煙酰胺干預(yù)UVB誘導(dǎo)豚鼠皮膚色素沉著的作用

煙酰胺干預(yù)UVB誘導(dǎo)豚鼠皮膚色素沉著的作用【摘要】目的探討煙酰胺對(duì)中波紫外線致豚鼠皮膚色素沉著的抑制作用。方法以亞紅斑劑量UVB照射豚鼠背部10天建立皮膚無急性損傷色素沉著動(dòng)物模型后，外涂基質(zhì)和%、5%、10%的煙酰胺4周，在此期間觀察膚色改變和測(cè)定皮膚L值。涂藥結(jié)束后取材，進(jìn)行Masson－Fontana、冰凍切片Dopa染色和黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察，觀察黑素細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)和功能的改變。結(jié)果涂抹5%煙酰胺4周后，豚鼠皮膚變白，L值顯著下降，多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)及黑素含量指數(shù)較對(duì)照組明顯減少。結(jié)論5％煙酰胺對(duì)UVB誘導(dǎo)的色素沉著有明顯的抑制，它主要是通過抑制黑素細(xì)胞的增殖和黑素細(xì)胞內(nèi)黑素小體的合成而發(fā)揮作用。

【關(guān)鍵詞】煙酰胺；色素沉著；黑素細(xì)胞

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectofnicotinamideonhyperpigmentationinducedbyUVB.MethodsAfterhyperpigmentationwasinducedbyUVBradiationonthebackofbrownguineapigs，substance，%，5%and10%nicotinamidewereappliedontheexposedskinfor4weeksrespectively.Duringthisprocess，thechangesofskincolorationwereobservedwithnakedeyesandLvalueweremeasured.Thenthebiopsyspecimensweretakenfromthetreatedskin，sectionswerepreparedforspecialstainingandTEMexaminationandthenumberofmelanocytesandmelanincontentindex(MCI)weredetermined.ResultsAftertheapplicationof5%nicotinamidefor4weeks，lighteningeffectwasobviouslyobservedwithnakedeyesandtheLvaluedecreasedsignificantly.Comparedwiththesubstancecontrol，thenumberofDopapositivemelanocytesandmelanincontentindexwereallsignificantlyreduced()inthetreatedskinwith5%nicotinamide.Conclusion5%nicotinamideiseffectiveinlighteningtheUVB-inducedpigmentationofguineapigskin.Thiseffectmayberelatedtothedeclinedproliferationofmelanocytesandtheinhibitionofmelaninsynthesisinmelanocytes.

【Keywords】nicotinamide；pigmentation；melanocyte

煙酰胺是近年來嘗試用于美白和防曬化妝品中的一種化學(xué)物質(zhì)［1，2］，但對(duì)其效果和作用機(jī)制了解甚少。在國(guó)內(nèi)，我們?cè)鴳?yīng)用原代培養(yǎng)的人皮黑素細(xì)胞，探討了煙酰胺抑制黑素合成的適宜濃度［3］，為進(jìn)一步明確煙酰胺對(duì)皮膚色素沉著的抑制作用，本文以棕黃色豚鼠無急性損傷UVB致黑模型評(píng)價(jià)煙酰胺對(duì)皮膚色度的影響，并探討了可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重(355±12)g，健康成年雌性Hartley棕黃色豚鼠10只。

受試物carpobol基質(zhì)；將煙酰胺溶于carpobol中分別配成％、5％、10％三種濃度。

動(dòng)物模型在豚鼠背部選定4cm×4cm區(qū)域脫毛后用TL12Rs型UV-B燈管按照/d劑量照射10天，輻照總量為165mJ。照射結(jié)束后將產(chǎn)生豚鼠背部皮膚分為4個(gè)相離區(qū)域，分別外涂carpobol基質(zhì)、％、5％、10％煙酰胺，每日2次，共計(jì)4周。每周用Lab色度儀測(cè)定動(dòng)物受試皮膚區(qū)域L值，涂藥結(jié)束后，以PowershotS45數(shù)碼相機(jī)攝影，然后在涂藥部位取皮膚做組織學(xué)檢查。

肉眼觀察實(shí)驗(yàn)期間，每日觀察豚鼠皮膚的不良反應(yīng)，如紅斑、鱗屑和色素沉著。

染色方法Masson－Fontana染色：按常規(guī)方法固定、脫水包埋、脫蠟后，入氫氧化銀氨溶液作用12～18h后分別經(jīng)％氯化金水溶液、5％硫代硫酸鈉液處理數(shù)分鐘。結(jié)果：黑素顆粒呈黑色。冰凍切片Dopa染色：新鮮組織低溫恒冷切片于％多巴染液中37℃孵育2h，水洗并淺染蘇木素、曙紅液。結(jié)果：活性黑素細(xì)胞呈棕黑色。

組織學(xué)觀察

多巴陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)在高倍顯微鏡下，以單盲法計(jì)數(shù)Dopa切片中每平方毫米表皮基底層所含活性黑素細(xì)胞數(shù)。

黑素含量指數(shù)使用IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)。選擇Masson－Fontana切片10處表皮，測(cè)定黑素顆粒面積占該處表皮總面積的百分比均值。

電鏡觀察在電子顯微鏡下，觀察黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用表示。用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。

2結(jié)果

皮膚外觀觀察豚鼠背部皮膚在按/d低劑量UVB重復(fù)照射10天期間，未見皮膚潮紅、紅斑或皮屑等皮膚急性損傷反應(yīng)，照射14～17天色素沉著達(dá)到高峰。涂抹受試物后，豚鼠皮膚均未出現(xiàn)刺激反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組皮膚均有不同程度的色素淡化，而5％濃度組皮膚色素淡化最明顯見圖1。

圖1用藥前后，豚鼠皮膚照片A：用藥前；B：用藥4周a基質(zhì)對(duì)照；b2．5％煙酰胺；c5．0％煙酰胺；d10．0％煙酰胺

皮膚色度L值改變Lab儀測(cè)定的色度L值是皮膚黑度的量化指標(biāo)，L值越高說明皮膚越白。皮膚L值變化隨時(shí)間改變，見圖2。用藥2周時(shí)，涂抹基質(zhì)的皮膚由于UVB的滯后致黑作用L值下降了，而5％煙酰胺組皮膚L值無明顯降低，兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；用藥4周結(jié)束時(shí)，基質(zhì)皮膚L值下降了，而相應(yīng)的5％煙酰胺組皮膚較用藥前L值上升了，10%煙酰胺組皮膚L值則上升了。

圖2煙酰胺對(duì)UVB致黑豚鼠皮膚L值改變的影響

光鏡觀察見表1。多巴陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和黑素含量指數(shù)的結(jié)果表明：與基質(zhì)組比較，5％和10％煙酰胺可以減少表皮基底層黑素細(xì)胞數(shù)，同時(shí)可抑制黑素含量。但與5％和10％煙酰胺對(duì)黑素細(xì)胞和黑素合成的抑制作用差異無顯著性。表1煙酰胺對(duì)豚鼠皮膚黑素細(xì)胞和黑素含量的影響

注：與基質(zhì)對(duì)照組相比，*P

電鏡觀察見圖3。基質(zhì)組皮膚黑素細(xì)胞細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)充斥大量成熟Ⅲ、Ⅳ期黑素小體和少量Ⅰ、Ⅱ期黑素小體，但細(xì)胞器較少；%煙酰胺組，黑素小體數(shù)量略微減少；在5%煙酰胺組皮膚中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器豐富，Ⅲ、Ⅳ期黑素小體明顯減少，散在分布于胞漿中；10%煙酰胺組黑素小體分布與5%煙酰胺組近似。

A基質(zhì)對(duì)照MC(X8400)

B2．5％煙酰胺MC(X8400)

C5．0％煙酰胺MC(X8400)

D10％煙酰胺MC(X8400)

圖3煙酰胺對(duì)黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響3討論

煙酰胺與煙酸統(tǒng)稱為維生素ＰＰ，是輔酶Ⅰ、Ⅱ的重要組成部分，在生物氧化過程中起遞氫作用，促進(jìn)生物氧化和組織新陳代謝［4］。研究表明煙酰胺具有抗炎活性，能促進(jìn)紫外線等誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，抑制UVB輻射的光致癌性，在臨床上早已被廣泛用于糙皮病、持久性隆起紅斑、痤瘡等皮膚?。?］。近年煙酰胺的延緩皮膚衰老和美白功能也開始受到重視，國(guó)外已有在防曬劑中加入煙酰胺來達(dá)到防曬效果［1］。

煙酰胺是在光線、空氣中性質(zhì)最穩(wěn)定的水溶性維生素，而且對(duì)皮膚刺激最小［5］。毒理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其小鼠經(jīng)口LD50為g/kg，大大超過臨床使用劑量，而“三致”實(shí)驗(yàn)均為陰性，現(xiàn)已被美國(guó)FDA認(rèn)作安全藥物［4］。Franz做煙酰胺經(jīng)皮吸收研究發(fā)現(xiàn)其平均彌散百分?jǐn)?shù)為11％［4］。以上優(yōu)點(diǎn)說明煙酰胺外用有減少色素沉著可能，關(guān)鍵在于煙酰

胺是否有減輕色素沉著的效果。

由于棕黃色豚鼠體內(nèi)黑素細(xì)胞、黑素小體在毛囊、表皮的分布類似于人體中的分布，其致黑模型應(yīng)用最為廣泛［3，6］。不過，現(xiàn)有的紫外線誘導(dǎo)色素沉著的動(dòng)物模型在建模過程中，多以大于最小紅斑劑量的UVB在短期內(nèi)連續(xù)照射，皮膚紅斑、蛻皮等皮膚損傷難以避免［3，6］。人體的自然曬黑過程通常不伴肉眼可見的皮膚損傷，因此為更好地模擬人體致黑情況，本文采用小劑量多次重復(fù)UVB照射致黑動(dòng)物模型，在照射過程中，豚鼠皮膚無潮紅、紅斑、脫屑等急性損傷。

用藥期間，涂抹基質(zhì)的皮膚于用藥1周時(shí)，L值降至最低，皮膚黑度達(dá)到最高峰，隨后L值逐漸回升，其余三個(gè)煙酰胺濃度組的L值變化也呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)。用藥2周時(shí)，5％煙酰胺已開始抑制皮膚的色素沉著；用藥4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，涂抹5％煙酰胺與10％煙酰胺皮膚L值已經(jīng)大于用藥前L值，美白效果十分明顯，只是這2個(gè)有效濃度引起的皮膚L值改變差異無顯著性。肉眼觀察和通過圖像分析法對(duì)Masson－Fontana染色切片黑素含量的測(cè)定分析結(jié)果與用藥后皮膚L值改變情況相符，從不同角度說明了煙酰胺具有較為肯定的美白效果。

皮膚色素沉著程度主要決定于以下幾個(gè)因素：酪氨酸酶、多巴色素互變酶、二羥基吲哚羧酸氧化酶(TRP-1)等活化調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞內(nèi)黑素合成；黑素細(xì)胞增殖；黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解；角質(zhì)形成細(xì)胞的新陳代謝速度等。通常，美白劑都是通過影響上述一個(gè)或多個(gè)因素發(fā)揮作用。

目前，學(xué)術(shù)界對(duì)于煙酰胺是否能抑制黑素細(xì)胞增殖存在爭(zhēng)議：日本學(xué)者T.HAKOZAKI等［1］認(rèn)為煙酰胺對(duì)黑素細(xì)胞增殖沒有影響；帕它木等［7］以不同濃度煙酰胺處理人皮黑素細(xì)胞發(fā)現(xiàn)隨煙酰胺濃度增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制黑素細(xì)胞的增殖作用明顯增強(qiáng)。但現(xiàn)有的關(guān)于煙酰胺美白機(jī)制的探討都局限在細(xì)胞水平，離體細(xì)胞畢竟不能反映人體的全部特征，從細(xì)胞外推到人體，需要一個(gè)很重要的步驟—?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)涂抹煙酰胺的皮膚組織活檢Dopa染色的結(jié)果顯示5％和10％煙酰胺均可明顯減少位于表皮基底層的、具有黑素合成功能的活性黑素細(xì)胞數(shù)。由于在紫外線輻射下，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)于黑素細(xì)胞的功能狀態(tài)影響較大，如Imokawa等［8］研究發(fā)現(xiàn)紫外輻射誘導(dǎo)表皮中IL-1增多，IL-1可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞中內(nèi)皮素的釋放，而內(nèi)皮素反過來又可促進(jìn)黑素細(xì)胞的分裂增殖，所以，即使離體細(xì)胞結(jié)果與本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，考慮是由于角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞間的相互作用引起的。

此外，有研究表明煙酰胺在體外和活體都可以抑制活性氧族的形成［9］，也有研究表明由紫外線輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS［10］，并促進(jìn)表皮黑素細(xì)胞的黑素合成［11］，因此煙酰胺也可能通過抑制黑素細(xì)胞內(nèi)的黑素合成發(fā)揮作用。于是，本文在透射電鏡下觀察用藥4周皮膚組織超微結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)果表明與基質(zhì)組皮膚相比，外用5％煙酰胺的皮膚表皮黑素細(xì)胞中Ⅲ、Ⅳ期黑素小體明顯減少。因此考慮抑制黑素細(xì)胞也是煙酰胺的作用途徑之一。

總之，外用煙酰胺對(duì)紫外線致黑的豚鼠皮膚有明顯的抑制色素沉著的作用，5％的煙酰胺為適宜添加濃度，它的美白效果主要是通過抑制黑素細(xì)胞的增殖和黑素細(xì)胞內(nèi)黑素小體的合成發(fā)揮作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】

1ThakozakiL，MinwallaJ，ZhuangJ，etal.Theeffectofniacinamideonreducingcutaneouspigmentationandsuprressionofmelanosometransfer.BritishJournalofDermatology，2002，147：20-31.

2賈愛群，孫洋，王建新.美白劑的發(fā)展現(xiàn)狀及其黑色素抑制機(jī)理的研究進(jìn)展.日用化學(xué)工業(yè)，2001，31(1)：41-44.

3HideyaAndo，AtsukoRyu，AkiraHashimoto.Linoleicacidandα-linolenicacidlightensultraviolet-inducedhyperpigmentationoftheskin.ArchDermatolRes，1998，290：375-381.

4靳培英.煙酰胺在皮膚病中的應(yīng)用.國(guó)外醫(yī)學(xué)·皮膚性病學(xué)分冊(cè)，1997，23：139-141.

5MohammadRezaNamaz.Nicotinamide-containingsunscreensforuseinAustralasiancountriesandcancer-provokingconditions.MedHypotheses，2003，60(4)：544-545.

6JunYamakoshi，F(xiàn)ujioOtsuka，F(xiàn)ujioOtsuka，etal.Lighteningeffectonultraviolet-inducedpgmentationofguineapigbyoraladministrationofaproanthocyanidin-richextractfromgrapeseeds.PigmentCellRes，2003，16：629-638.

7帕它木，潘建英，洪新宇，等.煙酰胺抑制人皮黑素細(xì)胞的適宜濃度研究.日用化學(xué)工業(yè)，2004，34(5)：296-299.

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