生物文獻翻譯-來自凋亡血小板中的微粒能夠促進巨噬細胞的分化

來自凋亡血小板中的微粒能夠促進巨噬細胞的分化血小板釋放出的微粒不僅是活化的，而且像細胞凋亡一樣處于老化狀態(tài)（apoptosis-inducedplateletmicroparticles,PMap）。雖然誘發(fā)活化的微粒已經(jīng)被廣泛的研究，但是關(guān)于其PM叩構(gòu)造形成的生理學(xué)影響目前還不被了解。流式細胞術(shù)和掃描電鏡表明PMap呈現(xiàn)激活整合蛋白和影響微粒聚合形成的作用。PMap對單核細胞具有趨化現(xiàn)象，能夠束縛于這些細胞，此外能夠刺激細胞粘附和附著于纖粘連蛋白表面。在持久的潛伏之后，PMaDap能夠促進細胞的分化，但抑制細胞的增殖。單核細胞膜受體分析顯示增加了CD11b（integrinaMb2），CD14和CD31（plateletendothelialcelladhesionmolecule-1）的表達水平，和趨化因子受體CCR5和CXCR4的表達水平，但是CCR2沒有變化。這表明PM叩能夠?qū)⒓毎厴O化駐留在M2單核細胞上。應(yīng)對PM叩的細胞積極消耗氧化低密度脂蛋白（oxLDL），并釋放蛋白酶和過氧化氫。進一步證實發(fā)現(xiàn)分化朝向PM叩刺激（ox）LDL受體，CD36和CD68,炎癥細胞因子和單核細胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)因子等定向?qū)Ｓ型淌杉毎较??？傊?，PM叩與單核細胞之間的相互作用具有一種免疫調(diào)節(jié)的可能性。這種細胞凋亡微粒能夠使細胞向駐留M2子集方向極化，并且導(dǎo)致朝定向?qū)Ｐ酝淌杉毎较蜻M化。在富含血小板的血漿中微粒的存在早在60年代已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了，這些之前被稱為血小板塵埃。從那時起，在血栓形成和止血生理途徑中由血小板導(dǎo)出的微粒所扮演的角色已經(jīng)被較好的確定下來。在正常的外周血也中循環(huán)流動的血小板微粒支持低水平的凝血酶的產(chǎn)生。在外科手術(shù)之后和血栓形成的條件下，在血漿中的微粒水平顯著增加，而且這與心血管疾病、炎癥和動脈粥樣硬化的病理學(xué)作用有關(guān)。這些微粒的形成被認為是用強有效的激活劑激活血小板而產(chǎn)生的結(jié)果，在體外用一種強效促凝血電位刺激會引起被激活的微粒大量脫離流失。血液中血小板的循環(huán)周期是9-10天，而且被脾臟清除或者是經(jīng)歷一種像細胞凋亡一樣的過程。這種由時間誘發(fā)的血小板細胞凋亡也導(dǎo)致微粒的流失，但是顯然，這個過程不存在血小板激活信號。因此，在血液中隨著年齡的增加存在一種PMap（apoptosis-inducedplateletmicroparticles）的持續(xù)形成，表面上看似是一些沉默了的血小板。吞噬細胞，包括單核白細胞，樹突狀細胞和巨噬細胞，負責(zé)細胞凋亡血小板的清除工作和在循環(huán)中PMap的清除工作。條件性的刺激血小板細胞凋亡或者吞噬作用的抑制今后也將增加血漿中PMap的水平，將加劇與炎癥有關(guān)的疾病發(fā)生像動脈粥樣硬化。很多已經(jīng)注意到激活血小板產(chǎn)生的微粒。例如，他們具有高水平促凝血的潛能特點，他們具有許多生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)組——包括CCL5,CXCL4和CXCL7——這些都已經(jīng)被闡明而且他們近來發(fā)現(xiàn)能夠提高血管原的早期分支細胞的瓦薩再生能力。相反的是，很少有相關(guān)的知識是關(guān)于自然形成的誘導(dǎo)細胞凋亡的微粒,PMap的生物學(xué)效應(yīng)。這里，我們假設(shè)PMap在與白血球相互作用中，特別是單核細胞的作用中起到免疫調(diào)節(jié)劑的角色。我們的目的是通過描述PMap和單核細胞及原單核細胞之間長期和短期的相互作用來確定PMap。結(jié)果單核細胞與PMap的相互作用包含微粒而不含血小板的血漿與含有血小板，沒有通過血小板活化作用、僅僅依靠時間而流出細胞凋亡的微粒（圖1，左面）的血漿濃縮液分離（儲存5天），可使用作為血小板特有的細胞標(biāo)記CD61（glycoprotein（GP）Ilia表達利用流式細胞術(shù)直觀的觀察結(jié)果（圖1，右圖）。用顯微鏡觀察血漿中PMap的存在和完整血小板的缺失。利用微孔過濾（0.8mm）和超速離心的方法相結(jié)合移除完整的血小板，PMap被分離出來并且以流式細胞術(shù)為特點，與新鮮孤立的血小板作為參照。PMap部分主要包含＜1mm的部分，但也有一定數(shù)量的較大尺寸部分（圖1b）。這些較大的部分可能是聚合的PMap，這些較大的部分可通過掃描電子顯微鏡來顯示單一或者聚集微粒的存在（圖1c）。流式細胞術(shù)進一步表明CD61在PMap中的表達水平要比休眠的血小板中要低（匹配不同尺寸），并且活化的GPIIb/IIIa（檢測PAC1單克隆抗體）在Pmap中要高（圖1d和e）。在Pmap中強效激活標(biāo)記物的表達，例如，CD62P（P-selectin）和磷脂酰絲氨酸（annexinA5binding），與休眠體血小板相比是增加的。同時，這表明Pmap呈現(xiàn)了一種促凝血磷脂質(zhì)的激活狀態(tài)和活化整合蛋白，從而解釋了他們能夠形成聚集體的能力。然后我們檢測了PMap捆綁THP-1細胞的能力，建立了單核細胞系。電子顯微鏡檢測共孵育微粒THP-1細胞表面的多個PMap（圖2a）。流式細胞術(shù)使用抗CD61mAb表明捆綁于細胞上的PMap在30分鐘和70分鐘之間增加了（圖2b和c）。在之后的時間里，在細胞表面的CD61結(jié)合位點又減少了。這表明PMap通過內(nèi)吞作用進入細胞了，通過共聚焦顯微鏡觀察揭示PMap位于THP-1細胞的表面和胞質(zhì)中（圖2d和支持論點的電影）。在熱處理PMap之后（56°C30分鐘，數(shù)據(jù)未提供），捆綁結(jié)合完全消失，表明PMap表面的活性粘附因子與單核細胞相互作用是必要的。為了確定PMap是否包含對血液細胞的生物活性，我們使用磷酸酯膜遷移實驗來探索其在THP-1細胞中的區(qū)劃性。引人注意的是，與參照趨化因子CCL2（圖2e）相比，PMap能夠引起健康細胞的遷移，這表明微粒具有強烈的趨化潛力。為了進一步確認來自PMap的電位介體，我們采用了CCL5和CXCL7的抑制性抗體，這兩種血小板衍生趨化因子表明了tomediate單核細胞的補充。THP-1細胞對PMap的趨化性能夠有效地被CCL5的抗體所阻遏，然而CXCL7抗體或者同型抗體卻沒任何影響（圖2e）。這就表明CCL5是介導(dǎo)單核細胞朝PMap方向遷移的主要因素。在靜態(tài)和動態(tài)狀態(tài)下單核細胞誘導(dǎo)PMap的粘附。通過實驗表明單核細胞與PMap的功能交互影響。具有PMap（44小時）的THP-1細胞預(yù)培養(yǎng)導(dǎo)致了顯著的增加一一在靜態(tài)條件下對纖連蛋白表面穩(wěn)固的粘附。這種效果對PMA潛伏具有同樣的影響（圖3a）。它通常會增加PMap更高的數(shù)值，然而PMap制劑的上清液是不活躍的。而且，靜態(tài)血小板的預(yù)培養(yǎng)，增加了相似的數(shù)值，并不會影響粘附力。作為血小板自發(fā)流出的PMap，即PMap的第一代，在靜態(tài)血小板共孵育實驗過程中可能影響我們的發(fā)現(xiàn)（圖1a）。為了排除這些自發(fā)產(chǎn)生的PMap的潛在影響，我們首先確定在7天之后PMap形成的數(shù)量，相對于我們在實驗中通常使用的PMap數(shù)量的10/1（圖3b）。在asubsequent粘附試驗中，我們將10/1比例的PMap和自然釋放的PMap的功能影響進行比較。正如所預(yù)料的那樣，微小數(shù)量的PMap是不會存在任何影響的（圖3c）。PMap在主要細胞的粘附方面的影響被研究了在生理條件下低剪切力對人類內(nèi)皮細胞單層匯合的影響。PMap的共孵育（44小時）戲劇性地刺激了分離的單核細胞對內(nèi)皮的粘附，然而在相似條件下與血小板的共孵育卻沒影響（圖3d）。因此PMap治療對單核細胞系和原始單核細胞的粘附性起刺激作用。PMap對專性定位吞噬細胞的誘導(dǎo)分化。在短期或者長期與或者不與PMap共孵育之后通過流式細胞術(shù)技術(shù)研究單核細胞表面受體的變化。PMap的存在漸漸地增加了CD11b，CD14和CD31的表達水平，以相似的方式對THP-1細胞和原始單核細胞處理（圖4b）。在44小時之后，PMap的存在對THP-1細胞和單核細胞內(nèi)CCR2表達水平起抑制作用，盡管這種受體的表達在7天之后恢復(fù)了。相比之下，在THP-1細胞中PMap能夠顯著的增加CCR5的水平，但是在原始單核細胞中這種促進是不存在的，而且在THP-1細胞和原始單核細胞中能夠增加CXCR4水平（圖4a和b）。這個共同點表明PMap治療單核細胞趨向于承擔(dān)M2單核細胞表型，這一點以前解釋為CD14+CD16+CCR2+CCR5+CXCR4++。CD16的表達水平在我們的實驗中仍然沒有改變（圖4a和b）。具有PMap的THP-1細胞較長的潛伏刺激纖連蛋白在細胞表面的蔓延（圖5a）。涉及filopods和lamellipods形成的傳播，作為肌動蛋白絲與著色的肌動蛋白探針、鬼筆環(huán)肽結(jié)合（圖5a）。同時也發(fā)現(xiàn)PMap的出現(xiàn)本質(zhì)上廢除了THP-1細胞的擴散增殖（圖5b）?？刂颇义V的著色表明在經(jīng)過PMA、pmap或者休眠血小板處理之后有大概6%-7%的壞死細胞存在（圖5c）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)支持這樣的結(jié)論——在PMap存在的情況下THP-1發(fā)展成一個穩(wěn)定的，沒有增殖的吞噬作用表型。進一步實驗確定了向?qū)Ｐ酝淌杉毎只?。延長時間，用PMap處理THP-1細胞7天潛伏，但是沒有休眠血小板的存在，增加了氧化低密度脂蛋白的吸收（oxDL；圖5d）。與此相同的是，在PMap存在的條件下oxDL和LDL的受體CD36和CD68的表面表達是增加的（圖5e）。同樣，用PMap處理7天的初級單核細胞的潛伏增加了CD36的水平，但是這一時期似乎太短而不能改變CD68的表達（圖5e）。單核細胞誘發(fā)PMap分泌特性。穩(wěn)定的吞噬性單核細胞具有能夠分泌降解的基質(zhì)蛋白原和活性氧的能力。事實上，用PMap處理的THP-1細胞的孵化，但不是休眠期血小板，2-7天導(dǎo)致了功能性MMP9的產(chǎn)生，正如酶譜法所展示的那樣（圖6a）。酶譜法的量化表明在PMap孵育之后MMP活性隨時間而增加，7天之后用PMA孵育的效果是相似的（圖6b）。這次結(jié)果也表明MMP是由PMap衍生而來的而且血小板本身不可視的對上清液zymographic的活性的作用。此外，PMap的孵育明顯地增加了來自單核細胞（圖6c）和初級單核細胞（圖6d）H2O2的釋放。針對細胞激素和趨化因子分泌物的篩選，初級單核細胞用PMap或者休眠血小板培養(yǎng)44小時，隨后用半定量矩陣分析了細胞上清液細胞因子在平皿上的位置（圖7a）。明顯的是，與血小板相比較，PMap的出現(xiàn)刺激了幾個因子和其他因素的釋放，如C5a，CCL5和白細胞介素-23，和巨噬細胞遷移抑制因子，可溶性CD40配基和可溶性細胞間粘附因子的小程度釋放。此外，單核細胞產(chǎn)生了幾個參與immunomodulating和regenerative過程的因素而不是炎癥，例如G-CSF和GM-CSF。用一種更多定量方式確定相關(guān)細胞因子的分泌，我們做了C5a，GM-CSF，IFN-g和TNFa的酶聯(lián)免疫吸附測定。盡管IFN-g的分泌水平低于檢測范圍，通過PMap，酶聯(lián)免疫吸附測定能夠最大限度的確定單核細胞C5a，GM-CSF和TNFa分泌的感應(yīng)，即使與PMap相比血小板能夠最大限度的增加GM-CSF的表達（圖7b）。討論在本文中，我們確定了PMap在單核細胞功能方面的強有力調(diào)節(jié)作用。這些微粒，在一個累死細胞凋亡的過程中由衰老血小板形成的，似乎顯示了一個特有的“不干粘合劑”膜表面，（GPllb/llla）附著激活的整合素和暴露磷脂酰絲氨酸，這可能會促進單核細胞的相互作用與整合。在文獻中，血小板白血球coaggregate的形成被廣泛研究，例如，血小板激活的蛋白酶受體（凝血酶受體）和P2Y12受體的激活。非常少，但是，仍然被廣泛了解的是血小板微粒白細胞復(fù)合物的形成。本研究是首次證明血小板微粒的作用，白細胞產(chǎn)生的老化和凋亡的血小板的功能與分化。聯(lián)合我們的結(jié)果表明，與單核細胞和初級單核細胞相互作用的PMAP能夠喚起細胞極化和分化的潛能。在我們的應(yīng)用模型中血小板微粒和體外單核細胞的PMap，我們努力排除血小板在PMap混雜的長期共培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生的影響。事實上，由血小板自發(fā)產(chǎn)生的PMap被發(fā)現(xiàn)其功能是微乎其微的。精確地信號途徑，由PMap單核細胞觸發(fā)的途徑仍需要確定。一個可以想象的機制，支持我們的研究結(jié)果的是，引起通過趨化因子例如CCL5，保持和分泌活化的血小板和活化誘導(dǎo)的血小板微粒進行的。這種機制解釋了PMap導(dǎo)致的單核細胞遷移的趨藥性和最近一直被暗示通過血小板的作用調(diào)控T細胞的分化。此外，PMap誘導(dǎo)的單核細胞的激活可能依賴于微粒表面受體的特定分子之間的相互作用，包括血脂（磷脂酰絲氨酸），膠黏劑，激活受體（例如GPllb和llla受體）和GP反受體（P-選擇素）確認為與血小板單核細胞活化相似。此外，在黏著作用下地PMap的內(nèi)吞作用可能迫使單核細胞進入特異性的分化途徑。有趣的是，呈現(xiàn)出PMap誘發(fā)的單核細胞的粘附被青霉素廢除，暗示了磷酸肌醇-3-激酶信號通路在單核細胞活化中的作用（E.Vasina,未公布數(shù)據(jù)和巴里等）。循環(huán)的單核細胞呈現(xiàn)了一種不同子集的離散的性質(zhì)和功能。一個傳統(tǒng)的分工是“促炎”M1單核細胞分泌炎性細胞因子和細胞毒作用，和“定居”M2單核細胞，參與組織重構(gòu)，傷口愈合及血管生成。M2單核細胞通過強有力的endocytotic的活性分化為特定的專性吞噬細胞。得知定居單核細胞的形成是伴隨著CCR2的下調(diào)以及CCR5和CXCR4表面受體的上調(diào)，我們觀察到PMap分化為M2細胞和專性吞噬細胞的一個標(biāo)志性潛能。這點證實了膠黏劑整合表達的增加（CD11b），各自的低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白受體，CD68和CD36。和較高的氧化低密度脂蛋白的攝取。進一步支持了這種概念，M2單核細胞優(yōu)先分化為樹突狀的細胞，我們發(fā)現(xiàn)PMap刺激的單核細胞導(dǎo)致的GM-CSF數(shù)目的提高。目前的研究結(jié)果可能對我們理解動脈粥樣硬化的病理有重要影響。初步支持在流動狀態(tài)下PMap激活的單核細胞增強對內(nèi)皮細胞的附著力上，優(yōu)于血小板滲透，特別是在動脈粥樣硬化的早期階段有關(guān)系。這增加的附著力可能是通過微粒上得受體介導(dǎo)的或者是通過粘合劑單核細胞受體的表達增加所致（例如，CD11b，CD31）以及可能是由于趨化因子表達擴增所致例如CCL5。此外，單核細胞子集LyCloCCR2CCR5p被發(fā)現(xiàn)是使用CCL5受體CCR5當(dāng)進入小鼠的動脈粥樣硬化斑塊的時候，并且在幾項研究中發(fā)現(xiàn)CCR5的阻塞導(dǎo)致了動脈粥樣硬化的減少。類似地，在我們的實驗中，通過PMap介導(dǎo)的CD14PCD16Pccr5Pcxcr4pp表型的人單核細胞的極化作用暗示形成了一個proatherogenic單核細胞子集，駐留在人類的斑塊和加重了動脈粥樣硬化。這項建議是支持這種觀察的，PMap激活單核細胞上調(diào)巨噬細胞標(biāo)記（CD14,CD36CD68）表達，并大量釋放MMP和H2O2,這些因素構(gòu)成了斑塊的不穩(wěn)定和最終的破裂，一個在動脈粥樣硬化性疾病的臨床突發(fā)事件。早先的研究已經(jīng)表明，PMap的產(chǎn)生是在保存的血小板中的一個持續(xù)的過程，并且在血小板活化明顯缺乏的情況下。在流通的領(lǐng)域，像其他的凋亡小題，這些微粒將積極脫離約束力和吞噬?？梢韵胂?，這種去除白細胞，尤其是PMap介導(dǎo)的單核細胞的相互作用。事實上，血小板碎片和單核細胞的共集合，健康受試者血液中可檢測到。另一方面，這種相互作用可能有助于白細胞的長期分化，正如我們在本文中指出的那樣，甚至可以在駐地發(fā)展偏光因素的單核細胞。然而，進一步的工作需要證明促PMap的單核細胞與M2細胞和體內(nèi)駐地巨噬細胞/樹突狀細胞的不同。目前的結(jié)果表明，PMap具有調(diào)節(jié)免疫的潛能，由于刺激他們自己的食菌細胞的移除，如CD11b，CD1434和CD3625，所有的這些已經(jīng)被牽連在凋亡物質(zhì)的吸收上面了。這個建議被證實是由于促炎性和非炎性細胞因子的作用結(jié)果，包括G-CSF,GM-CSF和腫瘤壞死因子，這些是由PMap接觸單核細胞造成的。總之，這是首次研究證明，微粒自發(fā)地從細胞凋亡的血小板產(chǎn)生的，能促進對駐地吞噬型的單核細胞，改變他們的行為和激活狀態(tài)，因此，提出一種新的機制，血小板和他們的產(chǎn)品可能影響動脈粥樣硬化性疾病的進展。材料和方法單核細胞和初級單核細胞人類急性單核細胞白血病THP-1細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時添加L谷氨酸和10%的胎牛血清（FBS）。MCs是從周邊血液的血沉棕黃層中獲得的，這些事從健康的知情器官捐獻者中提取的。單核細胞與中性粒白細胞中分離，采用密度梯度離心，進一步選擇使用磁珠單核細胞分離試劑盒2,根據(jù)制造商的協(xié)議。單核細胞制備的純度是由基于對細胞的流式細胞儀分析獲得的，純度達497%。血小板衍生微粒和洗滌血小板PMap是從血小板血漿中分離的，被儲存在標(biāo)準(zhǔn)血庫中5天。血小板被拆除，快速離心5分鐘4000Xg。血小板血漿制劑離心60分鐘20000Xg。含有PMap的微粒懸浮在PH7.45的HEPES緩沖液中，通過0.8毫米的過濾器過濾，以去除殘留的血小板，再次20000Xg40分鐘離心。上清液用于控制實驗。用HEPES緩沖液再懸浮顆粒后，PMAP標(biāo)記的抗CD61-FITC單克隆抗體，通過流式細胞儀計數(shù)。大小被估計，除了1和6毫米的熒光珠。CD61陽性06毫米計算為PMap。PMap懸浮液直接使用或者冷凍在液氮中。分離的PMap實際上對于外切標(biāo)記CD63來說是陰性的。正如所描述的那樣，血小板從新鮮的人體血液中分離出來。流式細胞儀測定細胞表面標(biāo)記使用六十細胞儀上熒光激活細胞分選第二血小板和PMap表面熒光標(biāo)記蛋白水平CD61和CD62p抗體或者激活GPllb/llla受體。磷脂酰絲氨酸的表達，探討APC-膜聯(lián)蛋白A5、THP-1細胞或懸浮液中的細胞CD11b、CD31、CD14、CD16、CCR2、CCR5、CXCR4或者CD36。并如前所述準(zhǔn)備。使用流式細胞儀熒光激活細胞分選出第二血小板和PMap表面熒光標(biāo)記蛋白水平，示蹤細胞內(nèi)的CD68，并用多聚甲醛固定細胞，用0.5%TRITON-X-100鼠抗CD68mAb染色。相對應(yīng)的陰性對照抗體是IgG1;IgG2b，k或者IgG2a和建議稀釋使用。表達水平被呈現(xiàn)熒光直方圖的等比中項，修正了與同型對照抗體相比較的值。單核細胞的粘附在含有5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中THP-1細胞的粘附被測量，如下所述。在37°C下，用工具，PMA，血小板或者PMap處理的細胞，被粘附在纖粘連蛋白表面。在指定的時間里，有活力的細胞被用BCECFacetoxymethylester處理一小時，然后測量所有細胞和粘連細胞的熒光性，使用SpectraFluoPlus讀取。念連代表了所有細胞熒光的百分比。孵化被一式三份。平行實驗，示蹤細胞被刮掉，并通過校準(zhǔn)流式細胞儀計數(shù)，本質(zhì)上是相同的結(jié)果。原發(fā)性單核細胞粘附于人體主動脈內(nèi)皮細胞單核，在流動條件下測定微觀視頻影像。在37C下細胞被孵育在HEPES緩沖液,PMap或者血小板中44h。期間灌注粘附單核細胞至少要算5個隨機微觀領(lǐng)域。碳酸脂膜細胞遷移實驗在5mm小孔的碳酸脂膜板上，底部會被媒介物，CCL2或者PMap充滿，或者與同型向控制或CCL5和CXCL7抑制性抗體在RPMI-1640培養(yǎng)基中。在含有5%的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中上氣室包含THP-1細胞。在經(jīng)過37C24h培育之后，在底部和上部的細胞被流式細胞儀計數(shù)。檢測運行三次。Transmigrated細胞的百分比被計算出來。在不同的孵化條件下，細胞總數(shù)保持不變。單核細胞功能分析在37C