植物基因工程

關于植物基因工程第1頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

轉基因植物(Transgeneplant)是擁有來自其他物種基因的植物。該基因變化過程可以來自不同物種之間的雜交，但現(xiàn)在該名詞更多的特指那些在實驗室里通過重組DNA技術人工插入其他物種基因以創(chuàng)造出擁有新特性的植物。

第2頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)植物基因的克隆與分離第二節(jié)植物基因工程研究常用的基因第三節(jié)植物基因轉移的病毒載體第四節(jié)植物基因轉移的質(zhì)粒載體第五節(jié)植物基因轉化方法第六節(jié)轉基因植物的檢測鑒定

第3頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)植物基因的克隆與分離一、根據(jù)基因的功能分離目的基因但在任何類型的細胞中，都僅有少數(shù)的基因表達成相應的蛋白質(zhì)，而且其表達活性和種類還會隨著發(fā)育階段及環(huán)境因素的變化而變化。因而單從蛋白質(zhì)水平出發(fā)分離目的基因，顯然是存在著相當?shù)碾y度和一定的局限性。

一種比較有效的分離高等植物基因的策略，它涉及目的基因編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分離、純化及突變體表型的互補克隆。

在純化相應的編碼蛋白后，構建cDNA文庫或基因組文庫，DNA文庫中基因的篩選根據(jù)情況主要可用二種辦法進行：

將純化的蛋白質(zhì)進行氨基酸測序，合成寡核苷酸探針從cDNA庫或基因組文庫中篩選編碼基因；(2)將相應的編碼蛋白制成相應抗體探針，從cDNA入載體表達庫中篩選相應克隆。從蛋白到DNA第4頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月二、根據(jù)mRNA特異分離目的基因mRNA差別顯示技術、cDNA代表性差示分析（RDA）2.mRNA差別顯示的技術

1993年，由美國波斯頓Dena-Farber癌癥研究所工作的兩位科學家P.Liang和A.D.Pardee建立。

1.

mRNA差減雜交(subtractivehybridization)技術，又叫差減cDNA克隆

根據(jù)不同材料mRNA種類的差別分離目的基因。只適用于缺失突變體，在很大程度上受生物體核DNA復雜性的影響，而且又存在著實驗周期長、重復性差、效率低等缺點。1992年，美國哈佛大學的F.M.Ausubel實驗室，應用該法從擬南芥菜中克隆到了一個與植物莖桿高度相關的基因，這可能是已見報道的為數(shù)不多的典型例子之一。第5頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月3.cDNA代表性差示分析(representationaldifferenceanalysis)技術，cDNARDA1994年M.Huband和D.G.Scatz在N.Lisitsyn等人的基礎上，發(fā)展了一種用于克隆差別表達的基因的方法。此法保留了差減雜交和差別顯示的精髓，并充分發(fā)揮了PCR反應以指數(shù)形式擴增雙鍵模板而僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性，并通過降低cDNA群體復雜性和多次更換cDNA兩端接頭等方法，特異地擴增目的基因片段。現(xiàn)已被廣泛地應用于分離編碼產(chǎn)與未知的發(fā)育基因。第6頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月Neurospheres(NS)areculturedbytheusualmethods.Sisterculturesaredifferentiatedfor24hoursandeacharesubjectedtorepresentationaldifferenceanalysis(RDA)withtworoundsofsubtraction.Thesubtractedproductsarethenclonedintoplasmids,propagatedinbacteria,andarrayedathighdensityontoaglassslide.ThecustommicroarrayisthenscreenedwithamplifiedcomplementaryDNAderivedfromadifferentsetofneurosphereanddifferentiatingcell(DC)cultures.Thegenesthatareverifiedtobeenrichedinneurosphereculturesarethensubjectedtosequenceanalysisandfurtherscreeningbyinsituhybridization.Cy3andCy5aregreenandredfluorescentdyes,respectively.bFGF,basicfibroblastgrowthfactor;E17,embryonicday17;P0,dayofbirth;P1ctx,postnatalday1cortex.第8頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月三、根據(jù)DNA的插入作用分離目的基因

當一段特定的DNA序列，插入到植物基因組中目的基因的內(nèi)部或其鄰近位點時，便會誘發(fā)該基因發(fā)生突變，并最終導致表型變化，形成突變體植株。如果此段DNA插人序列是已知的，那么它便可用來作為DNA雜交的分子探針，從突變體植株的基因組DNA文庫中篩選到突變的基因。而后再利用此突變基因作探針，就能從野生型植株的基因組DNA文庫中克隆出野生型的目的基因。由于插入的DNA序列相當于人為地給目的基因加上一段已知的序列標簽，因此DNA插入突變分離基因的技術，又叫做DNA標簽法(DNA-tagging)。

DNA標簽法克隆植物組織中的基因是較為常用的一種方法，T-DNA（T-DNAtagging）和轉座子（transposontagging）均可作為基因標簽。第9頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

轉座的結果是使被轉入的基因失活，從而有效地誘導產(chǎn)生表型突變株。然后構建一個對應于突變株的基因庫，用作標簽的轉座子作為探針從基因庫中篩選相對應的克隆，分離得到相對應于變異的基因，這就是轉座子標簽克隆基因。異源轉位子標簽法(hetrologoustransposontagging)

利用已經(jīng)在分子水平上研究得比較清楚的外源轉位子，分離異源基因的技術同源轉位子標簽法(homologoustransposontagging)：

用內(nèi)源轉位子分離同源寄主基因的技術

1.轉座子標簽法（Transposontagging）第10頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）采取農(nóng)桿菌介導等適當?shù)霓D化方法把轉座子導入目標生物體；（2）轉座子在目標生物體內(nèi)的初步定位；（3）轉座子插入突變的鑒定及分離；（4）轉座子在目標生物體內(nèi)的活動性能檢測；（5）對轉座子插入引起的突變體，利用轉座子序列作探針，分離克隆目的基因。轉座子標簽法的主要步驟：(2)其次，轉位子轉位插入突變的頻率比較低，而且在植物基因組中還常常存在著過多拷貝的轉位子序列。因此，應用轉位子標簽法分離植物基因，不僅實驗周期長，工作量大，同時還需花費大量的人力和財力。轉位子標簽法的局限性：(1)首先，轉位子標簽法只適用于存在著內(nèi)源活性轉位子的植物種類。而在自然界中這樣的植物并不多。(3)再者，如果轉位子的轉位插入作用引起了致死突變，或是對于由多基因控制的某種性狀，轉位插入造成的單基因突變就不足以使植株產(chǎn)生出明顯的表型變異，就難以分離到我們所期望的目的基因的。第13頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月Transposontagging,expressionandsequenceofthera1gene

a,DNAgelblotshowingco-segregationofra1-m2andSpm.Lanes1–5,Spmprobe;lanes6–10,sameblotprobedwithDNAflankingtheSpmtransposonthatco-segregatedwithra1-m2.Phenotypesandgenotypesoflanes:1and6,normalhomozygousprogenitorra1+;lanes2and7,mutanthomozygousra1-R;lanes3,4,8and9,somaticmosaicofmutantandnormalheterozygousra1-R/ra1-m2;lanes5and10,normal,heterozygousra1-R/ra1-m2rev4(astable,normalallelederivedfromra1-m2).The5.5-kbfragment(arrowheads)containsbothSpmandra1.The7.8-kbprogenitorra1+fragmentisrestoredbySpmexcision,eitherinvariablestoichiometrieswhenexcisionoccurssomatically(lanes8and9)orentirelywhenitoccursgerminally(lane10).The14-kbfragment(lanes7–10)derivesfromra1-R.b,RNAgelblot.Lane1,vegetativeshootapices;lanes2–6,equallystagedimmaturetassels.c,Singleletteramino-acidcodetranslationofthera1openreadingframe.Solidlineindicatesthezinc-finger,dottedlinehighlightstheEARdomain.Changesinmutantallelesareshownabovethesequence,adjacenttothealleledesignation:insertionlocationsindicatedbycarets;ra1-RSalternativemethioninecodonindicatedwithanarrow;aminoacidchangesshown.d,Multipleaminoacidsequencealignmentofthezinc-fingerandEARdomainsofRA1frommaize(RA1maize),sorghum(S_bicolor_2)andMiscanthus(M_sinensis),andofEPFsfrommaize,rice(AAAA...)andArabidopsis(gi...).Absolutelyconservedresidueshighlightedinred,highlyconservedresiduesinyellow.第14頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

轉座子標簽法不但可以通過上述轉座突變分離基因，而且當轉座子作為外源基因通過農(nóng)桿菌介導等方法導入植物時，還會由于T-DNA（transferredDNA）整合到染色體中引起插入突變，并進而分離基因，因此大大提高了分離基因的效率。第15頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月SystemsforinsertionalmutagenesisinArabidopsis

萘乙酰胺(Naphthaleneacetamide,NAM)IAAH：吲哚乙酰胺水解酶基因(對萘乙酰胺NAM敏感)；NPTII：新霉素磷酸轉移酶基因(對卡那霉素敏感)第16頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月2.T-DNA標簽法花椰菜花葉病毒(CaMV)35S多聚增強子

在根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefactyns)中，存在著一種決定植物產(chǎn)生冠癭病的Ti質(zhì)粒。這種質(zhì)粒的T-DNA能夠發(fā)生高頻的轉移。當根瘤土壤桿菌感染了寄主植物細胞之后，T-DNA通過其兩端的25bp的同向重復序列，完全整合到植物的核基因組上。根據(jù)目前的實驗結果，一般認為T-DNA在植物核基因組中的插入位置是隨機的。在T-DNA標簽法中，可通過在T-DNA序列中插入一個報告基因或是一個增強子，以有利于對轉化的原生質(zhì)體或是培養(yǎng)的細胞進行篩選。T-DNA第17頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月Reversegenetics:Top,genestructureofFASCIATA1withexonsinblueandintronsinyellow.ReddenotesabacterialT-DNAthathasinsertedintothegene.Bottom,mutantslackingthewild-typeFAS1genehavealtereddevelopment.

第18頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第19頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)植物基因工程研究常用的基因一、選擇標記（selectablemarkergenes）標記基因與選擇標記?

如何選擇和篩選轉化體同樣是一個重要問題?？寺〉耐庠茨康幕?，對于植物受體細胞的轉化頻率往往是相當?shù)偷摹Ｔ跀?shù)量龐大的受體細胞群體中，通常只有為數(shù)不多的一小部分獲得了外源的DNA，而其中目的基因已被整合到核基因組并實現(xiàn)表達的轉化細胞，則更加稀少。

為了有效地選擇出這些真正的轉化子，就有必要使用特異性的選擇標記基因(標記基因)?？茖W家一直試圖把轉化體帶上一個標記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標記基因，并已插入各種轉化載體中，作為一種標記基因。第20頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞轉化實驗中，應選擇何種選擇標記基因：1)其代謝產(chǎn)物不干擾寄主細胞的正常的新陳代謝活動；2)為轉化細胞提供抵抗選擇劑抑制作用的能力；3)選擇培養(yǎng)基中所用的抗代謝物對轉化細胞再生植株的生長，不應有明顯的影響。

主要是一類編碼可使抗菌素(諸如新霉素、潮霉素、鏈霉素以及慶大霉素等)或除草劑失活的蛋白酶的基因。第21頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月標記基因抗菌素抗性基因新霉素(neomycin)

磷酸轉移酶基因潮霉素(hygromycin)磷酸轉移酶基因鏈霉素(streptomycin)磷酸轉移酶基因慶大霉素(gentamycin)乙酰轉移酶基因抗除草劑抗性基因膦絲菌素(phosphinothricin)乙酰轉移酶基因，即bar基因5-烯醇丙酮酰草莽酸合成酶基因，即EPSP合成酶基因植物基因工程研究常用的標記基因1.新霉素磷酸轉移酶基因2.Bar基因例：第22頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

卡那霉素是由卡那霉素鏈霉菌(Streptomyceshanamyceticu)產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗菌素，新霉素是弗氏鏈霉菌(Streptompcefradiae)產(chǎn)生的另一種氨基糖苷類抗菌素。這種抗菌素抗菌作用的機理是，通過與30S核糖體亞基的結合作用，而抑制蛋白質(zhì)的合成。將neo基因轉移到真核細胞中表達，同樣能夠使卡那霉素、新霉素以及G418失活。因此，獲得了neo基因的轉基因寄主植物細胞便具備了抵抗這些抗菌素作用的能力。該基因已被廣泛地用作植物細胞轉化的選擇標記基因。不過有許多單子葉植物培養(yǎng)細胞，天然具有抵抗高水平卡那霉素的能力，因此在選用neo作選擇標記基因時，這一點是要認真汲取的。

1.新霉素磷酸轉移酶基因（NeomycinPhosphotransferaseⅡ,

NPT-Ⅱ）第23頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

卡那霉素抗性(Kanr)基因即新霉素磷酸轉移酶基因(NPTⅡ)，亦可稱為氨基糖苷磷酸轉移酶Ⅱ基因(aph2Ⅱ)，它來自大腸桿菌(E.coli)的aphA2基因。是目前在植物基因轉化中應用最廣泛的選擇標記基因。它編碼的產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉移酶(APH(3′)Ⅱ—酶)能對氨基糖苷類抗生素—卡那霉素具有抗性。此酶最早是從細菌轉座子Tn5中分離得到的，它的作用原理是：NPTⅡ基因產(chǎn)物通過酶促磷酸化使氨基糖苷類抗生素失效，從而解除毒性。因為卡那霉素能干擾一般植物細胞葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導致植物細胞的死亡。而轉基因植物由于含有卡那霉素抗性(NPTⅡ)基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素，轉化體就很容易從非轉化體中篩選出來。第24頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

從吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中克隆的bar基因，是一種十分有用的、尤其是對于禾谷類糧食作物特別有效的選擇標記基因。它編碼的膦絲菌素乙酸轉移酶，通過乙酸化作用會使膦絲菌素失去毒性。表達bar基因的植物轉化細胞，在經(jīng)受致死劑量的膦絲菌素處理之后，仍能正常生長或是以接近正常的速率生長，而敏感的非轉化植株則迅速停止生長，并在10—21天內(nèi)死亡。這個選擇標記基因，已成功地應用于水稻、玉米、小麥、高粱以及大麥、燕麥、黑麥等多種禾谷類糧食作物的轉基因研究。當然，在使用除草劑抗性基因bar作為選擇標記基因時。要特別小心，以避免產(chǎn)生抗除草劑的轉基因雜草。2.Bar基因第25頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月A:Transgenicrice(BarGene)B:None-transgenicRice

Transgenicherbicide-resistant（抗除草劑）rice

第26頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月TheseDNAcassetteswereinsertedintoplasmidpJR1withthebargeneunderthecontrolofthe35Spromoterforselectionoftransformantsonbialophos.EiStua1andEiRtua1,sensitiveandresistant-tubulingenes;Zmtub1,-tubullingene;nos,nopalinesynthasegene;term,terminus.第27頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月二、報告基因（reportergene）1.概念：一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控，篩選得到轉化體。

一種理想的報告基因，最基本的要求是在轉化的寄主細胞中應不存在相應的內(nèi)源等位基因的活性，其表達產(chǎn)物不僅不會損害寄主細胞，而且還應具有快速、靈敏、定量和可重復的檢測特性。

2.報告基因的應用：啟動子的檢測、反式作用因子的檢測、相關蛋白質(zhì)的分離、基因工程細胞系的構建。第28頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月3.常用的報告基因

報告基因?qū)嵸|(zhì)上起到了判斷目的基因是否表達的標記基因的作用，故報告基因有時也可叫做選擇標記基因(selectablemarkergene)。目前研究工作者已經(jīng)從大量的基因中挑選出了若干種有用的報告基因。

在植物基因工程研究領域，已使用的報告基因有以下幾種：胭脂堿合成酶基因(nos)、章魚堿合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸轉移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)、慶大霉素轉移酶基因、葡萄糖苷酶基因、熒光酶基因等。第29頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月nos、ocs這兩個基因是致瘤土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒特有的，對Ti質(zhì)粒進行改造，用相應的致瘤農(nóng)桿菌轉化植物體時，如果外源基因轉入植物體中，則這兩種報告基因在植物根莖葉中均能表達，不受發(fā)育調(diào)控，檢測時直接用轉化體提取液進行紙電泳，染色后在紫外光下觀察熒光即可。

nptⅡ、cat及慶大霉素轉移酶基因，均為抗生素篩選基因，相關的酶可以對底物進行修飾(磷酸化、乙酰化等)，從而使這些抗生素失去對植物生長的抑制作用，使得含有這些抗性基因的轉化體能在含這些抗生素的篩選培養(yǎng)基上正常生長，也可以用轉化體提取液體，外用同位素標記，放射自顯影篩選轉化體。第30頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

目前常用的一種報告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，該酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無背景，組織化學檢測很穩(wěn)定，可用分光光譜、熒光等進行檢測。熒光酶基因(luc)是1985年從北美熒火蟲和叩頭蟲cDNA文庫中克隆出來的，該酶在有ATP、Mg2＋、O2和熒光素存在下發(fā)出熒光，這樣就可用轉基因植物整株或部分直接用X-光片或?qū)ｉT儀器進行檢測。例：GUS(β-glucuronidase)、大腸桿菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶、螢光素酶基因、GFP第31頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucurondase，GUS)

大腸桿菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucurondase，GUS)，具有良好的穩(wěn)定性，靈敏度高，易于檢測。作用的底物是無色的X-葡萄糖苷酸(X-glucuronide簡稱Xgluc，是Xgal的類似物)。當把表達β-葡萄糖醛酸糖苷酶的轉基因植物細胞，同5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-glucuronide)一道溫育時，GUS酶就會把反應體系中的此種無色的底物水解產(chǎn)生出深藍色的5-溴-4-氯靛藍。GUS酶的此種顯色水解作用，依所用的X-gluc底物的不同而有所差別。第32頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶

β-(glucuronidase)GUS

轉基因煙草的幼苗，在CaMV-35S啟動子作用下表達

GUS(beta-glucuronidase)，不同的底物顏色不同：轉基因煙草第33頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月promotertrapvectorwithpromoterlessgusgene第34頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月pCAMBIA1301pBS-RSP1/235SHyg(R)T3PGusRSP2LacZNcoIpCAM-GusBamHIHindIIIKpnIBamHIKpnIHyg(R)T7PGusRSP1KpnIBamHIGusNos3’pCAM-RSP1/2-GusHyg(R)35S35S35SRSP2RSP1KpnI用KpnI和BamHI雙酶切后連接BamHINos3’Nos3’LBRB(1715bp)Firstintron(1182bp)LBLBRBRB水稻蔗糖合酶基因啟動子驅(qū)動Gus基因的表達載體構建第35頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月螢光素酶基因

使用β-葡萄糖醛酸糖苷酶的編碼基因gusA作報告基因有一個明顯的缺點，即組織化學檢測法會使細胞致死。若是改用螢光素酶的編碼基因(luc)則可避免細胞致死，而且表達目的基因的活細胞的分布狀況還可根據(jù)螢光的產(chǎn)生被測定出來。因此，被廣泛地用作植物基因工程研究的報告基因。

最常用的是來自螢火蟲(Photinuspyralis)的螢光素酶(luciferase)。這是一種分子量為60.7kD的單體蛋白質(zhì)多肽，共有550個氨基酸，它的編碼基因luc已經(jīng)被克隆。

第36頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

LucReporterGeneSystem

Photinuspyralis螢光素酶基因（luciferase）第37頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月promotertrapvectorwithpromoterlessfireflyluciferasegene第40頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月GFP

(GreenFluorescentProtein)

綠色熒光蛋白是一些腔腸動物所特有的生物熒光素蛋白。生物熒光素蛋白是指存在于生物體內(nèi)，能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的蛋白質(zhì)。它可與目的基因構成嵌合基因，從報告基因的表達了解目的基因表達情況。第41頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月被煙草花葉病毒感染的煙草，通過GFP可觀測病毒的侵染。

檢測方法：對于轉化細胞可用藍光照射，在顯微鏡下分揀發(fā)出強烈綠色熒光的細胞。對于轉化植株，可在激發(fā)光照射下利用解剖照相系統(tǒng)進行綠色熒光蛋白檢測和定位。第42頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月報告基因β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)基因熒光素酶(luciferase)基因氯霉素乙酰轉移酶(chioramphenicolacetyltransferase)基因β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)基因胭脂堿合成酶(nopalinesynthetase,nos)基因章魚堿合成酶(octopinesynthetase,ocs)基因乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthetase)基因蘇氨酸脫水酶(threoninedehydratase)基因綠色熒光蛋白質(zhì)(greenfluorescentprotein)基因植物基因工程研究常用的報告基因第43頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月三、抗蟲基因1.微生物源的抗蟲基因；2.植物源的抗蟲基因；3.動物源的抗蟲基因。

蟲害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的最重要的自然災害之一，全世界每年糧食總產(chǎn)量因病蟲害而減產(chǎn)的幅度約為37％，其中僅蟲害一項就占13％，經(jīng)濟損失達數(shù)千億美元(轉引自L.Jouanin，1998)。目前農(nóng)作物的蟲害防治，仍然是主要依靠化學農(nóng)藥(agrochemicals)的使用。但它同時也存在著諸多方面的弊端，直接地影響到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的進一步發(fā)展。植物基因工程的建立，特別是轉基因技術的應用，為農(nóng)業(yè)害蟲的防治提供了一條全新的途徑。第44頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月微生物源的抗蟲基因

cry基因：蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)最早于1902年在日本國發(fā)現(xiàn)，1911年在德國再次被發(fā)現(xiàn)并得鑒定，是一種格蘭氏陽性細菌。在它的孢子形成過程中，合成出大量的殺蟲結晶包涵體(insecticidalcrystallineinclusions)，其中的晶體蛋白質(zhì)(crystallineprotein，Cry)是由叫做σ-內(nèi)毒素(σ－endotoxins)的原毒素亞基(protoxinsubunit)組成的。大多數(shù)的蘇云金芽孢桿菌菌株都會產(chǎn)生一系列的σ-內(nèi)毒素，它對許多昆蟲都具有特異的毒性，故這種蛋白質(zhì)又叫做殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystalprotein，ICP)，或蘇云會芽孢桿菌毒蛋白(Bttoxin)。此外，蘇云金芽孢桿菌在生長及芽孢形成期間，還能分泌一些外毒素，叫做蘇云金毒素或β-外毒素(β-exotoxin)，同樣也具有抑制幼蟲生長的能力。第45頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月Cry基因轉雙抗蟲基因741楊優(yōu)良白楊雜種741楊表達載體上構建了兩種不同殺蟲機制的BtCryIAc基因和慈菇蛋白酶抑制劑基因（API）。并獲得了一批對多種鱗翅目害蟲具有高抗蟲性的株系。國內(nèi)第一批應用于商品化生產(chǎn)的轉基因樹木品種。

第46頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月植物源的抗蟲基因

1）蛋白酶抑制劑基因：

在昆蟲的體內(nèi)存在著一些特殊的蛋白酶；常見的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等絲氨酸類蛋白酶。這些蛋白酶是昆蟲生理代謝過程中的必要成分，負責裂解和消化食物中的蛋白質(zhì)。一旦昆蟲體內(nèi)的這些蛋白酶的活性受到抑制，就將無法消化食物中的蛋白質(zhì)成分，致使饑餓而死亡。

有一些植物在長期的進化過程中，產(chǎn)生出了一種用以抵抗害蟲侵染的天然的免疫體系，在這類植物細胞中含有相當豐富的蛋白酶抑制劑(proteinaesinhibitor，PI)，它可使昆蟲體內(nèi)相應的蛋白酶喪失活性。植物的蛋白酶抑制劑，是一類小分子量的蛋白質(zhì)(5～25kD)，共有10個家族。根據(jù)它們作用的靶酶，又可分成四種不同的類型：絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和天冬氨酰蛋白酶抑制劑(aspartylproteaseinhibitor)。若干種已報道的表達蛋白酶抑制劑的轉基因植物的抗蟲特性。

第47頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月植物蛋白酶抑制劑家族及類型（1）S=絲氨酸蛋白質(zhì)酶抑制劑；M=金屬蛋白酶抑制劑；

C=半胱氨酸蛋白酶抑制劑；A=天冬氨酸蛋白質(zhì)抑制劑。（2）Bowman-Birk系指發(fā)現(xiàn)這種蛋白酶抑制劑的兩位科學家的姓氏。序號家族類型（1）1大豆胰蛋白酶抑制劑家族(Soybeantrypsininhibitorfamily)S2Bowman-Birk抑制劑家族(Bowman-Birkinhibitorfamily)S3大麥蛋白酶抑制劑家族Barleytrypsininhibitorfamily)S4馬鈴薯抑制劑Ⅰ家族(PotatoinhibitorⅠfamily)S5馬鈴薯抑制劑Ⅱ家族(PotatoinhibitorⅡfamily)S6南瓜抑制劑家族(Squashinhibitorfamily)S7Ragi1-2/玉米雙功能抑制劑家族Ragi1-2/maizebifunctionalinhibitorfamily)S8羧肽酶A、B抑制劑家族(CarboxypeptidaseA,Binhibitorfamily)M9半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族(Cysteineproteaseinhibitorfamily)C10天冬氨酸蛋白酶抑制劑家族(Aspartylproteaseinhibitorfamily)A第48頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月若干種已報道的表達蛋白酶抑制劑的轉基因植物的抗蟲的特性植物基因類型目標昆蟲煙草CpTI豇豆絲氨酸PI鱗翅目昆蟲：煙草天蛾(ManducaSexta)

煙草夜蛾(Heliothisvirescens)煙草PPI-IITI-II馬鈴薯絲氨酸PI番茄絲氨酸PI鱗翅目昆蟲：煙草天蛾(ManducaSexta)煙草夜蛾(Heliothisvirescens)煙草PPI-II馬鈴薯絲氨酸PI鱗翅目昆蟲：南方錁紋夜蛾(Chrusodeixiseriosoma)

煙草SpTi-I甜味馬鈴薯PI鱗翅目昆蟲：淡邊翅夜蛾(Spodopteralitura)

水稻CpTI馬鈴薯絲氨酸PI鱗翅目昆蟲：番茄蛾(Lacanobiaoleracea)

水稻PPI-II豇豆PI鞘翅目昆蟲：山楊葉甲(Chrysomelatremulae)

馬鈴薯CpTI豇豆PI鱗翅目昆蟲：番茄蛾(Lacanobiaoleracea)白楊OCI水稻半胱氨酸PI鞘翅目昆蟲：山楊葉甲(Chrysomelatremulae)豌豆

а-AI菜豆а-淀粉酶I鞘翅目昆蟲：四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)豌豆а-AI菜豆а-淀粉酶I鞘翅目昆蟲：豌豆象(Bruchuspisorum)Azukibeanа-AI菜豆а-淀粉酶I鞘翅目昆蟲：綠豆象(Callosobruchuschinensis)

四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)

鷹嘴豆象(Callosobruchusanalis)

第49頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月半胱氨酸蛋白酶抑制劑

CysteineproteinaseinhibitorPredictedthreedimensionalstructureoforyzacystatin-ⅠI.Oc-Ⅰ(lightblue)ispositionedabovetheactivesiteofpapain木瓜蛋白酶(darkbluewiththeactivecysteineshowninyellow)toshowhowthetwomoleculesmayinteract半胱氨酸蛋白酶抑制劑(oryzacystatin-Ⅰ)

可以抑制木瓜蛋白酶的活性，其mRNA在水稻開花兩周時表達量最高，到種子成熟時則下降到了難以檢測的程度。第50頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月PictureoftomatohairyrootsEffectofhairyrootsexpressingacystatinonthegrowthofGloboderapallida.Redgrowthcurvedescribesthoseanimalscollectedfromtransgenicplantsexpressingthecystatin,thebluegrowthcurvedescribesanimalscollectedfromwildtypeplants.Picturesshowrepresentativeanimalscollectedfromthetwosetsofplants.Thedensityofanimals,theirgrowth,developmentandfecunditywereallaffected.第51頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月α-淀粉酶抑制劑基因淀粉酶抑制劑基因

α-淀物酶抑制劑(α-amylaseinhibitor，α-AI)最初定名為凝集素類蛋白質(zhì)(lectin-likeplotein)，它在高等植物，尤其是禾谷類作物和豆科作物的種子中，存量相當豐富。它們能夠同一些昆蟲腸道中的淀粉酶形成復合物，從而抑制淀粉酶的活性，因此α-淀粉酶抑制劑劉在植物防衛(wèi)昆蟲侵害方面起著重要的作用。

α-淀粉酶抑制劑、植物凝集素(phytohemagglutinin，PHA)以表殼蛋白(arcelin，ARL)，三者組成了一種植物防衛(wèi)蛋白質(zhì)(plantdefenceproteins)家族。。第52頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月α-淀粉酶抑制劑（α-amylaseinhibitor）AIα-淀粉酶抑制劑與哺乳動物或鞘翅目昆蟲腸道中的結合α-淀粉酶形成復合物的方式，抑制淀粉酶的活性。植物防衛(wèi)蛋白質(zhì)（plantdefenceproteins）:植物凝集素（phytohemagglutinin,PHA）通過同哺乳動物或昆蟲的腸道粘膜上的糖蛋白結合，發(fā)揮毒性表殼蛋白(arcelin,ARL)有待于作進一步闡明，可能具有毒性，可能難以消化第53頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月煙草花葉病毒（tobaccomosiavirus）TMV第54頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月凝集素基因高等植物的許多組織，特別是種子和貯藏器官中，含有豐富的凝集素(lectins)，這是一類結合碳水化合物的蛋白質(zhì)(carbohydrate-bindingproteins)。事實已經(jīng)證明，凝集素對于哺乳動物和鳥類是有毒性的，同時也已經(jīng)觀察到(Homoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)和雙翅目(Diptera)的昆蟲均有毒害作用。然而有關其確切的作用機理，目前尚不清楚。第55頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月其它植物來源的抗蟲基因幾丁質(zhì)酶的確會干擾昆蟲的消化作用。幾丁質(zhì)酶的編碼基因已經(jīng)克隆，并被導入到其它植物。例如，在轉基因的馬鈴薯植株中芽豆幾丁質(zhì)酶的表達，雖然對于鱗翅目昆蟲番茄蛾的生長與發(fā)育并無有害的影響，但卻使茄無網(wǎng)蚜蟲的生殖力(fecundity)明顯地下降。

煙草陰離子過氧化物酶(anionicperoxidase)的編碼基因，當其被轉移到不同種的煙草、番茄以及膠皮糖香樹(sweetgun)中超量表達時，會對許多種鱗翅目昆蟲、鞘翅目昆蟲，以及紫色馬鈴薯蚜蟲產(chǎn)生高水平的抗性。第56頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月動物源的抗蟲基因

主要集中于哺乳動物的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因和煙草天蛾的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因?；虍a(chǎn)物目標昆蟲轉基因植物蛋白酶抑制劑煙草天蛾的抗胰凝乳蛋白酶同翅目昆蟲同翅目昆蟲棉花，煙草煙草天蛾的抗彈性蛋白酶紫苜蓿，棉花，煙草а1-抗胰蛋白酶（а1-AT）鱗翅目昆蟲馬鈴薯煙草天蛾的抗胰蛋白酶同翅目昆蟲棉花，煙草牛胰腺胰蛋白酶抑制劑鱗翅目昆蟲萵苣，矮牽牛，馬鈴薯正翅目昆蟲煙草，白車軸草脾抑制劑（SI）鱗翅目昆蟲馬鈴薯幾丁質(zhì)酶煙草天蛾幾丁質(zhì)酶鱗翅目昆蟲煙草動物源抗蟲基因及其在轉基因植物中的表達

第57頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月四、抗病基因

1)抗病毒基因

病毒交叉保護作用:早在1929年H.H.Mckinney就已經(jīng)觀察到，感染了某種溫和病毒株(mildvirusstrain)的植物，能夠抵抗同種或相關的烈性病毒株(severevirusstrain)的感染。這種現(xiàn)象叫做交叉保護作用(crossprotection)，它在許多病毒中普遍存在。近年來，在表達正鏈RNA病毒外殼蛋白基因的轉基因植株中，也觀察到了類似的保護作用。病毒外殼蛋白是交叉保護作用的關鍵因子

兩種病毒外殼蛋白質(zhì)接近，交叉保護作用的效果就越強烈。據(jù)此科學工作者設想，將編碼外殼蛋白的基因克隆出來，并導入到敏感的植株進行表達，應有可能使之獲得抵抗相關烈性病毒株侵染的能力。后來的實驗證明了這一觀點的可行性。

第58頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)抗細菌基因

抗細菌的蛋白質(zhì)(antibacterialproteins)是許多動物，包括節(jié)肢動物(尤其是昆蟲)、兩棲動物以及哺乳動物，抵抗病原微生物侵害的防衛(wèi)機理的重要成分。這類蛋白質(zhì)對眾多的格蘭氏陰性細菌及格蘭氏陽性細菌，均具有滅活作用。其編碼基因已經(jīng)克隆、并已在轉基因植株中表達的抗細菌蛋白質(zhì)，有昆蟲的裂解肽(lyticpeptides)和溶菌酶(lysozymes)兩大類。(3)抗真菌基因

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在自然界中有許多植物、動物和微生物，都能夠產(chǎn)生出抗真菌的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在有一部分抗真菌蛋白質(zhì)的編碼基因已經(jīng)被克隆，并被轉化到有關的植物當中，獲得了抗性的表達。常見的有：幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶基因、核糖體失活蛋白基因、防衛(wèi)蛋白基因、硫蛋白素。

第59頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月轉Ｘa21基因抗白葉枯病水稻第60頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月4)植物抗病的分子機理

植物的防衛(wèi)反應

感染植物的病原微生物有病毒、細菌和真菌三大類。植物體本身具有抵抗病原微生物的兩種防衛(wèi)系統(tǒng)：

被動的防衛(wèi)系統(tǒng)是植物對付廣譜病原微生物侵染的機械防御體系比如在細胞外壁上形成角質(zhì)、蠟質(zhì)、栓質(zhì)以及木質(zhì)素等附屬結構物。而主動防衛(wèi)體系，則是植物體針對特異性病原微生物侵染的一種特殊的防衛(wèi)反應。

目前已從多種植物病原微生物中，分離到了可激活植物發(fā)生防衛(wèi)反應的激活子(elicitor)。它可通過與存在于植物細胞表面的受體蛋白質(zhì)之間的結合作用，而激活植物發(fā)生防衛(wèi)反應，包括過敏性反應(hypersensitiveresponse，HR)和系統(tǒng)獲得性抗性(systemicacquiredresistance，SAR)兩種類型。與此相對應，病原微生物還存在一種抑制子，它可能通過干擾激活子與受體蛋白質(zhì)之間的結合作用、信號傳導通路、基因表達的啟動以及某些防衛(wèi)蛋白質(zhì)的活性等多種途徑，來抑制植物的防衛(wèi)系統(tǒng)，從而完成病原微生物的致病作用。

第61頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月植物抗病基因與病原體無毒基因

早在1941年，H.H.Flor等人提出了描述植物與病原體之間相互關系的“基因?qū)颉钡募僬f(“gene-for-gene”hypothesis)。該假說認為，毒性病原體的無毒祖先菌株，攜帶有一種專門對具有相應R基因的寄主植株無毒害作用的無毒基因(avirulencegene，Avr)；對病原體抗性(或不相容性)的植株必定存在著一種R基因，而在病原體中也必定存在著一種與之相應的Avr基因；這兩種基因中的任何一種的缺失或功能的喪失，寄主植株與病原體之間就不能發(fā)生相互作用，抗病反應就不會被激活，結果導致寄主植株染病(或與病原體相容)。

在“基因?qū)颉奔僬f的基礎上，人們又提出了一種描述R基因功能的激發(fā)子-受體模型(elicitor/receptormodel)。根據(jù)這個模型，R基因編碼的受體蛋白質(zhì)，通過與病原體Avr基因編碼的配體蛋白質(zhì)之間的相互作用，使寄主植物能識別感染的病原體。由此看來，R基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可能有兩種不同的功能：其一是分子識別，其二是激發(fā)植株發(fā)生防衛(wèi)反應。

第62頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

五、非生物脅迫的抗性基因

(1)重金屬抗性基因

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)，是一類在生物界廣泛分布的、小分子量的、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白質(zhì)。由于這類蛋白質(zhì)與重金屬離子，諸如鎘(Cd)、鋅(Zn)、銅(Cu)、汞(Hg)、金(Au)、銀(Ag)、鈷(Co)、鎳(Ni)等，具有高度穩(wěn)定的結合能力。到目前為止，已經(jīng)分離了100多種金屬硫蛋白基因。

(2)抗鹽基因

人們發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下生長的植物細胞中，會累積許多種低分子量的滲透調(diào)節(jié)劑，諸如甜菜堿(betaine)、脯氨酸(proline)以及糖醇(sugaralcohols)類物質(zhì)包括甘露醇(mannitol)和山梨醇(sorbitol)等，從而使植物獲得抵抗鹽脅迫的能力。目前，以提高滲透調(diào)節(jié)劑合成水平為目標的植物耐鹽基因工程已經(jīng)開展，并已取得了若干有意義的實驗結果。

betaine第63頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)抗低溫脅迫基因

在自然界中，因低溫(coldtemperature)脅迫對農(nóng)作物造成的冷害(coldinjury)，包括寒害(chillinginjury)和凍害(freezinginjury)兩個方面，兩者之間是有著明確的界限的。一般說來，寒害是指0℃以上的低溫對農(nóng)作物生長造成的傷害，而凍害則是指0℃以下的低溫對農(nóng)作物的生長造成的傷害，主要是植物體內(nèi)結冰，導致細胞受傷，甚至死亡。

農(nóng)作物的抗寒性狀，往往是受多基因控制的，這些基因的表達特性可分為誘導型的和組成型的兩大類。農(nóng)作物在0℃以上低溫的環(huán)境下經(jīng)過一段時間的抗寒鍛煉或低溫適應性生長之后，就會被誘導合成出許多與抗寒性狀有關的蛋白質(zhì)，我們特稱此類蛋白質(zhì)的編碼基因為冷誘導基因(coldinduciblegene)或冷調(diào)節(jié)基因(coldregulatedgene)。目前研究較多的是，甘油-3-磷酸酯?；D移酶(glycerol-3-phosphateacyltransferase)基因。

第64頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

農(nóng)作物的抗凍性(freezingtolerance)是同抗凍蛋白(antifreezeprotein，AFP)的作用密切相關的。抗凍蛋白質(zhì)是一類能夠抑制體液中冰晶生長的特殊的蛋白質(zhì)，它可以使水溶液的冰點下降，但對熔點的影響卻十分微弱，這就造成了水溶液的冰點和熔點之間出現(xiàn)差值。我們稱這種差值為熱滯活性(thermalhysteresisactivity，THA)，因而抗凍蛋白質(zhì)亦叫做熱滯蛋白(thermalhystereslsnrotelns，TBPs)。目前，已經(jīng)從海洋魚類的血清中發(fā)現(xiàn)了抗凍的蛋白質(zhì)，而有關植物抗凍蛋白的報道比較少，近年來已從冷誘導的黑小麥葉片類囊體中分離到了部分純化的植物抗凍蛋白。已有一些研究工作者開始使用抗凍蛋白基因進行轉基因植物方面的試驗。這些試驗最主要的一個結果是，證實了來自魚類的抗凍蛋白基因是能夠在轉基因植物中正確表達的。

第65頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)抗除草劑基因

應用基因工程技術，培育具有抗除草劑特性的轉基因農(nóng)作物，不僅可以克服化學除草劑的花費大、專一性低等局限性，還可避免因之造成的環(huán)境污染和生態(tài)失衡的問題。

目前，在發(fā)展用于培育抗除草劑轉基因農(nóng)作物的研究策略方面，已經(jīng)取得了明顯的進展。第一種策略是，利用能解除化學除草劑毒性的外源基因轉化目標作物。第二種策略是，使除草劑作用的目標蛋白質(zhì)超量表達。第三種策略是，表達脫敏感的目標蛋白質(zhì)(desensitizedtargetprotein)。第66頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月(5)抗氧化脅迫基因

大氣中的氧和綠色植物光合作用產(chǎn)生的氧，在各種不同的生理脅迫的條件下，特別是在光合作用電子轉運被阻斷的情況下，便會在植物細胞中被還原成總稱為活性氧的高毒性的化學物質(zhì)，包括過氧化氫、羥自由基以及超氧化物陰離子等。經(jīng)過長期自然選擇的結果，植物已進化出了處理這類毒性物質(zhì)的相應的機理，包括過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等的催化作用。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)能夠?qū)蓚€超氧化物陰離子自由基，轉換成過氧化氫和分子氧。由此產(chǎn)生的過氧化氫又會被細胞中的過氧化物酶或過氧化氫酶分解成水。因此SOD酶能夠?qū)⒅参锛毎械亩拘晕镔|(zhì)超氧化物陰離子清除掉。

植物基因工程學家將超氧化物歧化酶的編碼基因克隆出來，插入到植物細胞當中，由于超氧化物歧化酶表達的結果，轉基因植物獲得了抵抗活性氧毒害的能力。第67頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物病毒及其它的一些病原體，是一類能夠在感染的植物寄主細胞中進行復制和表達的“外來的”核酸類型。它們本身不能編碼為其整個復制周期所需要的全部的產(chǎn)物，必須依賴并適應于寄主細胞的功能。它們除了具有與其復制及轉錄有關的一些酶的識別序列之外，還編碼有一些可改變寄主功能的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。

以植物病毒作為植物基因工程的克隆載體具有的優(yōu)點。第一，有一部分植物病毒對寄主的感染是系統(tǒng)性的，它能夠?qū)⑵浠蚪M擴散到被感染植株的所有細胞。第二，植物病毒載體，如雙子座病毒組病毒(geminiviruses)由于具有廣泛的寄主范圍，存在著被發(fā)展作為單子葉植物基因克隆載體的潛力。第三，被感染的植株能夠繁殖出大量的病毒顆粒。

類型：單鏈的RNA植物病毒、單鏈的DNA植物病毒和雙鏈的DNA植物病毒。第三節(jié)植物基因轉移的病毒載體第68頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病毒介導的轉染程序

隨著植物病毒分子生物學及遺傳學研究的不斷深入，用病毒基因組作為載體轉化植物細胞日益受到人們的重視，因為病毒載體能將外源基因?qū)胫参锏乃薪M織和細胞中，而且不受單子葉或雙子葉的限制。在大約300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒約占91%，雙鏈RNA病毒、雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。利用植物病毒載體轉化植物細胞大致有以下兩種戰(zhàn)略：第69頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月一、單鏈RNA植物病毒

大約90％以上的植物病毒的遺傳物質(zhì)，都是具有感染性的正鏈RNA(即mRNA)。在RNA病毒中，研究比較詳細的是一種小型多組分的雀麥草花葉病毒。根據(jù)P.AhlgUISt的報道，BMV可以感染包括禾谷類作物在內(nèi)的許多種單子葉植物。

TMV病毒的基因組是一種單鏈互補的RNA，亦即是一種信使RNA。1、單鏈RNA植物病毒第70頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第71頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月TobaccoMosaicVirusSchematicrepresentationoftheTMVagroinoculationdeliveryvectorsusedtoinfectplants.

(a)Infectionwiththe'unmodified'vectorresultsinfewGFP-fluorescentlesionsonplantleaves.(b)Infectionwiththe'modified'vectorresultsinmostofthecellsoftheleafshowingGFPfluorescence.

第72頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月2、單鏈植物DNA病毒

雙子座病毒組病毒(Geminiviruses)，是一類具有成對或成雙顆粒的單鏈DNA植物病毒。這類病原體專門侵染寄主植株的韌皮部組織，并在細胞核中進行復制和增殖，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害相當嚴重。雙子座病毒組病毒具有廣泛的寄主范圍，對單子葉及雙子葉植物都有感染性。

雙子座病毒的基因組比較小，其分子大小約為2.5～3.0kb，而且主要是由環(huán)狀的DNA分子組成。具有2種不同的分子，是一種二連的基因組(bipartitegenome)。

番茄金色花葉病毒(tomatogoldenmosaicvirus

)是一種雙子座病毒組病毒，是最有發(fā)展前途被發(fā)展作為植物基因轉移載體的一種。

第73頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

第74頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月轉染植物組織雙生病毒家族成員蕃茄金花葉病毒（TGMV）克隆表達載體的構建程序第75頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月三、雙鏈DNA植物病毒

花椰菜花葉病毒組(Caulimoviruses)是唯一的一群以雙鏈DNA作為遺傳物質(zhì)的植物病毒,這一組病毒共有12種。寄主范圍比較局限，雖然在實驗室中可以轉移到十字花科以外的少數(shù)幾種植物，而在自然界中則只感染十字花科的若干種植物。

花椰菜花葉病毒組病毒，誘導被感染的細胞形成一種折射性的圓形包涵體(inclusionbody)。包涵體可能是聚集病毒的場所。

花椰菜花葉病毒(CaMV)，是花椰菜花葉病毒組中研究得最為詳盡的一種典型的代表性病毒。

第76頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物雙生病毒（Geminiviruses）為一單鏈DNA病毒，成熟的雙生病毒呈雙顆粒狀，每一個顆粒中含有一條不同的DNA單鏈。其中A鏈能單獨在植物細胞中復制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B鏈編碼另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B兩條鏈必須同處于一個植物細胞中，方能形成有感染力的病毒。雙生病毒具有廣泛的宿主細胞范圍，因此是一種很有潛力的植物病毒載體。

轉染植物組織第77頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月有兩種主要辦法可以用來檢驗CaMVDNA作為植物基因工程克隆載體的可能性。一種是從分子水平上研究CaMVDNA的復制及表達(即DNA的轉錄與轉譯)，并鑒定出具有基本功能的DNA區(qū)段。另一種辦法是測定DNA的缺失或外源DNA的插入對CaMVDNA的感染性造成的影響。

存在的困難：CaMV雖然可以作為承載小片段外源DNA插入的克隆載體，但由于在它的大多數(shù)限制酶位點中插入外源DNA都會導致病毒的失活，而且它不能包裝具300bp以上插入片段的重組體基因組，同時CaMV的絕大多數(shù)基因都是必不可少的，不能被外源DNA所取代。

多年來有關CaMV克隆載體的設計思想，主要集中在以下三個方面：第一，由缺陷性的CaMV病毒分子同輔助病毒分子組成互補的載體系統(tǒng)；第二，將CaMVDNA整合在Ti質(zhì)粒DNA分子上，組成混合的載體系統(tǒng)；第三，構成帶有CaMV355啟動子的融合基因，在植物細胞中表達外源DNA。第78頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第79頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

以雙鏈DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因組作為載體，去除有關的致病性基因，換上外源基因，體外包裝成有感染力的病毒顆粒，轉染植物細胞原生質(zhì)體，并由此再生成整株植物。第80頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)植物基因轉移的質(zhì)粒載體一、病原土壤桿菌根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobateriumrhizogenis)Ti(Tumer－inducingplasmid）Ri(Root－inducingplasmid）冠癭病毛根病冠癭瘤產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長迅速，不斷分枝。誘導冠癭瘤及合成冠癭堿第81頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月二、植物冠癭的誘發(fā)與冠癭細胞的特性

冠癭瘤的侵染過程：細菌通過傷口進入植物，在基因水平上轉化植物。細菌DNA中的編碼基因在植物細胞中表達，刺激植物細胞不受控制的分裂，形成瘤。

根癌農(nóng)桿菌侵染植物后產(chǎn)生兩種物質(zhì)：類植物激素和冠癭堿。類植物激素使細胞大量擴增，出現(xiàn)冠癭瘤；冠癭堿是受侵染植物組織合成的稀有氨基酸（正常植物不能夠合成的的分子量的堿性氨基酸衍生物），是根癌農(nóng)桿菌生活的C、N和能量來源。

根據(jù)其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿堿型（agropine）和農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)第82頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月三、Ti質(zhì)粒的遺傳特性Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D,約有200kb組成。第83頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月ThenaturalinfectioncycleofA.tumefaciens

第84頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒的基因位點及其功能區(qū)域T－DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，故稱之為轉移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。Vir區(qū)（virulenceregion）：該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，合起來約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。Con區(qū)（regionsencodingconjugations）：該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉移相關基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質(zhì)粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。Ori區(qū)（originofreplication）：該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復制起始。(腫瘤基因)第85頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月章魚堿pTiAch5和胭脂堿pTiC58質(zhì)粒的遺傳圖第86頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒的遺傳功能參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些細胞分裂素的活動。1)為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力5)決定寄主菌株的植物寄主范圍3)賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力4)賦予寄主菌株對土壤桿菌所產(chǎn)生的細菌素的反應性

有的Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長與發(fā)育，即具有對噬菌體的“排外性”2)誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導的腫瘤的形態(tài)學特征和冠癭堿成分Opine代謝區(qū)合成吲哚乙酸合成植物分裂素合成氨基酸衍生物－冠癭堿第87頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制

損傷的植物根部會分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸，它們能誘導Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根瘤菌染色體上的一個操縱子表達。vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結合形成復合物，后者轉化植物根部細胞。乙酰丁香酸第88頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月T-DNA的染色體整合機制第89頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月四、T-DNA的結構與功能第90頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.T-DNA的發(fā)現(xiàn)

Chilton等人（1982）利用同位素標記的Ti質(zhì)粒做探針發(fā)現(xiàn)，加入高濃度煙草腫瘤細胞的DNA后，Ti質(zhì)粒DNA的復性速度有加快的趨勢。這表明腫瘤DNA中有Ti質(zhì)粒的順序，但該順序不多，而且沒有檢測到完整的Ti質(zhì)粒。以后這些作者將章魚堿型的Ti質(zhì)粒B6-806用內(nèi)切酶SmaI分解成19個片段，分別用同位素標記做成探針，然后與腫瘤DNA進行分子雜交，結果有二段Ti質(zhì)粒的DNA（3b和10c。）能和腫瘤DNA雜交，也就是Ti質(zhì)粒中這兩段DNA是與腫瘤DNA同源的部分。進一步研究證明，這部分DNA是從質(zhì)粒DNA上切割后，轉移到腫瘤細胞，故稱之為轉移DNA（transferred-DNA）。這是首次證明在高等植物的細胞內(nèi)存在有微生物的DNA順序。第91頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月2.T-DNA的結構特點

Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)的長度約為23kb；

T-DNA僅存在于植物腫瘤細胞的核DNA中，T-DNA含有激發(fā)和保持腫瘤狀態(tài)所必需的基因，T-DNA和植物DNA之間沒有同源，在T-DNA的5′端和3′端都有真核表達信號。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。

T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復序列，即邊界序列（bordersequence），分別稱之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。該25bp邊界序列屬保守序列,但通常右邊界（TR）序列更為保守，左邊界(TL)序列在某些情況下有所變化。其核心部分是14bp，可分為10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)兩部分,是完全保守的。左邊界（TL）缺失突變?nèi)阅苤铝?但右邊界（TR）缺失則不再能致瘤,這里幾乎完全沒有T-DNA的轉移,這說明右邊界(TR)在T-DNA轉移中的重要性。

第92頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月T-DNA區(qū)基因的功能

研究方法：用遺傳學方法在T-DNA區(qū)中引入轉座子，使特定的基因發(fā)生突變，從而在腫瘤細胞中T-DNA的一個或多個轉錄產(chǎn)物也隨之消朱。基因突變后不能轉錄出它所編碼的

mRNA，這時可觀察到帶有突變基因的T-DNA的植物細胞的表型，從而確定這些基因轉錄產(chǎn)物的功能。用這種方法證明了編碼兩類轉錄產(chǎn)物的基因序列：

第93頁，課件共117頁，創(chuàng)作于2023年2月3.Ti質(zhì)粒作為植物基因工程的載體

1、可行性2、存在缺陷（1）轉化植物細胞很難形成完整植株。（2）質(zhì)粒上分布著多個酶切位點，而不是單一切點，酶切后不易成環(huán)，給插入目的基因帶來困難。（3）Ti質(zhì)粒只能在農(nóng)桿菌中復制、繁殖而擴增，可農(nóng)桿菌對Ti的轉化率