疫苗凍干技術

PAGEPAGE4疫苗凍干技術一、冷凍干燥參數的確定和控制生物制品的冷凍干燥產品要求有一定的物理形態(tài)、均勻的顏色、合格的殘水含量、良好的溶解性、搞的存活率或效價、長的保存期。因此不僅要對原材料的配制和凍干后的密封保存進行控制，更重要的是對凍干過程每一階段各參數進行全面監(jiān)控，以獲得良好的凍干產品。凍干過程的參數主要是溫度、壓強和時間三要素。在預凍階段是預凍溫度、預凍時間、預凍溫度和預凍時間的關系即預凍速率。升華階段中是產品溫度、板層溫度、凍干箱內的壓強、冷凝器溫度、升華時間。在解吸階段中是產品的最高許可溫度、板層溫度、凍干箱內的壓強、冷凝器溫度和解吸時間。確定冷凍干燥參數的主要依據是產品的品種和凍干機的性能，其次也要考慮到總裝量，每瓶內的裝量和厚度，容器的種類，產品是放在盤內干燥還是直接放在板層上干燥，瓶口是否帶有塞子等?，F(xiàn)把凍干中的參數按階段分述如下：（一）預凍階段1、預凍溫度：由于冷凍干燥是在真空狀態(tài)下進行，因此只有產品全部固化，才能干燥出良好的產品。每種產品有不同的共熔點或固化點，因此不同的產品預凍的最低溫度也不盡相同。預凍溫度必須低于該產品的共熔點溫度。產品的共熔點可通過多種方法來確定，比較方便和常用方法是電阻法。在凍干過程中，物質狀態(tài)發(fā)生了變化，有液態(tài)逐漸變成了固態(tài)，這一改變從溫度上無法測到，但隨著物質形態(tài)的改變而同時發(fā)生的電性能的變化是可以測量到的，進行凍結過程中產品電阻的測量可以知道凍結實在進行之中，還是已完成了。液體主要靠離子導電，當溫度降低時由于離子逐步被凍結而固定，液體的電阻將會逐步增加，當液體全部變成固體時，離子導電突然停止，電阻會發(fā)生一個突然增大現(xiàn)象，因此在降溫過程中同時對產品的電阻和溫度進行測量，能確定產品的共熔點溫度。2、預凍時間：產品在預凍中，達到了規(guī)定預凍溫度之后，一般還要保持一定時間，因為測量產品的預凍溫度是通過某一瓶或幾瓶樣品得到的，而樣品溫度不一定能準確地代表全貌，由于凍干箱的板層之間存在一定的溫度差別，所以為了使全箱產品都真正的固化，需要延長一些時間。一般是在樣品達到的固化溫度之后，再保持1—2小時左右的時間，但是，對于板層溫度差別大的凍干機，預凍時間還要進一步延長?？偠灾?，預凍的總時間與產品的品種、凍干機的性能、產品的裝量、使用的容器、盤子等有關。3、預凍速率：冷凍會對細胞和生命體產生一定的破壞作用，一般認為是由機械效應和溶質效應而引起的。機械效應是細胞內部冰晶生長時產生的機械力量引起的，特別是對于有細胞膜的生命體影響較大。冷凍時產生的冰晶越大，細胞膜越易破裂，冰晶小，則機械損傷也小。緩慢冷凍產生的冰晶較大，快速冷凍產生的冰晶較小。就此而言，緩慢冷凍對細胞和生命體的影響較大，快速冷凍對細胞和生命體的影響較小。溶質效應是由于水凍結使間隙液體逐漸濃縮，從而使電解質的濃度增加，而蛋白質對電解質是很敏感的，電解質濃度的增加會使蛋白質變性引起生命體的死亡；此外，電解質濃度的增加還會使細胞脫水而死亡。間隙液體的濃度越高，上述原因引起的破壞也越嚴重。溶質效應在某一溫度范圍最明顯，這個溫度范圍在水的冰點和該液體的全部固化溫度之間，若能以較高的速度越過這一溫度范圍，則溶質效應產生的后果可以減小。此外，冷凍時所形成的冰晶大小還會影響干燥速率和干燥后產品的溶解度。大的冰晶利于升華，小的冰晶不利于升華，但大的冰晶干燥后溶解較慢，小的冰晶溶解較快。冰晶越小，干燥后越能反映出產品的原來結構。綜上所述，需要試驗一最佳冷卻速率，以得到最高的存活率，最好的物理性狀和溶解速度，且有利于升華干燥。（二）升華階段1、產品溫度：產品在升華時要吸收熱量，1克冰變成汽大約需吸收670卡左右的熱量，因此升華時必須對產品進行加熱，但加熱時產品的溫度不能超過該產品的共熔點溫度。如果低于共熔點溫度過多，則升華的速率降低，升華階段的時間會延長，如果高于共熔點溫度，則產品會發(fā)生熔化，使凍干失敗，因此升華時產品的溫度要求接近共熔點溫度，但又不能超過共熔點溫度。由于產品升華時，升華面不是固定的，而是在不斷變化的，并且隨著升華的進步凍結產品越來越小，因此產品溫度的測量比較困難，利用溫度探頭測量會產生一定的誤差，為此可以利用氣壓測量法來確定升華時產品的溫度，即把凍干箱和冷凝器之間的閥門迅速地關閉，然后又打開，關閉的時間約1—2秒鐘，切不可太長，觀察凍干箱內壓力的升高，根據壓力的升高數值，從冰的不同溫度的飽和蒸汽壓曲線或表上可以查出相應的溫度，這就是升華時產品的溫度。產品的溫度也能通過對升華產品電阻的監(jiān)測來判斷，如果測得產品的電阻大于共熔點時的數值，則說明產品的溫度在共熔點溫度以下，如果測得產品的電阻接近共熔點時的數值，則說明產品的溫度已接近或達到共熔點溫度。2、板層溫度：升華階段板層溫度的確定與產品溫度、凍干箱內的壓強（即真空度）、冷凝器溫度有關。如果產品溫度低于共熔點溫度，凍干箱內的壓強小于真空報警規(guī)定的壓強，冷凝器溫度低于-40℃，則板層的溫度可以繼續(xù)提高。如果板層溫度提高到某一數值后出現(xiàn)產品溫度已接近共熔點溫度，或者凍干箱內的壓強已上升到接近真空報警規(guī)定的壓強，或者冷凝器的溫度回升到接近-40升華時凍干箱內的壓強和冷凝器溫度都是與凍干機的性能有關，因此升華時板層溫度的高低確定也是直接與凍干機的性能有關，性能好的凍干機，板層溫度可以控制得較高些。3、凍干箱內的壓強：升華時凍干箱內的壓強過去認為越低越好，但現(xiàn)在的觀點認為壓強不是越低越好，而是要在一定的范圍之內。壓強低按理應該有利于產品的升華，但由于壓強太低時對熱傳遞不利，試驗表明，在壓強低于0.1毫巴時，氣體的對流傳熱可忽略不計，而壓強大于0.1毫巴時產品容易得到熱量，升華速率反而增加。當壓強太高時，產品升華減慢，產品吸收熱量減少，于是產品本身的溫度上升，當高于產品的共熔點溫度時，產品會發(fā)生熔化，造成凍干的失敗。凍干的合適壓強一般認為是0.1—0.3毫巴，在這個壓強范圍內既利于熱量的傳遞，又利于升華的進行。但為了保險，一般真空報警的設定壓強為0.25毫巴，即壓強大于此數值時，停止對凍干箱的加熱，甚至啟動冷凍機對產品進行降溫以防止產品熔化。有些易凍干的產品，壓強還可再提高一些。凍干機系統(tǒng)內的壓強時由空氣的分壓強和水蒸汽得分壓強組成的，因此要用測量全壓的熱真空計來測量，而不能使用只能測空氣分壓強的麥氏真空計，由于水銀蒸氣有害于產品，水銀作介質的麥氏真空計應禁止使用。4、冷凝器溫度：升華階段時，由于凍干箱內的大量水蒸汽流向冷凝器，冷凝器作為水蒸汽的冷阱，使水蒸汽變成冰凝華在冷凝器表面，大量的水蒸汽凝華放出的熱量能使冷凝器的溫度回升，這是正常的現(xiàn)象。但由于冷凝器冷凍機的制冷能力不夠，冷凝器的內表面太小，或對產品提供的熱量過多等原因，會引起冷凝器溫度的過度回升。當冷凝器溫度過度回升時，凍干箱冷凝器之間的水蒸汽壓力差減小，升華速率減慢，同時也引起系統(tǒng)內水蒸汽分壓的增加，使真空度惡化，從而引起產品升華減慢，吸收熱量減少，產品溫度上升，致使產品熔化造成凍干失敗。因此，為了干燥出良好的產品，保持系統(tǒng)內穩(wěn)定的真空度，要求冷凝器的溫度能始終低于-40℃以下的溫度，-405、升華時間：升華時間與下列因素有關。①產品的品種：有些產品容易干燥，有些產品不易干燥，一般共熔點溫度較高的產品容易干燥，升華時間短些。②產品分裝的厚度：正常的干燥速率大約每小時干燥1毫米的厚度，因此分裝厚度大時，升華的時間較長。厚度一般不應超過15—18毫米。③升華時提供的熱量：升華時若提供的熱量不足時，則會減慢升華速度，延長升華時間，當然，前面講過，熱量不能過多提供。④升華時的壓強：前面已講過，壓強太低，升華時間反而增加。⑤凍干機本身的性能：這包括真空度和冷凝器溫度、冷凝器的吸附面積、幾何形狀等，性能良好的機器升華時間較短。（三）解吸階段1、產品溫度：在解吸階段由于產品內不再存在凍結冰，因此產品溫度可以迅速上到該產品的最高容許溫度，并在該溫度一直維持到凍干結束為止。迅速提高產品溫度，對降低產品殘余水分和縮短干燥時間有利。最高許可溫度視產品而定，一般病毒產品為25℃，細菌產品為30℃，血清和抗菌素可到35—40℃2、板層溫度：由于產品內的凍結冰已升華完畢，產品吸收的熱量明顯減少，為了不使產品溫度超過最高許可溫度，因此板層的溫度同樣不能超過產品的最高許可溫度，如果在升華階段板層溫度加的較高，此時應降到規(guī)定溫度。3、凍干箱內的壓強：由于產品內水分已升華完畢，因此凍干箱內的水蒸汽壓強下降，冷凝器吸附水蒸汽的量也減少，冷凝器由于負荷減少溫度下降，使系統(tǒng)內的水蒸汽壓也下降，這是總壓強往往低于0.1毫巴。總壓強的下降對凍干箱的傳熱不利，產品的溫度就不容易迅速上升，為此要對凍干箱內的壓強進行控制，一般控制在0.20—0.30毫巴之間，有時可到0.40—0.45毫巴之間。為了對凍干箱內的壓強進行控制，可使用如下方法：①校正漏孔法：在凍干機真空系統(tǒng)安裝一個人為校正好的漏孔，有一個電磁閥來控制，當凍干機壓強下降到低于設定值時電磁閥打開，通過漏孔放入干燥無菌的惰性氣體，于是系統(tǒng)壓強上升，當壓強上升到設定值時電磁閥關閉，停止漏孔進氣。漏孔一般裝在凍干箱處，也可裝在冷凝器或真空泵處。②調節(jié)凍干箱冷凝器閥門法：當凍干箱壓強低于設定值時，關閉凍干箱冷凝器閥門，于是凍干箱內的水蒸汽分壓強增加，當壓強上升到設定值時，凍干箱冷凝器的閥門又打開，也可通過關小或開大閥門來調節(jié)壓強。③真空泵間歇運轉法：當凍干箱的壓強下降到設定值時，停止真空泵運轉，當壓強上升到設定值時，真空泵又繼續(xù)運轉。④冷凝器冷凍機間歇工作法：當凍干箱的壓強下降到設定值時，冷凝器的冷凍機又繼續(xù)工作，不過此方法可能使水蒸汽進入真空泵內。由于對壓強進行了控制，增加了凍干箱壓強，該善了箱內的傳熱，使產品溫度較快地達到最高許可溫度，縮短了干燥時間。一旦產品溫度達到最高許可溫度之后，為了進一步降低產品內的殘水含量，高真空的建立是十分必要的。因此在產品溫度達到最高許可溫度之后，上述控制壓強的方法應該停止使用，使系統(tǒng)內恢復高真空，并一直維持到凍干結束為止，已進一步降低產品的殘水含量，同時也為凍干結束箱內真空壓塞做好準備。4、冷凝器溫度：由于產品已基本干燥，逸出的水蒸汽量減少，冷凝器處于輕負荷量的工作狀態(tài)，因此冷凝器達到最低的工作溫度。這個低的冷凝器溫度對于產品殘水的進一步降低是很有利的，因為這是凍干箱內達到了最高許可溫度。冷凝器達到最低的溫度之后，一方面促使真空度提高，另一方面使凍干箱和冷凝器之間的水蒸汽壓力差也達到最大值，這就非常有利于產品殘余水分的進一步降低。5、解吸時間：解吸時間的長短取決于下列因素。①產品的品種：產品不同時，干燥的難易也不相同，最高許可溫度也不相同，最高許可溫度較高的產品，由于維持的溫度高，解吸的時間可較短。②殘水含量要求：產品的殘水含量應有利于該產品長期存放，抬高或太低均不利，因根據試驗來定，顯然對于殘水含量要求越低的產品，需解吸的時間也就越長。③是否采用壓力控制：如果在解吸階段采用壓力控制，則改進了傳熱，使產品達最高許可溫度的時間縮短，則解吸干燥的時間也縮短。④凍干機的性能：凍干機的真空度高，冷凝器能達到的溫度低，則解吸的時間能縮短。二、凍干保護劑在冷凍干燥的液體制品中，除了那些有活性、有生命或有治療效果的組分之外，統(tǒng)稱為凍干保護劑。它不同于佐劑，佐劑具有治療效果，而保護劑則無治療效果。有些液體制品能單獨地進行冷凍干燥，但也有些液體制品進行冷凍干燥往往不易成功。為了使某些制品能成功地進行冷凍干燥，改善凍干產品的溶解性和穩(wěn)定性，或使凍干產品有美觀的外形，需要在制品中加入一些附加物質，它們就是保護劑，有時也稱保護劑為懸浮介質、填充劑、賦形劑、緩沖劑、基礎物等。保護劑對于凍干制品必須是化學惰性的。保護劑有以下作用：1、細菌和病毒需要在特定的培養(yǎng)介質中生長繁殖，但這些培養(yǎng)介質與細菌和病毒往往難以分離，他們一般能成功地冷凍干燥在這些培養(yǎng)介質中。例如肉湯、脫脂乳、蛋白質等。2、有些活性物質濃度極小，干物質含量極小，在冷凍干燥時已經干燥的物質會被升華的氣流帶走。為了改善濃度，增加干物質含量，使凍干后的產品能形成較理想的團塊，因此需要加入填充物質，使固體物質的濃度在4—25%之間，這些填充物或賦形劑是蔗糖、乳糖、脫脂乳、蛋白質及水解物、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、山梨醇等。3、有些活性物質特別脆弱，在冷凍和干燥時由于物理或化學原因會受到危害，因此需加入一些保護劑，以減少在冷凍和干燥時的損害，例如加入二甲基亞砜、甘油、右旋糖苷（葡聚糖）、糖類、聚乙烯吡咯烷酮等。4、加入某些物質可以提高產品的崩解溫度，以得到良好的產品，并容易凍干，它們是甘露醇、甘氨酸、右旋糖苷、木糖醇、聚乙烯吡咯烷酮等。5、為了改變凍干液體制劑的酸堿度，從而改變共熔點以利于凍干，它們是氫氧化鈉、碳酸氫鈉等。6、為了改變產品貯藏的穩(wěn)定性，提高貯藏溫度，增加貯藏時間，它們是抗氧化劑類，例如維生素C、維生素E、氨基酸、硫代硫酸鈉、硫脲等。保護劑的范圍相當寬廣，品種繁多，但找不到十分理想的保護劑，對于不同的凍干制品也沒有一個保護劑的通用配方，每種產品的適宜保護劑需通過反復的試驗才能確定。從保護劑的組成不同可分為下列幾類：1、復合物：脫脂乳、明膠、蛋白質及水解物、多肽、酵母、肉湯、糊精、甲基纖維素、血清、蛋白胨等。2、糖類：蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、棉子糖、果糖、己糖。3、鹽類：硫酸鈉、乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化納、氯化鉀、硫代硫酸鈉、醋酸氨、氯化銨。4、醇類：山梨醇、乙醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇。5、酸類：檸檬酸、磷酸、酒石酸、氨基酸、乙二胺四乙酸。6、堿類：氫氧化鈉、碳酸氫鈉。7、聚合物：葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。8、其他：維生素、硫脲。三、凍干產品的崩解溫度對于凍干產品的共熔點大家已經熟悉了，他就是產品的真正固化點，也就是產品在抽空前必須要冷卻到的那個溫度點，不然產品在抽空時將會起泡，在升華加熱的時候也不能使產品超過這個溫度，不然產品將溶化。因此，共熔點是在預凍階段和升華階段需要進行控制的溫度值?，F(xiàn)在引入一個崩解溫度的概念，它是不同于共熔點的另一個溫度點。一個正常升華的產品，當升華進行到一定的時候，就會出現(xiàn)上層的干燥層和下層的凍結層，這二層之間的交界面就是升華面，升華面是隨著升華的進行而不斷下降的。已經干燥的產品應該是疏松多孔，并保持在這一穩(wěn)定的狀態(tài)，以便下層凍結產品升華出來的水蒸汽能順利地通過，使全部產品都能得到良好的干燥。但某些已經干燥的產品當溫度升高到某一數值時，會失去剛性，變得有粘性，發(fā)生類似塌方的崩解現(xiàn)象，使干燥產品失去疏松多孔的狀態(tài)，封閉了下層凍結產品水蒸汽的逸出通路，妨礙了升華的繼續(xù)進行。于是，升華速率變慢，凍結產品吸收升華熱也隨之減少，由板層供給的熱量將有多余，這樣便引起凍結產品的溫度上升，當溫度升高到共熔點以上的溫度時，產品就會發(fā)生熔化或發(fā)泡現(xiàn)象，致使凍干失敗。發(fā)生崩解時的溫度叫做該產品的崩解溫度，對于這樣的產品要獲得良好的干燥，只有保持升華中的干燥產品的溫度在崩解點以下，直到凍結產品全部升華完畢為止，才能使產品溫度繼續(xù)上升。這時由于產品中已不存在凍結冰，干燥產品即使發(fā)生崩解也不會影響產品的干燥，因為產品已從升華階段轉入解吸干燥階段。沒有發(fā)生崩解的干燥產品與發(fā)生崩解的干燥產品在外觀上用肉眼看不出有什么差別，只有在顯微鏡下才能看到結構上的變化，當在顯微鏡下觀察產品的冷凍干燥過程時，如果看到發(fā)生崩解現(xiàn)象，那么這時的溫度便是該產品的崩解溫度。有些產品的崩解溫度高于共熔點溫度，那么升華時僅需控制產品溫度稍低于共熔點溫度就行了，但有些產品的崩解溫度低于共熔點溫度，那么按照一般的方法控制升華時溫度就有可能會發(fā)生崩解現(xiàn)象，這樣的產品只有在較低的溫度下進行升華，因此必須延長凍干時間，這就必然增加了能耗和成本。產品的共熔點可以通過電阻法、差示熱分析法和低溫顯微鏡直接觀察法得知，但產品的崩解溫度只有在冷凍干燥顯微鏡下直接觀察才能得知。產品的崩解溫度取決于產品本身的品種和保護劑的種類，混和物質的崩解溫度，取決于各組分的崩解溫度，因此在選擇產品的凍干保護劑時，應選擇具有較高崩解溫度的材料，使升華干燥能在不很低的溫度下進行，以節(jié)省凍干的能耗和時間，提高生產率。甘氨酸、甘露醇、葡聚糖、木糖醇、聚乙烯吡咯烷酮和蛋白質混和物等保護劑能提高產品的崩解溫度。一些物質的崩解溫度如下：（℃）葡聚糖（右旋糖苷）-9蔗糖-32聚蔗糖-19.5果糖-48右旋果糖-44葡萄糖-40右旋葡萄糖-41.5明膠-8肌醇-27乳糖-32麥芽糖-32甲基纖維素-9味精-50卵清蛋白