片上刻成微流路徑從而將涉及生物檢測的主要步驟—樣品準(zhǔn)備/生化反應(yīng)/結(jié)果檢測—整合在一張芯片上。4當(dāng)前第4頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)5當(dāng)前第5頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)6當(dāng)前第6頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)LiquichipBead,Capturemolecule,Analyte,Reportermolecule是構(gòu)成liquichip的4個主要部分。Bead上帶有兩種熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例可以將bead分為多種。目前已有48種，正在開發(fā)中。Capturemolecule:作用相當(dāng)于探針，能特異性的與被檢測物結(jié)合。Analyte:樣品中被檢測的成分。Reportermolecule:帶有熒光的報告分子，能特異性的與被檢測物結(jié)合。7當(dāng)前第7頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)Liquichip反應(yīng)的一般步驟：1.先將capturemolecule結(jié)合在bead上，2.將這種標(biāo)記了的bead與樣品反應(yīng)。Capturemolecule可以與相應(yīng)的analyte特異性的結(jié)合，3.此時再加入熒光標(biāo)記的，特異結(jié)合analyte的reportermolecule。4.檢測：用liquichipworkstation進(jìn)行檢測。原理是同時對bead和reportermolecule上的熒光進(jìn)行檢測。從而確定被結(jié)合的analyte的種類和數(shù)量。

8當(dāng)前第8頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)Liquichip技術(shù)特點(diǎn)描述1．基于bead的這種固相反應(yīng)技術(shù)，具有靈敏度高、信號強(qiáng)度高、靈活性好、所需樣品量少的特點(diǎn)。2．與傳統(tǒng)的蛋白芯片相比，有兩大優(yōu)勢，反應(yīng)速度更快，靈活性更好。3．由于檢測方法的特點(diǎn)，在大部分的實(shí)驗(yàn)過程中，都不需要洗脫步驟，省時，且不會破壞反應(yīng)的動態(tài)平衡。4．有配套的蛋白表達(dá)和純化體系。（his-tag）

9當(dāng)前第9頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)Lquichip應(yīng)用領(lǐng)域：蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)功能研究蛋白表達(dá)譜分析。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受體-配基分析、蛋白質(zhì)核酸相互作用分析分析。

10當(dāng)前第10頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)微陣列芯片蛋白芯片基因芯片

11當(dāng)前第11頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)蛋白芯片(ProteinChips)高通量微陣列蛋白分析方法利用抗體抗原結(jié)合原理，采用化學(xué)發(fā)光或熒光檢測

標(biāo)記抗體或抗原，來檢測抗原或抗體。12當(dāng)前第12頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)蛋白芯片應(yīng)用免疫學(xué)分析

蛋白與蛋白之間相互作用

DNA與蛋白質(zhì)分子相互作用13當(dāng)前第13頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)基因芯片基因芯片是通過微陣列技術(shù),將高密度DNA片段陣列通過高速機(jī)器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術(shù)。微陣列技術(shù)巨大優(yōu)勢在于它可以并行地宏量獲取生物信息，借助此技術(shù)發(fā)展的生物芯片則提供了以核酸雜交為基礎(chǔ)的基因水平的表達(dá)監(jiān)控，多態(tài)性研究和基因分型。從而使我們對基因表達(dá)調(diào)控有更深入的了解。14當(dāng)前第14頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray15當(dāng)前第15頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)基因芯片

按內(nèi)涵劃分：

cDNA芯片

Oligo芯片:25mer(affymetrix),70mer(Operon)，80mer（Clontech）,

按功能劃分：

基因組芯片：

檢測某一基因是否存在，若存在，拷貝數(shù)是多少。探針是DNA.

表達(dá)譜芯片：確定基因表達(dá)的途徑與表達(dá)產(chǎn)物。探針是RNA或cDNA

測序芯片：通過探針與微陣列的配對分析獲得探針的序列結(jié)果。16當(dāng)前第16頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)基因芯片應(yīng)用基因表達(dá)檢測多態(tài)性分析遺傳圖譜定位基因分型通過雜交反應(yīng)測定序列17當(dāng)前第17頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)基因芯片應(yīng)用領(lǐng)域遺傳疾病研究癌癥家系遺傳疾病普通基因突變疾病感染性疾病藥物篩選動物植物遺傳篩選育種

個人基因身份證環(huán)境監(jiān)測18當(dāng)前第18頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)（三）、生物芯片應(yīng)用優(yōu)勢高通量平行分析樣品自動化程度高省時省力所需樣品試劑少保護(hù)環(huán)境成本低19當(dāng)前第19頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片應(yīng)用優(yōu)勢生物信息數(shù)據(jù)累積為生物信息公共數(shù)據(jù)庫添加更多數(shù)據(jù)有利于研究基因序列與生物表型之間的關(guān)系有助于理解疾病發(fā)生的機(jī)制20當(dāng)前第20頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)二、生物芯片制作技術(shù)介紹21當(dāng)前第21頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片制作方法分類22當(dāng)前第22頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)

原位合成

(InSituSynthesis)化學(xué)合成原子印章原位光刻合成23當(dāng)前第23頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)原位光刻合成美國著名的Affymetrix公司率先開發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻專利技術(shù)，是生產(chǎn)高密度寡核苷酸基因芯片的核心關(guān)鍵技術(shù)。24當(dāng)前第24頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)

原位光刻合成原理Lightdirectedoligonucleotidesynthesis.Asolidsupportisderivatizedwithacovalentlinkermoleculeterminatedwithaphotolabileprotectinggroup.Lightisdirectedthroughamasktodeprotectandactivateselectedsites,andprotectednucleotidescoupletotheactivatedsites.Theprocessisrepeated,activatingdifferentsetsofsitesandcouplingdifferentbasesallowingarbitraryDNAprobestobeconstructedateachsite.25當(dāng)前第25頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)預(yù)先合成后點(diǎn)樣

(off-chipsynthesis)接觸式點(diǎn)樣非接觸式點(diǎn)樣26當(dāng)前第26頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)基因芯片點(diǎn)樣的方式接觸式點(diǎn)樣---適合于DNA芯片的制作即點(diǎn)樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上27當(dāng)前第27頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)接觸式點(diǎn)樣Best!28當(dāng)前第28頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)ArrayItChipMakerPins帶有細(xì)槽的不銹鋼針尖載樣能力:200to600nL點(diǎn)樣體積:250pLto2.5nL(pinsize)點(diǎn)樣直徑:100μmto500μm(pinsize)DippingofpinforsamplepickupTouchingofslidewithpintoleavespotControlprintvolumewithpinsize29當(dāng)前第29頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)StealthandChipmakerPin(TeleChem)30當(dāng)前第30頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)Chipmaker點(diǎn)樣技術(shù)31當(dāng)前第31頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)StealthPins32當(dāng)前第32頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)CatalogNumberSpotDiameter(μm)Uptakevolume(μl)DeliveryVolume(nl)Minimumspotspacing(μm)Maximumsubgridperpin(spots)Density(spots/cm2)MaximumnumberOfspots(18mm×72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,40033當(dāng)前第33頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)TeleChem公司點(diǎn)樣針技術(shù)不斷發(fā)展的專利針技術(shù)共有30種針供選擇與斯坦福大學(xué)共同發(fā)展專利pin,帶樣穩(wěn)定，樣品利用率高單次帶樣可連續(xù)點(diǎn)樣達(dá)200--1500次特殊不銹鋼材料，適用于各種溶液實(shí)際點(diǎn)樣直徑75--250um,可根據(jù)不同樣品選擇相應(yīng)pin相當(dāng)容易更換pin和pinhead以適應(yīng)不同需要34當(dāng)前第34頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)基因芯片點(diǎn)樣的方式非接觸式點(diǎn)樣---適合于蛋白芯片的制作

它是以電磁閥或壓電原理將樣品直接噴至固相支持物表面35當(dāng)前第35頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)非接觸式噴點(diǎn)技術(shù)ThermalSolenoid螺線管PiezoelectricDP36當(dāng)前第36頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)Synquad：通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機(jī)結(jié)合起來精確控制滴液

Piezoelectric：用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術(shù)，兩個壓電晶體同時加脈沖通電觸發(fā)這兩個壓電晶體往噴管中間變形擠壓噴管側(cè)壁，噴管出現(xiàn)收縮壓迫液體從噴嘴噴出。

DP37當(dāng)前第37頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)非接觸式點(diǎn)樣：

synQUADTechnology38當(dāng)前第38頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)??AspirateandPrintforMakingArrays39當(dāng)前第39頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)CharacteristicsofsynQUADTechnologyWidedispenserangeLownanolitertohighmicroliterExcellentlinearityPreciseandaccurateCV’stypicallylessthan10%Precisionlessthan5%Non-contactdispensemechanismEasiermechanicalalignment(384,1536,…)“On-the-fly”printingpossibleCapableofdispensingontomembranesorslidesMultipleliquidhandlingmodesAspirate/DispenseContinuousReagentDispensing40當(dāng)前第40頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)synQUADvsPiezoelectricPrintingsynQUAD/nQUADPatentedbyCartesianUsescommerciallyavailablecomponentsRobustandreliabledeliverymechanismLownanolitertolowmicroliterdispensevolumemaximumdensity:200to400spots/cm2PiezoelectricAbbottholdskeypatentsontechnologyDispensesusceptibletoairbubblesMid-picoliterdispensevolume~2500spots/cm241當(dāng)前第41頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)三、

生物芯片檢測系統(tǒng)CCD掃描儀

非共聚焦激光掃描儀激光共聚焦掃描儀42當(dāng)前第42頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)數(shù)值孔徑與采光效率NA0.3NA0.8NA=sin(),whereisthe?angleofthecone43當(dāng)前第43頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)激光共聚焦（聚焦）Thefluorescencesourceisattheobjectivelens’focusLightgoesthroughthepinholetothedetector44當(dāng)前第44頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)激光共聚焦（非聚焦）Fluorescencesourcebelowfocus(e.g.outoffocus)Outoffocuslightismostlyblockedatthepinhole45當(dāng)前第45頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)ConfocalArtifactRejection

NoPinholeWithPinholeDustartifactsreducedbyatleastafactorof1046當(dāng)前第46頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)CCDCameraSystemsAdvantages:FewmovingpartsFastscanningofbrightsamplesDisadvantages:NAlimitedtoabout0.40:LessappropriatefordimsamplesOpticalscattercanlimitperformanceNeedto“stitch”togetherlargeimagesConfocalLaserScannersAdvantagesSmalldepthoffocusreducesartifactshighlightcollectionefficiency.PMTdetectorshavethehighestsensitivityinthevisiblerange47當(dāng)前第47頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)DNAscopeLM+

激光共聚焦芯片掃描儀48當(dāng)前第48頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)xxyzxMACROscope?Filters49當(dāng)前第49頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)HowtheScanSystemWorksF-thetaTelecentricScanSystemSampleScanningMirrorLaserScanLensBAC50當(dāng)前第50頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)HowtoscanawholesampleHomeSensorScanningMirrorSampleLaserScanLens51當(dāng)前第51頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)DNAscopeLM+優(yōu)點(diǎn)

共聚焦面積寬:20mm70mm可以掃描多種介質(zhì)(ImagesbothGlassSlideMicroarraysandCLONDIAGATtubes)背景噪聲低，信噪比高全自動成像，分析結(jié)果Smallfootprint(W20cmxL30cmxH20cm)52當(dāng)前第52頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)

ImagingArraysBothDry&WetDryPBSbufferCy3Cy5Cy3andCy5labeledproteindottedonglasssubstrateandimagedat5micronresolutioninbothdryandwetformats53當(dāng)前第53頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)Tube1Tube2Cy3ImagesoftwoClondiagArrayTubes54當(dāng)前第54頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)四、

生物芯片技術(shù)思路的比較55當(dāng)前第55頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)ComparisonofDNAChipTechnologies

SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)

Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip20nor80n<2,000n>50,000n sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis56當(dāng)前第56頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)cDNA芯片的缺點(diǎn)由于不同的基因長短不同，Tm值各異，成千上萬的基因在同一張芯片上雜交，使得雜交條件很難同一。同一個體中總是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物種存在基因重疊序列的相互干擾，使得傳統(tǒng)的cDNA芯片的分辨能力受到限制，結(jié)果的準(zhǔn)確性也受到影響。有些組織中在DNA雙鏈中的無意義鏈中存在重疊的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表達(dá)方式很難用cDNA芯片來區(qū)分。PCR產(chǎn)物是結(jié)合穩(wěn)定的DNA雙鏈，加入探針后在雜交中必然存在競爭性抑制，影響探針和模板的結(jié)合能力和穩(wěn)定性，進(jìn)一步影響cDNA芯片的分辨能力和結(jié)果的可信度，這對于低豐度的基因影響尤為明顯。PCR產(chǎn)物濃度不均一也可能導(dǎo)致錯誤的結(jié)論。

57當(dāng)前第57頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)寡核苷酸芯片比cDNA芯片的優(yōu)點(diǎn)

探針序列經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序列的基因；減少二級結(jié)構(gòu)及其對雜交結(jié)果的影響

雜交溫度均一，提高雜交效率

；合成產(chǎn)物濃度均一，避免因樣品濃度差異而造成點(diǎn)樣量差異；可以設(shè)計檢測不同剪切方式的基因；

無需擴(kuò)增，防止擴(kuò)增失敗影響實(shí)驗(yàn)。58當(dāng)前第58頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)預(yù)合成后點(diǎn)樣系統(tǒng)的綜合成本

－cDNA芯片方法/步驟

試劑/儀器（萬）

人員（人）

耗時（月）

構(gòu)建或購買基因文庫

1-31-2

3-6

PCR引物設(shè)計與合成55-65萬

（2000個片段）1

3PCR產(chǎn)物純化及定量1.2/20

（2000個片段1

2點(diǎn)樣

點(diǎn)樣儀60萬

1

3天

雜交

0.3萬試劑1

2掃描

掃描儀60萬

1

1-2合計

197.5

–209.56-7

11-15

59當(dāng)前第59頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)預(yù)合成后點(diǎn)樣系統(tǒng)的綜合成本

－自己合成寡聚核苷酸芯片方法/步驟試劑/儀器（萬）人員（人）耗時（月）寡聚核苷酸的篩選及合成(2000個基因)200（每個基因用1個70堿基的寡核苷酸片段代替，合成1個堿基14元人民幣計）。1(寡核苷酸片段的篩選，還需專業(yè)的軟件)3-4個月，如購置DNA合成儀，成本？，但時間較長點(diǎn)樣點(diǎn)樣儀60萬11個月

雜交0.3萬試劑12個月掃描掃描儀60萬11-2個月總計320.3萬47-960當(dāng)前第60頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)預(yù)合成后點(diǎn)樣系統(tǒng)的綜合成本

－應(yīng)用Operon探針寡聚核苷酸芯片方法/步驟試劑/儀器（萬）人員（人）耗時（月）探針100點(diǎn)樣60（點(diǎn)樣儀）1

1

雜交0.3（試劑）1

2掃描60（掃描儀）1

1-2總計220.334-561當(dāng)前第61頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)Affymetrix技術(shù)平臺綜合成本芯片２０萬雜交６小時洗滌４小時掃描４分鐘合計220萬１〈１２小時62當(dāng)前第62頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)總結(jié)采用Affymetrix公司的生物芯片系統(tǒng)平臺比較適合于實(shí)力雄厚的科研實(shí)驗(yàn)室，可以在最短的時間內(nèi)盡快獲得精確可靠的并且可能是前人未曾獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并可在國際權(quán)威雜志上獲發(fā)表，盡快在相關(guān)研究領(lǐng)域在國際領(lǐng)域占領(lǐng)一席之地。

63當(dāng)前第63頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)總結(jié)采用合成后點(diǎn)樣的生物芯片平臺比較適合于目標(biāo)定位于研發(fā)、生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室及生物公司。雖然購買芯片點(diǎn)樣掃描系統(tǒng)的經(jīng)費(fèi)看起來比購買Affymetrix系統(tǒng)的費(fèi)用要低，研發(fā)的方向可以結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的研究特點(diǎn)，比較靈活，但前期研究需要投入較大的人力、物力和時間，綜合成本并不低，而且獲得的芯片信息量小，可靠性較低，使用該系統(tǒng)生產(chǎn)的芯片為材料進(jìn)行的研究一般為驗(yàn)證性工作，且因?yàn)椴牧系目煽啃缘?，很難在國際權(quán)威雜志上獲得認(rèn)可。目前開發(fā)生產(chǎn)的生物芯片尚無獲得醫(yī)療許可的產(chǎn)品。64當(dāng)前第64頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)五、

生物芯片制作所需耗材65當(dāng)前第65頁\共有73頁\編于星期四\19點(diǎn)

MicroarrayingAccessories（芯片配件）PinsandPrintheadsOmniGridSlidesandReagentsOmniGridEpoxy(環(huán)氧基修飾)OmniGridAmine(氨基修飾)OmniGridAldehyde(醛基修飾)CompletelineofassociatedreagentsHybridizationChambersHybChamber?Hyb