第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學(xué)夏海濱)final

DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱遺傳重組或或基因重排。重組產(chǎn)物稱為重組體。基因重組主要發(fā)生在減數(shù)分裂時(shí)同源染色體之間的交換。（形式多樣）重組與進(jìn)化關(guān)系密切，增加群體的遺傳多樣性，利于突變的優(yōu)化組合。目前一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)#轉(zhuǎn)座

(transposition)#同源重組

(homologousrecombination)#位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)異常重組目前二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。6.1、同源重組目前三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)Holliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟①兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊②一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA（立體異構(gòu)）④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)目前四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)片段重組體

：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′目前五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄目前六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)片段重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。目前七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′目前八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄目前九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)分支移動(dòng)的過程伴隨著DNA的修復(fù)目前十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)同源重組是減數(shù)分裂的原因。同源重組是由于堿基間的精確配對(duì)實(shí)現(xiàn)的目前十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)異源雙鏈與基因交換同源重組時(shí)會(huì)產(chǎn)生異源雙鏈，從而發(fā)生基因交換。減數(shù)分裂后分離：（對(duì)異源雙鏈區(qū)內(nèi)不配對(duì)堿基的修復(fù)而進(jìn)行的基因校正過程稱作基因轉(zhuǎn)換）基因轉(zhuǎn)換頻率在非對(duì)稱異源雙鏈區(qū)較高?；蜣D(zhuǎn)換也可以在有絲分裂時(shí)姐妹染色體的等位基因間、有絲分裂與減數(shù)分裂時(shí)同一條染色單體上非等位重復(fù)基因之間發(fā)生目前十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)Holliday模型提出了同源重組的基本模式，但對(duì)于基因重組具體細(xì)節(jié)，異源雙鏈的形成細(xì)節(jié)不清楚。在Holliday基礎(chǔ)上提出了單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型，兩個(gè)模型的區(qū)別在于解釋重組期間DNA的修復(fù)的具體過程不一樣。有供體受體之分。（受體：發(fā)生鏈斷裂的分子P138-139）目前十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組低等生物也可以以轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合等多種方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的基因轉(zhuǎn)移。具體方式：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合。外源基因的命運(yùn)：降解、暫時(shí)保留、與內(nèi)源基因置換、整合。目前十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

一、接合作用（conjugation)

當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接 觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至 另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。目前十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

F因子編碼表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA轉(zhuǎn)移通道蛋白等、目前十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

F因子可以與細(xì)菌染色體發(fā)生交叉連接而重組整合入細(xì)菌染色體目前十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

二、轉(zhuǎn)化作用（transformation)

通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA， 使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。感受態(tài)細(xì)胞高濃度鈣可以誘導(dǎo)感受態(tài)目前十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。目前十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

三、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction)

當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞（供體） 釋放出來，再次感染另一細(xì)胞（受體） 時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間 的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。目前二十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)溶菌感染重組感染細(xì)菌噬菌體圖15-3轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過病毒介導(dǎo)發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組目前二十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)：當(dāng)病毒從被感染的供體細(xì)胞釋放出來，再次感染另一受體細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)目前二十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)*轉(zhuǎn)染(transfection)轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。由transformation（轉(zhuǎn)化）和infection（感染）兩詞構(gòu)成。原指將噬菌體、病毒或以其為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。通過感染方式將外來DNA引入宿主細(xì)胞，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)染。將任何類型DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的過程均可叫轉(zhuǎn)染。目前二十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)細(xì)菌的細(xì)胞融合由于細(xì)胞質(zhì)膜融合導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)移和重組。（原生質(zhì)體融合）目前二十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)細(xì)菌的同源重組的酶學(xué)機(jī)制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位點(diǎn)具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈－－－RecA的作用位點(diǎn)RecBCD有固定切割位點(diǎn)原核生物的重組酶學(xué)機(jī)制已經(jīng)比較清楚Chi位點(diǎn)出現(xiàn)幾率很高，是RecBCD的靶位點(diǎn)GCTGGTGG目前二十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)3‘?RecBCD的識(shí)別和切割位點(diǎn)a、RecBCD結(jié)合在DNA的平頭末端（產(chǎn)生機(jī)制不清楚）b、外切、解鏈、移動(dòng)（ATP）c、兔耳狀loop結(jié)構(gòu)產(chǎn)生再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop單鏈區(qū)的

chi位點(diǎn)3‘方4～6NT處切斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶）?

chi位點(diǎn)：GCTGGTGG

目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點(diǎn)

E.coli

含1000個(gè)、Euk.目前二十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)e、RecBCD切割產(chǎn)生3’單鏈末端目前二十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

2、RecA蛋白

（1）

活性a、RecA有單、雙鏈DNA

結(jié)合活性b、RecA有NTPase活性（底物差異活性）與單鏈DNA結(jié)合時(shí)活性最大---依賴于DNAc、RecA有啟動(dòng)一個(gè)分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子的能力，即聯(lián)會(huì)同源DNA

（但其靶DNA必須有缺口－－結(jié)合DNA）目前二十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)目前二十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)RecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型目前三十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)RecA引起的鏈交換和Holliday結(jié)構(gòu)的生成

目前三十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

（2）RecA蛋白催化雙鏈和單鏈DNA

的反應(yīng)階段a、聯(lián)會(huì)前階段（緩慢）

RecA與單鏈結(jié)合b、單鏈與雙螺旋的互補(bǔ)鏈迅速配對(duì)，形成雙鏈連接分子

Holliday（5‘侵入）c、從雙螺旋結(jié)構(gòu)中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長(zhǎng)的異源雙鏈DNA

反應(yīng)結(jié)束時(shí)，RecA結(jié)合到雙鏈上?其中—單鏈同化有固定的方向入侵單鏈進(jìn)入的方向是5’－3‘，雙鏈DNA的互補(bǔ)鏈?zhǔn)?’－5‘目前三十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)目前三十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?RecBCD和

RecA的共同作用RecBCD產(chǎn)生游離單鏈---RECA因子接到重組反應(yīng)目前三十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

3、原核同源重組的其它蛋白

需要E.coli中三個(gè)基因ruvA,ruvB和ruvC的產(chǎn)物a、RuvA識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)b、RuvB為分枝遷移提供動(dòng)力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸內(nèi)切酶---專一性識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)體外切段連接點(diǎn)以拆分重組體目前三十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?E.coli重組的各階段（損傷修復(fù)）損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生缺口RecA鏈交換第二次鏈交換DNApol通過DNA合成填滿缺口RuvA,B分枝遷移RuvC切割Holliday連接點(diǎn)真核生物同源重組機(jī)制自學(xué)目前三十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)7.2、位點(diǎn)專一性重組（

site-specificrecombination）1、概念：發(fā)生在專一序列而順序極少相同的DNA分子間的重組（包括一些基因表達(dá)調(diào)節(jié)、發(fā)育過程中DNA重排）噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體基因組中屬此種重組2、特征：?在特定的結(jié)合序列部位，有專一的酶催化斷裂重接

----產(chǎn)生精確的DNA重排?都具有整合作用的兩個(gè)基本特征a、典型的保守性重組---交換是相互的和保存原先的DNAb、發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌DNA短同源序列的專一性核苷酸上目前三十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)二、λphage的整合與切除（溶原和裂解狀態(tài)）1、實(shí)現(xiàn)機(jī)制：均是通過---細(xì)菌DNA和λDNA上特定位點(diǎn)之間的重組2、特定位點(diǎn)-----附著位點(diǎn)（attachmentsiteatt）?E.coliattB

含BOB’三序列23bp?λphage

attP

含POP’三序列

240bp?核心序列“O”完全一致

（同源部分）

---位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方?B,B’,P,P’---臂目前三十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)3、整合過程?整合后的附著位點(diǎn)為

attL（BOP’）

attR（POB’）?整合位點(diǎn)---attB、attP

切除位點(diǎn)---attL、attR?整合過程需要λ整合酶

（integraseInt）（λ編碼）和寄主的整合宿主因子IHF

（integrationhostfactor）共同作用目前三十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌體目前四十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)4、整合分子機(jī)制?核心序列O全長(zhǎng)15bp，富含A-T?發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點(diǎn)相距

7bp?整合酶的結(jié)合位點(diǎn)：attP240bp、attB23bp(兩者的作用不同)?attP位點(diǎn)的負(fù)超螺旋為重組所必須---加強(qiáng)了Int和IHF的親和力

-----高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的結(jié)構(gòu)?Int結(jié)合

----核心序列的反向位點(diǎn)（切割位置）

----結(jié)合在att臂上（臂與核心區(qū)靠近）目前四十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)intIHFXis目前四十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?整合體及其作用整合體（intasome）---Int和IHF結(jié)合到attP時(shí)的復(fù)合物?整合體捕獲attB

說明-----

a、attB和attP的最初識(shí)別靠Int

識(shí)別兩序列的能力

b、兩序列的同源性在鏈交換時(shí)為重要因素目前四十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，近而使holliday結(jié)構(gòu)拆分?重組時(shí)attP和attB部位交叉斷裂，互補(bǔ)單鏈末端進(jìn)行交叉雜交目前四十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變目前四十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。目前四十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變P197目前四十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)7.3、轉(zhuǎn)座成分概述1、轉(zhuǎn)座子(元)或轉(zhuǎn)座元件(transposonortransposableelement):

基因組上不必借助于同源序列就可以移動(dòng)的DNA片段，它們可以直接從基因組的一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)（供體和受體）轉(zhuǎn)座（transposition）：轉(zhuǎn)座元的轉(zhuǎn)移過程（不十分確切）2、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展?1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉層花斑突變

玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理

跳躍基因（jumpinggene）?1947冷泉港實(shí)驗(yàn)室（美）BarbaraMcClintock目前四十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)a)不依賴供體序列與靶位點(diǎn)間序列的同源性b)轉(zhuǎn)座不是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制Hotspots(熱點(diǎn))Regionalpreference(在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入)d)某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對(duì)同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性

（免疫性）e)靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù)f)轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組的特點(diǎn)c)轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)（插入專一型）目前四十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)二、Prok.轉(zhuǎn)座子種類?兩種類型：簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）?共同特征：a）兩端有20～40bp的IR(反向重復(fù)序列)b）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的基因1、插入序列（最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子稱作插入序列）?最簡(jiǎn)單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分?命名：IS＋編號(hào)（鑒定類型）長(zhǎng)度700～2000bp目前五十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?特點(diǎn)：a）兩端IR為轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)（突變）

b）插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)的正向重復(fù)（3～9bp）目前五十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?IS可以正反方向插入到DNA（宿主、質(zhì)?；蚰承┦删w），常對(duì)插入位點(diǎn)后面的基因表達(dá)功能產(chǎn)生極性效應(yīng)目前五十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)a)Tn/TnAfamily

l具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp轉(zhuǎn)座酶

regulatorβ-內(nèi)酰胺酶

2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子?兩種類型目前五十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)b）兩端重復(fù)序列為IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子

e.g.

IS插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子ISISISISLISR臂中心區(qū)臂transposition目前五十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?當(dāng)兩個(gè)IS組件相同時(shí)，其中任一個(gè)都可行使轉(zhuǎn)座功能?不同時(shí)，主要依靠一個(gè)?兩側(cè)的IS既可以是IR，又可以是DR狀態(tài)（IR多）目前五十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)3轉(zhuǎn)座噬菌體Muphage

（巨型轉(zhuǎn)座子）

C

repressorforA,BB33kd與轉(zhuǎn)座有關(guān)A70kd轉(zhuǎn)座酶U,S

毒性蛋白attL,attR

與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需GinG區(qū)倒位酶attLCABSUattR150bp1.5kb

G倒位區(qū)38kbPgin?以E.coli為寄主的溫和型噬菌體（溶源、裂解）目前五十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?Mu的插入途徑a）侵入的Mu在溶源化過程中任意插入寄主DNA

（兩側(cè)各5bp的靶位點(diǎn)序列重復(fù)）b）進(jìn)入裂解生長(zhǎng)后，復(fù)制產(chǎn)生后代MuDNA幾乎全部插入寄主

DNA中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座（形成寄主DNA和Mu的共合體），噬菌體成熟時(shí)，切段共合體包裝目前五十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)三、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)作機(jī)制及模式?三種類型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式?實(shí)質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件被復(fù)制并被移動(dòng)到受體位點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)座過程擴(kuò)增了轉(zhuǎn)座子的拷貝（供、受點(diǎn)）?需兩種酶：轉(zhuǎn)作酶（作用于原拷貝兩末端）解離酶（作用于復(fù)制后的拷貝）?模式：目前五十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)?兩大步a)共合體形成切口－連接－復(fù)制目前五十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)b)拆分

靶位點(diǎn)的DR形成目前六十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式?供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂?供體位點(diǎn)如不能被修復(fù)則有致死效應(yīng)目前六十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)五、轉(zhuǎn)座子的某些遺傳學(xué)效應(yīng)－－P157轉(zhuǎn)座可以導(dǎo)致基因變異插入操縱子位置可以影響操縱子下游基因表達(dá)應(yīng)用：難以篩選的基因轉(zhuǎn)移基因定位標(biāo)記篩選插入突變構(gòu)建特殊菌株克隆難以進(jìn)行表型鑒定的基因目前六十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)7.3.6真核生物的轉(zhuǎn)座成分P152自學(xué)目前六十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

真核生物的轉(zhuǎn)座成分根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制目前分為兩類：a)

轉(zhuǎn)座機(jī)制與細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子類似需要轉(zhuǎn)座酶、兩端的IR,轉(zhuǎn)座靶點(diǎn)序列隨機(jī)，遺傳信息：DNA→DNA轉(zhuǎn)座酶、轉(zhuǎn)座因子兩端的IR序列，?玉米的Ac-Ds元件、果蠅的P元件和FB元件等b)

轉(zhuǎn)作機(jī)制類似逆轉(zhuǎn)錄病毒真核生物特有的轉(zhuǎn)座機(jī)制（逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座）遺傳信息：DNA→RNA→DNA逆轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)錄成RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成DNA,插入基因組，類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的作用?如：逆轉(zhuǎn)錄病毒、果蠅的copia元件、酵母的Ty元件逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，P208逆轉(zhuǎn)錄酶生物學(xué)意義：影響其他基因表達(dá)，介導(dǎo)基因重排，促進(jìn)基因的流動(dòng)目前六十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique目前六十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉目前六十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)一、相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體二、基本原理及操作步驟本節(jié)主要內(nèi)容目前六十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆目前六十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。目前六十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等。目的①分離獲得某一目的基因或DNA②獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作，又稱重組DNA技術(shù)。目前七十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶目前七十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基目前七十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease)識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ目前七十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類（基因工程技術(shù)中常用的是Ⅱ類）目前七十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶目前七十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)：

——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目前七十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口目前七十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA目前七十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)（三）目的基因cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)目前七十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA目前八十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。目前八十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。目前八十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)1.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn):

能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。目前八十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)目前八十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列目前八十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

MultipleCloningSites目前八十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)3.柯斯質(zhì)粒(cosmid)pJB8的物理圖譜目前八十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體桿狀病毒載體其他目前八十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)二、重組DNA技術(shù)基本原理目的基因的獲取重組DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

目前八十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程目前九十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

目前九十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)1.化學(xué)合成法由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列目前九十二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)組織或細(xì)胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.基因組DNA文庫目前九十三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目前九十四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制3.

cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目前九十五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細(xì)胞的分子克隆。4.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）目前九十六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)模板DNA引物4種dNTPTaqDNA聚合酶含Mg2+的緩沖液。PCR的反應(yīng)體系

目前九十七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)（1）變性，加熱至95℃，使模板DNA解開成單鏈；（2）退火，溫度降至適宜，使引物與模板互補(bǔ)結(jié)合；（3）延伸，溫度升至72℃，DNA聚合酶以4種dNTP為底物，在引物的3’-OH上，合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈。PCR的基本反應(yīng)步驟及原理

目前九十八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

PCR反應(yīng)條件

變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C目前九十九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)

PCR反應(yīng)的基本原理目前一百頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目前一百零一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目前一百零二頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)不同限制酶切位點(diǎn)的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目前一百零三頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目前一百零四頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目前一百零五頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。目前一百零六頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′

3′5′

5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′

3′

3′5′

5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目前一百零七頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)4.人工接頭(linker)連接由平端加上帶有新的酶切位點(diǎn)的接頭，再用限制性酶切產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。目前一百零八頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ目前一百零九頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌目前一百一十頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)（五）重組體的篩選

1.直接選擇法

(1)抗藥性標(biāo)記選擇

(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)

(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等目前一百一十一頁\總數(shù)一百二十九頁\編于七點(diǎn)(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇