第五章實(shí)驗(yàn)中的樣本制備詳解演示文稿

第五章實(shí)驗(yàn)中的樣本制備詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)優(yōu)選第五章實(shí)驗(yàn)中的樣本制備目前二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)但由于傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟，不但繁瑣，而且增加了環(huán)境因素對(duì)標(biāo)本以及標(biāo)本間相互污染的機(jī)會(huì)，不但在RNA檢測(cè)時(shí)，易出現(xiàn)假陰性，而且當(dāng)使用極為敏感的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）及體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)，易得到假陽性結(jié)果。目前三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)同時(shí)，由于這些方法要用到一些揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，故對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的身體健康有一定的影響。因此，簡(jiǎn)單而又高效且無需使用酚和氯仿的核酸提取方法對(duì)上述敏感的基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用有重要意義。目前四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)此外，標(biāo)本的處理及保存對(duì)DNA和RNA（尤其是RNA）的影響較大，因此，在核酸測(cè)定時(shí)，樣本的處理及保存，對(duì)保證測(cè)定的準(zhǔn)確有效尤為重要。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中常涉及的標(biāo)本有血清（漿）、全血、外周血單個(gè)核細(xì)胞、分泌物、拭子、膿、體液、石蠟切片、新鮮組織等，這些臨床標(biāo)本的處理和保存方法各有不同。目前五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)第一節(jié)臨床標(biāo)本的處理和保存

血清（漿）標(biāo)本目前六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)在某些病原體如乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）和人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）等的PCR臨床測(cè)定中，標(biāo)本的獲取和保存，對(duì)于DNA測(cè)定，可能按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對(duì)測(cè)定影響不大，目前七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)但對(duì)于RNA測(cè)定，標(biāo)本的獲取和保存方式對(duì)測(cè)定結(jié)果，可能有決定性影響。有研究表明，用于RNA測(cè)定最好是使用EDTA抗凝（嚴(yán)禁使用肝素，因其對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制，且很難在核酸提取過程中完全去除）全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快（2小時(shí)內(nèi)）分離血清，標(biāo)本的短期（1-2周）保存可在-20℃下，較長期保存應(yīng)在-70℃。目前八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)

以全血作為待測(cè)標(biāo)本時(shí)，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-Na2或枸櫞酸鈉，不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測(cè)，可4℃下短期保存，如用于RNA檢測(cè)，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA全血標(biāo)本目前九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)

外周血單個(gè)核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液，裂解全血中的紅細(xì)胞，經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌，即可得到單個(gè)核細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞如暫不得取核酸，可保存于-70℃下。外周血單個(gè)核細(xì)胞目前十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)

痰屬于分泌物，臨床上常用作為結(jié)核分枝桿菌DNA測(cè)定標(biāo)本。由于痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì)，故在核酸提取時(shí)，需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行初步處理，即用1mol/LNaOH液化。痰目前十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長，液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-70℃下。此外，如用于非結(jié)核分枝桿菌如肺炎支原體的PCR檢測(cè)，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。目前十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)在使用PCR方法檢測(cè)性病病原體時(shí)，臨床標(biāo)本一般為棉拭子，可將棉拭子置于適量生理鹽水中，充分震蕩洗滌后，室溫靜置5-10分鐘，待大塊狀物下沉后，取上清立即離心，其后的沉淀即可用于DNA提取，如不立即用于核酸提取，則需保存于-70℃下。棉拭子目前十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)膿液的處理依情況而定，如用于分枝桿菌（如結(jié)核分枝桿菌）核酸測(cè)定的標(biāo)本，粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心，沉淀用生理鹽水洗2-3次后，即可用于DNA提取。膿液目前十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)對(duì)于用于非分枝桿菌測(cè)定的膿液標(biāo)本，如過于粘稠，則加入適量生理鹽水，充分振蕩后，靜置，取上清立即離心，沉淀用于DNA提?。蝗鐬樗畼?，則按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標(biāo)本的保存條件同樣為-70℃。目前十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)臨床體液標(biāo)本包括胸水，腹水，腦脊液，尿液等，可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀后，提取核酸。沉淀樣本的保存同上。體液目前十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)

組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步驟首先用生理鹽水洗兩次，然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻，離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。組織目前十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)新鮮組織最好是保存于50%乙醇中，具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次，切成寬度小于1cm的小片，加入適量的生理鹽水，然后，邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4℃可保存6年。目前十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)石蠟切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化后即可進(jìn)行DNA提取?？偠灾?，標(biāo)本的收集及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，對(duì)用于PCR測(cè)定的核酸模板的成功提取，具有決定性作用。在這里要著重強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，所有用于上述臨床標(biāo)本收集的容器如試管或離心管，均應(yīng)使用前高壓滅菌。目前十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)其它標(biāo)本尿液前列腺液尿道口分泌物陰道分泌物宮頸口粘液咽喉拭子、鼻腔分泌物糞便目前二十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)第二節(jié)核酸的提取方法

一、DNA提取的經(jīng)典方法

DNA提取的經(jīng)典方法，即所謂的“酚-氯仿提取法”。這種方法提取的DNA純度高，效果好，缺點(diǎn)是較為繁瑣。方法如下：目前二十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)1．試劑

（1）蛋白酶K緩沖液：

50mmol/LKCl,

10-20mmol/LTris-HCl,

2.5mmol/LMgCl2,pH8.3,

1%laureth12(一種表面活性劑)

0.5%Tween20,

100ug/ml蛋白酶K。目前二十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)（2）飽和酚：市售酚經(jīng)重蒸餾后（如貯存，則于-20℃下，用前從冰箱取出，與室溫平衡后，68℃下使酚溶解），加入等體積的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)磁力攪拌15分種移出上層水相；重復(fù)上述抽提過程，直至酚相的pH大于7.8，酚達(dá)到平衡最后一次取出液相后，目前二十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)加入0.1體積含有0.2%β-巰基乙醇的0.1mol/LTris–HCl(pH8.0)，這種形式的酚溶液可裝在不透光的瓶中并處于10mmol/LTris-HCl（Ph8.0）緩沖液層之下，可4℃下保存一個(gè)月。目前二十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)TE緩沖液10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA,pH7.5或8.0。目前二十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)2．提取步驟

1、臨床標(biāo)本經(jīng)前處理后

加入蛋白酶K緩沖液

56℃溫育1小時(shí)

加入等體積飽和酚，充分振蕩混勻

目前二十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)

12000rpm離心5分種

取水相，加入等體積氯仿

混勻，12000rpm離心2分鐘

取水相，加1/10體積的3mol/L

NaAc和2倍體積的無水乙醇目前二十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)-20℃30分鐘或過夜

12000rpm離心10分種

棄上清，用預(yù)冷75%乙醇洗3次

干燥

取20μlTE或無菌去離子水懸浮

4℃?zhèn)溆?/p>

目前二十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)二、RNA的提取

RNA的提取條件較DNA要求嚴(yán)格，主要是因?yàn)榕R床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，存在大量對(duì)RNA具有強(qiáng)烈降解作用的RNase較耐高溫，不易失活。因此在提取RNA時(shí)，如何避免RNase對(duì)標(biāo)本的污染及防止RNase對(duì)提取的RNA的降解，是保證RNA成功提取的關(guān)鍵所在。目前二十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)（一）RNA提取所用器皿的處

理及溶液的準(zhǔn)備

經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管，離心管等基本上無RNase，可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA，實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染，使用前必須于180℃干烤8小時(shí)以上，或用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其它用品。目前三十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)DEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上良量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。目前三十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)要注意的是，DEPC有致癌性，操作時(shí)須小心。對(duì)于RNA提取所需溶液的配制，必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNase的玻璃器皿。目前三十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)可能的話，溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時(shí),然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘.須注意的是,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液.目前三十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)（二）RNA提取中RNase污染的控制

實(shí)驗(yàn)操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。因此，在準(zhǔn)備用于RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時(shí)，以及在涉及RNA的整個(gè)提取操作過程中，都應(yīng)戴一次性手套。目前三十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中，如觸摸“臟的”玻璃器皿和其它物品以后手套就可能會(huì)沾染上RNase，因此在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。常用的RNase抑制劑有以下幾種：目前三十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)1．RNase的蛋白質(zhì)抑制劑這種RNase的蛋白質(zhì)抑制劑是從人胎盤分離得到，可與多種RNase以非共價(jià)方式緊密結(jié)合，從而使RNase失活。其可置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50%甘油中，貯存于-20℃。目前三十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)2．釩核糖核苷復(fù)合物這種復(fù)合物由氧釩（IV）離子和4種核糖核苷之中的任一種所組成，能與多種RNase結(jié)合，并幾乎能百分之百地抑制RNase的活性。目前三十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)3．硅藻土硅藻土是一種粘土，通過吸附RNase而去除其降解RNA的作用。目前三十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)（三）RNA提取方法

RNA提取的常用方法有：（1）表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法；（2）胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法；（3）胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。目前三十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)第一種方法所提取的RNA純度高，反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR擴(kuò)增的特異性好，缺點(diǎn)是操作繁瑣，易造成微量標(biāo)本的丟失或標(biāo)本間的交叉污染，還易因RNA降解而影響測(cè)定結(jié)果的可靠性及敏感性；目前四十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)第三種方法較為方便省時(shí)，不需氯仿-酚抽提，但對(duì)玻璃粉、二氧化硅等的質(zhì)量有要求；第二種方法雖較為復(fù)雜，但結(jié)果穩(wěn)定性最優(yōu)，因?yàn)槭褂脧?qiáng)烈變性劑加鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破環(huán)而從核酸上解離下來。目前四十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)RNase可耐受多種處理（例如煮沸）而不失活，但卻會(huì)被4mol/L硫氰酸胍和β-巰基乙醇等還原劑所滅活，因此可聯(lián)用上述試劑從組織中提取完整無損的RNA。下面以血清（漿）的異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚說明RNA常用提取方法。目前四十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚提取法異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚提取法目前四十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)（1）試劑

20%PEG6000

裂解液：

4mol/LGuSCN,

25mmol/L檸檬酸鈉pH7.0,

0.5%Sarkosyl（十二烷基肌酸鈉）

100mmol/Lβ-巰基乙醇

飽和酚：氯仿：異戊醇（50：49：1）3mol/LNaAcPH5.2

無水乙醇

75%乙醇

DEPC處理的無菌去離子水

RNasin（RNA酶抑制劑）目前四十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)（2）操作步驟

200μl血清（漿）

加入200μl20%PEG6000

4℃3小時(shí)，12000rpm離心15分鐘（4℃），棄上清

加入500μl裂解液混勻

目前四十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)加入50μlNaAc、500μl飽和酚：

氯仿:異戊醇溶液

混勻，冰浴10分鐘

4℃12000rpm離心5分鐘

取上層水相再用氯仿-異戊醇抽提一次

加入1/10體積NaAc溶液、2.5體積無水乙醇

冰浴30-60分鐘

目前四十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)4℃14000rpm離心10分鐘

棄上清

沉淀用75%乙醇洗一次

烘干或真空干燥

用10μlDEPC處理水溶解，加入2uRNasin

-20℃保存?zhèn)溆?/p>

目前四十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)三、核酸提取的改良方法

（一）旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）提取目前四十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)旋轉(zhuǎn)離心（SPINCOLUMN）技術(shù)是從生物樣品中分離純化微量核酸的較為簡(jiǎn)便的方法，屬于硅吸附方法的一種。是美國和歐洲的科學(xué)家們從20世紀(jì)80年代未起開始研制的一種微量快速的核酸分離純化方法，目前四十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)其克服了傳統(tǒng)核酸純化方法的缺陷，適合于現(xiàn)代分子生物學(xué)工作需要進(jìn)行大量微量核酸分離純化的工作特點(diǎn)。在美國，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)出現(xiàn)在90年代初，以后逐漸被市場(chǎng)和技術(shù)工作人員所接受，成為微量核酸分離純化的主導(dǎo)技術(shù)。目前五十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)能夠快速、簡(jiǎn)便地從生物樣品中分離純化包括人體DNA、質(zhì)粒DNA、總RNA、mRNA在內(nèi)的各類脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）大分子。盡管在市場(chǎng)上所見到旋轉(zhuǎn)離心柱各有特色，但是在原理上現(xiàn)行的旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通常可分為三個(gè)部分：目前五十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)第一部分是利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來；第二部分是把釋放的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，當(dāng)然這種載體只對(duì)核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力而對(duì)其它的生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則不相親和也不吸附；第三部分是把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來，從而得到純化的核酸。目前五十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)的一次操作過程一般在10分鐘到20分鐘不等，比傳統(tǒng)純化方法的操作時(shí)間（幾個(gè)小時(shí)）大大減少。旋轉(zhuǎn)離心柱純化的DNA產(chǎn)物的OD260/OD280一般在1.80-2.00之間；分離純化效率在80%-100%之間。目前，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞核DNA、細(xì)菌DNA、質(zhì)粒DNA、細(xì)胞MRNA、膠上DNA或RNA等核酸的純化目前五十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)核酸載體的膜化是旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)工業(yè)化使用的重要基礎(chǔ)。隨著微量核酸分離純化技術(shù)的出現(xiàn)，操作的簡(jiǎn)便性、穩(wěn)定性和重復(fù)性一直是圍繞核酸分離純化技術(shù)應(yīng)用的核心問題。為了推出簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和重復(fù)性好的旋轉(zhuǎn)離心柱產(chǎn)品，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)中的核酸載體先后用過玻璃珠和藻膠等各種材料，直至20世紀(jì)90年代初才最后確定為人工膜。目前五十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)膜化后的旋轉(zhuǎn)離心柱產(chǎn)品具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、儲(chǔ)存方便、重復(fù)可靠等特點(diǎn)，成為核酸純化市場(chǎng)的主導(dǎo)產(chǎn)品。目前五十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)的適用性很廣，可用于全血、抗凝血、血清、腦脊液、分泌物、唾液、痰尿、糞便、軟骨、動(dòng)植物組織等各種樣品的核酸提取。目前五十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)（二）玻璃粉吸附法

DNA或RNA可特異地吸附于玻璃粉上，因此將玻璃粉懸液與臨床標(biāo)本混勻、離心、洗滌玻璃沉淀，即可從玻璃粉上獲得純化的核酸。目前五十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)Yamada等為簡(jiǎn)化使用PCR檢測(cè)病原體的核酸提取方法，使用玻璃粉懸液直接從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）和血漿中提取核酸，這樣得到的核酸標(biāo)本用于DNA和RNA的擴(kuò)增檢測(cè)，得到滿意的結(jié)果。其提取方法分述如下：目前五十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)1．從細(xì)胞提取核酸

試劑

1%SDS（含10mmol/LEDTA）

4mol/LNaCl

玻璃粉懸液

乙醇洗滌（50%乙醇，10mol/LTris,pH7.4,1mol/LEDTA,50mmol/LNaCl）目前五十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)(2)操作步驟

人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）（2×105）

加入50μl1%SDS（含10mmol/LEDTA）

加入150μl4mol/LNaCl及50μl玻璃粉懸液混勻，置冰浴5分鐘

10000rpm離心1分鐘，傾去上清液

目前六十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)用300μl乙醇洗滌液洗沉淀物3次

加入100μl水

3分鐘洗脫DNA，離心

上清液即為含純化DNA的核酸標(biāo)本目前六十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)2．從血清（漿）中提取用于RNA檢測(cè)的核酸

（1）試劑

6mol/LGuSCN

玻璃粉懸液

無水乙醇

目前六十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)2）操作步驟

200μl血清（漿）

加入200μl6M異硫氰酸胍及20μl玻璃粉懸液

室溫90分鐘

10000rpm離心1分鐘，棄上清液

沉淀用300μl乙醇洗2次

沉淀物中加入50μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，將RNA先轉(zhuǎn)錄為CDNA，再進(jìn)行PCR上述核酸提取方法具有通用性，可用于任何其他病原微生物的核酸提取。目前六十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)（三）二氧化硅（SE）或

硅藻吸附法

除了玻璃粉以外，SE和硅藻（單細(xì)胞藻類的化石細(xì)胞壁，D）顆粒也具有特異吸附核酸的特性。Chaotropic試劑硫酸氰胍兼具細(xì)胞裂解及核酸失活兩種特性，因而在高濃度硫氰酸胍存在下，從細(xì)胞（包括細(xì)菌）或病毒顆粒中釋放出的核酸萬分可結(jié)合于SE或D顆粒上目前六十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)BOOM等利用硫氰酸胍和SE和D顆粒的上述特性，成功地從血清、尿液以及細(xì)胞中純化了DNA和RNA，可在不到1小時(shí)內(nèi)完成12個(gè)不同臨床標(biāo)本的核酸提取工作，其有Y/SE和Y/D兩種提取方案，Y/SE方案為使用SE以提取血液和尿液等體液中的核酸；Y/D方案為使用D顆粒以提取細(xì)胞中的核酸。目前六十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)1、Y/SE方案

（1）試劑

裂解緩沖液L6：120gGUSCN溶于100ml0.1mol/LTris-HCl,PH6.4,然后加入0.2mol/LEDTA,PH8.0(用NaOH調(diào)節(jié))溶液22ml及2.6gTritonX-100.

洗滌緩沖液L2:120GGUSCN溶于100mL0.1mol/LTris-HCl,pH6.4,為使GUSCN溶解加快,可在60~65℃水浴下攪拌目前六十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)(2)操作步驟

50μl血清或尿液

加入900μl裂解緩沖液L6及40μlSE

立即旋轉(zhuǎn)混勻，5秒，室溫10分鐘

旋轉(zhuǎn)混勻5秒，離心（12000×g）15秒

用洗滌緩沖液L2將沉淀洗滌2次

目前六十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)再用70%乙醇洗2次，用丙酮洗1次

去掉丙酮，反應(yīng)管開蓋56℃干燥10分鐘

加入洗提緩沖液TE

混勻，56℃干燥10分鐘

12000×g離心2分鐘

上清液即含純化的核酸目前六十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)

使用上述Y/SE方案，可以從血清或尿液中高產(chǎn)量地（通常超過50%）提取單鏈、雙鏈、共價(jià)閉合或開環(huán)的DNA或RNA，其可作為限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、大腸桿菌DNA多聚酶和TAQDNA多聚酶的良好基質(zhì)。目前六十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)該方案雖適用于病毒及革蘭陰性菌（如腦膜炎球菌、傷寒桿菌、淋球菌等）的基因組核酸提取，但不能直接從革蘭陽性菌（如金黃色葡萄球菌、鏈球菌或酵母菌等）中提取核酸，原因可能是由于硫氰酸胍不能很好的裂解革蘭陽性菌。目前七十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)此外，在提取用于HBV-DNA檢測(cè)的血清核酸標(biāo)本時(shí)，由于HBV-DNA的長負(fù)鏈5`未端共價(jià)結(jié)合有蛋白質(zhì)，而GUSCN不能將此蛋白從HBV-DNA上去掉，因此在上述提取方法中，由于有HBV-DNA結(jié)合蛋白的干擾，HBV-DNA難以從SE顆粒上洗脫下來。目前七十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)為解決此問題，作者對(duì)上述方法分別作了兩種改良，稱為H方案和Y*方案。H方案是首先用SDS-蛋白酶K處理血清，使HBV-DNA長負(fù)鏈5`未端蛋白脫落，然后再按上述方法提取。目前七十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(diǎn)Y*方案是在用低鹽TE溶液從SE顆粒上洗脫HBV-DNA時(shí)，在TE溶液中加入蛋白酶K，使HBVDNA從SE上脫落下來。這兩