第十三講蛋白質(zhì)分子設(shè)計

一、抗體剪裁抗體的基本結(jié)構(gòu)：四鏈結(jié)構(gòu)四肽鏈：由2條重鏈（H鏈），2條輕鏈（L鏈）組成；結(jié)構(gòu)域：IgG——H鏈4個，L鏈2個；抗體識別位點(diǎn)組成：由輕、重二鏈1個結(jié)構(gòu)域的高可變區(qū)共同構(gòu)成?？乖瓫Q定子互補(bǔ)區(qū)：抗體分子可變區(qū)的一些環(huán)狀肽段組成的。抗原表位抗體識別位點(diǎn)目前一頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)一、抗體剪裁人—鼠嵌合抗體的制備（思路）利用分子剪裁技術(shù)對抗體分子進(jìn)行剪裁的成功實(shí)例——實(shí)驗(yàn)英國劍橋大學(xué)的Winter等。將小鼠單抗的V區(qū)，換到人抗體分子的相應(yīng)部位上，使小鼠單抗所具備的抗原結(jié)合專一性轉(zhuǎn)移到人的抗體分子上。單克隆抗體（單抗，McAb）？抗體剪裁的醫(yī)學(xué)價值與人McAb相比，小鼠McAb容易制備，抗原性強(qiáng)，但易導(dǎo)致人體過敏反應(yīng)。將鼠McAb抗原結(jié)合部位轉(zhuǎn)移到人抗體上，達(dá)到與人McAb同樣的效果?？贵w剪裁目前二頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)1、抗體的人源化新的挑戰(zhàn)：改造鼠源McAb基因，綜合人—鼠嵌合McAb的優(yōu)點(diǎn)；獲得特異性高、異源性小的，具有臨床應(yīng)用價值的抗體。為何要人源化？相對于“人”雜交瘤細(xì)胞系統(tǒng)，“鼠”雜交瘤細(xì)胞生長快，產(chǎn)生抗體量大。鼠McAb用于人體，免疫原性和相對缺乏恒定區(qū)依賴的功能效應(yīng)，使它的應(yīng)用受到了一定的限制。改造的必要性：對鼠源McAb進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，合成人源化單抗。Ab的作用（補(bǔ)充）：識別作用：特異性與抗原分子結(jié)合生物效應(yīng)：調(diào)理作用、免疫粘聯(lián)、激活補(bǔ)體目前三頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)（1）鼠單克隆抗體恒定區(qū)的人源化將小鼠McAb恒定區(qū)用人抗體恒定區(qū)代替而拼接成嵌合抗體，既具有抗原結(jié)合特異性，又極大地降低了鼠單克隆抗體的異源性。改造策略和程序：①克隆鼠McAb可變區(qū)基因——從鼠雜交瘤提取mRNA→可變區(qū)基因cDNA文庫→表達(dá)載體→抗原特異性篩選→可變區(qū)基因；②選擇合適的人恒定區(qū)基因；恒定區(qū)基因比較保守，易于克隆獲得③重組載體的構(gòu)建與表達(dá)抗體分子的糖基化和可變區(qū)的折疊、鏈內(nèi)二硫鍵形成，以及重鏈和輕鏈相互作用形成正確的立體構(gòu)象。常用哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)目前四頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)CH3MouseHumanChimericCH3VHCH1VLCLCH2HCLC目前五頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)（2）人改型抗體（互補(bǔ)決定區(qū)移植）問題提出：人源化嵌合抗體的可變區(qū)仍具有抗原性。能誘發(fā)人產(chǎn)生抗小鼠抗體，導(dǎo)致過敏反應(yīng)，需對人源化抗體的可變區(qū)再進(jìn)行改造。抗體可變區(qū)組成：互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）和骨架區(qū)組成。CDR：識別抗原表位的區(qū)域，直接決定了抗體的特異性；骨架區(qū)——維持CDR構(gòu)象骨架區(qū)序列及其立體結(jié)構(gòu)較為保守，是嵌合抗體誘導(dǎo)人抗小鼠抗體的主要原因；將鼠McAbCDR移植到人McAb的可變區(qū)的骨架上，使人McAb獲得鼠McAb結(jié)合特異性，進(jìn)一步減少異源性?；パa(bǔ)決定區(qū)移植的設(shè)計簡單地將CDR序列移植到人源抗體中，甚至完全喪失親和力。必須進(jìn)行互補(bǔ)決定區(qū)序列與框架結(jié)構(gòu)的移植設(shè)計。目前六頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)移植設(shè)計的原則將CDR序列和緊鄰兩側(cè)的骨架序列一起移植；對骨架區(qū)中影響抗原結(jié)合部位的aa殘基改為鼠源McAb的殘基；人McAb可變區(qū)序列的選擇：抗體可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫分析，選擇與鼠單克隆抗體同源性高的人源序列；保留可變區(qū)N末端aa序列，尤其是輕鏈可變區(qū)N末端序列。將人改型可變區(qū)基因與人lg恒定區(qū)基因連接，構(gòu)成完整的人改型基因進(jìn)行表達(dá)。目前七頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)2、抗體的小分子化改造小分子抗體？能與抗原結(jié)合的抗體小分子V區(qū)片段——稱~，具識別活性 主要包括4類

Fab抗體：酶水解法：用木瓜水解酶消化抗體可獲得2個Fab片段。2條肽鏈

基因工程方法：在Fab基因表達(dá)Fab片段的功能。H鏈和L鏈基因分別構(gòu)建，在2個載體上，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或者構(gòu)建在一個載體上轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。

Fv抗體：Fv是由輕鏈和重鏈可變區(qū)組成的單價小分子，是與抗原結(jié)合的最小功能片段。2條肽鏈

分別構(gòu)建含H和L可變區(qū)基因的載體，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使之各自表達(dá)后組裝成功能性Fv分子；或在一個載體中H可變區(qū)和L可變區(qū)基因之間設(shè)置終止密碼子，分別表達(dá)2個小分子片段。單鏈抗體（ScFv）：將輕鏈和重鏈的可變區(qū)連接起來的抗體。1條肽鏈單價抗體的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：分子量小，免疫原性弱、滲透力強(qiáng)，并可用于藥物導(dǎo)向、中和毒素等功能。缺點(diǎn)：無抗體C區(qū)，不能介導(dǎo)抗體的其他生物學(xué)效應(yīng)。雙價抗體片段：利用單價抗體片段構(gòu)建雙價單特異性抗體和雙價多特異性抗體。目前八頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)

3、雙特異性抗體（完整抗體）雙特異性抗體(BsAb)？也稱雙功能抗體或雜交抗體，為非天然抗體。2個抗原結(jié)合部位，具有不同的特異性化學(xué)結(jié)構(gòu)上是雙價的，結(jié)合抗原的功能上是單價的；不同于天然抗體（在化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能上均是雙價的）BsAb具有雙特異性，能交聯(lián)2種抗原，可介導(dǎo)標(biāo)記物與靶抗原結(jié)合（造影）。雙特異性抗體制備方法化學(xué)交聯(lián)雙特異性抗體：制備單價抗體，雙功能交聯(lián)劑交聯(lián)。細(xì)胞工程雙特異性抗體：通過細(xì)胞融合的方法制備雙特異性抗體?？蓪⒎置趩慰沟碾s交瘤與經(jīng)免疫的脾細(xì)胞融合，或使兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤彼此融合?；蚬こ屉p特異性抗體：體外組裝表達(dá)分泌型的雙特異性抗體。藥物—靶細(xì)胞目前九頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)

4、基因工程抗體基因的表達(dá)概述：蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)有很多，其中主要包括大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及植物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)?？贵w分子表達(dá)：常用大腸桿菌和哺乳類細(xì)胞。大腸桿菌：原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。成熟的基因克隆、蛋白表達(dá)體系，具有繁殖迅速、易于操作控制等優(yōu)點(diǎn)。缺乏蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，內(nèi)源性蛋白酶易降解外源蛋白，內(nèi)毒素導(dǎo)致人體熱源反應(yīng)僅可用于表達(dá)抗體片段，如單鏈抗體等。難以表達(dá)完成的抗體哺乳類細(xì)胞：真核細(xì)胞表達(dá)體系，可完成正確的蛋白質(zhì)修飾和裝配，更接近天然抗體，具有正常的生物活性；缺點(diǎn)是成本高，操作相對煩瑣。目前十頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)二、蛋白質(zhì)關(guān)鍵殘基嫁接蛋白質(zhì)之間相互作用，往往只有幾個非常關(guān)鍵的aa殘基對結(jié)合起到主要作用，并不是全部蛋白分子參與。思考——如何證明這一命題？基于這種情況，我國科學(xué)家來魯華教授課題組發(fā)展了一種“蛋白質(zhì)關(guān)鍵殘基嫁接”的方法。成功地將EPO的關(guān)鍵殘基“嫁接”到一個結(jié)構(gòu)完全不同的PH蛋白結(jié)構(gòu)域上，ERPH1蛋白具有了和EPOR結(jié)合的功能。促紅細(xì)胞生成素(EPO)—受體(EPOR)相互作用，促進(jìn)紅細(xì)胞的分化和成熟。來魯華教授北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院長江特聘教授目前十一頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)1987年開始從事化學(xué)與生物學(xué)的交叉研究，特別是生物信息學(xué)研究，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測及分子設(shè)計方面做過大量工作。近年的主要工作方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究，發(fā)展了用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用定量研究的平均勢方法。有關(guān)蛋白質(zhì)表面環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測及蛋白質(zhì)設(shè)計、基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計等程序目前在國際上擁有900多家注冊用戶。

來魯華教授北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院長江學(xué)者特聘教授，北京大學(xué)理論生物學(xué)中心常務(wù)副主任，分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，國家杰出青年基金獲得者。來魯華，博士，教授1984年，本科畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系。1989年，在北京大學(xué)化學(xué)系獲博士學(xué)位。1998-1999年，美國加州大學(xué)伯克萊分校伯克萊學(xué)者。承擔(dān)過國家自然科學(xué)青年基金，國家杰出青年基金，攀登計劃（國家基礎(chǔ)研究重大計劃）項(xiàng)目，八六三項(xiàng)目等。國家自然科學(xué)三等獎1次，求是基金會青年科學(xué)家獎勵，中國科協(xié)青年科技獎等。發(fā)表論文近百篇，其中SCI收錄論文80余篇。頭銜學(xué)歷進(jìn)修貢獻(xiàn)研究方向與興趣個人簡歷是自己的經(jīng)歷！如何寫好，關(guān)鍵做好！詳細(xì)情況加附頁——略長江學(xué)者獎勵計劃：國家教育部與香港愛國實(shí)業(yè)家李嘉誠基金會目前十二頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)本節(jié)小結(jié)天然蛋白質(zhì)的剪裁，又稱蛋白結(jié)構(gòu)的“中改”，是指在蛋白質(zhì)中肽段或者結(jié)構(gòu)域替換和拼接。蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)是由結(jié)構(gòu)元件組裝而成的，通過不同蛋白質(zhì)之間結(jié)構(gòu)元件替換和拼接。期望能夠轉(zhuǎn)移相應(yīng)的功能和特性。本節(jié)主要通過抗體分子的拼接和改進(jìn)進(jìn)行了論述?？贵w的人源化（恒定區(qū)，CDR區(qū)）抗體的小分子化：雙鏈（Fab和Fv）、單鏈（Fab和Fv）、雙價抗體片段雙特異性抗體蛋白質(zhì)關(guān)鍵殘基嫁接——實(shí)例（方法建立——來魯華教授）目前十三頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)第四節(jié)蛋白質(zhì)分子全新設(shè)計一、蛋白質(zhì)分子全新設(shè)計的程序全新設(shè)計？：基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以及對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)識為基礎(chǔ)。根據(jù)期望的結(jié)構(gòu)和功能來設(shè)計全新序列的分子。全新設(shè)計流程（7）確定設(shè)計目標(biāo)生成初始序列結(jié)構(gòu)預(yù)測構(gòu)建模型對序列進(jìn)行初步的優(yōu)化基因表達(dá)全新蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能檢測進(jìn)一步設(shè)計蛋白質(zhì)設(shè)計一般都要經(jīng)過反復(fù)多次設(shè)計一合成一檢測一再設(shè)計的過程。主要介紹三個環(huán)節(jié)→設(shè)計目標(biāo)的選擇設(shè)計方法結(jié)構(gòu)檢測目前十四頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)1、設(shè)計目標(biāo)的選擇蛋白質(zhì)全新設(shè)計分類：（兩個方面）。功能設(shè)計和結(jié)構(gòu)設(shè)計。重點(diǎn)和難點(diǎn)：結(jié)構(gòu)設(shè)計。Why？設(shè)計思路：結(jié)構(gòu)設(shè)計方面：從最簡單的二級結(jié)構(gòu)開始，摸索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的規(guī)律。設(shè)計目標(biāo)：在超二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)設(shè)計中，一般選擇天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中一些比較穩(wěn)定的模塊。如：四螺旋束和鋅指結(jié)構(gòu)等。功能設(shè)計方面：主要進(jìn)行天然蛋白質(zhì)功能的模擬，如：金屬結(jié)合蛋白和離子通道等。目前十五頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)2、設(shè)計方法（3種）序列最簡化法：蛋白質(zhì)分子全新設(shè)計的一種基本方法，理解蛋白結(jié)構(gòu)形成的基本規(guī)律。盡量使設(shè)計序列的復(fù)雜性最小，一般僅用很少幾種氨基酸，從簡單到復(fù)雜設(shè)計的多肽序列具有一定的對稱性或周期性。。用來理解蛋白質(zhì)的折疊規(guī)律，如：HP模型法（蛋白質(zhì)折疊研究模型）。模板組裝合成法

（Mutter，1988）：其思路是將各種二級結(jié)構(gòu)片段通過共價鍵連接到一個剛性的模板分子上，形成一定的三級結(jié)構(gòu)。模板組裝合成法——繞過了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)設(shè)計的難關(guān)，再通過改變二級結(jié)構(gòu)中的AA殘基來研究蛋白質(zhì)中AA間的長程作用力揭示蛋白質(zhì)折疊規(guī)律，也是探索蛋白質(zhì)全新設(shè)計規(guī)律的有效手段。自動設(shè)計方法——提高了設(shè)計的速度和效率，已發(fā)展多種方法。結(jié)合一定的規(guī)則和算法，由計算機(jī)完成設(shè)計。如：運(yùn)用蛋白質(zhì)反向折疊方法結(jié)合遺傳算法建立自動設(shè)計方法—Jones運(yùn)用三維剖面技術(shù)結(jié)合遺傳算法發(fā)展的自動設(shè)計方法——來魯華等目前十六頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)3、結(jié)構(gòu)檢測（設(shè)計蛋白質(zhì)）只有實(shí)踐檢驗(yàn)，才能判斷設(shè)計是否與預(yù)想結(jié)構(gòu)（結(jié)果）符合。檢測項(xiàng)目和方法：（一般從三方面）設(shè)計的蛋白質(zhì)是否為多聚體排阻色譜法——判斷分子以幾聚體形式二級結(jié)構(gòu)含量是否與目標(biāo)符合CD法——檢測各二級結(jié)構(gòu)的大致含量是否具有預(yù)定的三級結(jié)構(gòu)。主要依靠NMR技術(shù)和熒光分析（下面介紹）；也可使用X射線晶體衍射技術(shù)分析。目前十七頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全新設(shè)計核心問題：如何確定一個既非常穩(wěn)定而又具有獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)的序列?？朔幕菊系K：線性聚合鏈的構(gòu)象熵。熵增（ΔS）？序列（正確）折疊的相互作用（力），必須超過（大于）構(gòu)象熵。？設(shè)計時，使具有相互作用力的AA數(shù)目與強(qiáng)度達(dá)到最大。設(shè)計原則和經(jīng)驗(yàn)：Cys殘基形成二硫鍵的配對無法預(yù)測，一般都盡量少用甚至不用，特別是在自動設(shè)計方法中。序列完成預(yù)定折疊后，再引入二硫鍵來穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。色氨酸吲哚環(huán)具有生色性，與其所處環(huán)境有關(guān)，常以Trp做探針？Trp在天然態(tài)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，其熒光光譜發(fā)生藍(lán)移。（？）在全新設(shè)計中常引入Trp作為熒光探針以檢驗(yàn)設(shè)計蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。下面介紹各級結(jié)構(gòu)設(shè)計的原則從四個方面講述目前十八頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)1、二級結(jié)構(gòu)的設(shè)計（α、β、T）（1）螺旋的設(shè)計α螺旋的設(shè)計——研究較早而且研究得較多的結(jié)構(gòu)。Why？由于a螺旋結(jié)構(gòu)簡單，規(guī)律性強(qiáng)，在溶液中比較穩(wěn)定。設(shè)計指導(dǎo)原則（4個）：選擇氨基酸：形成α螺旋傾向性比較大的殘基，如：Leu、Glu、Ala和Met等；氨基酸排列：螺旋每圈平均3.6個殘基，設(shè)計的兩親性螺旋，其結(jié)構(gòu)中形成一個親水面和一個疏水面，疏水性AA殘基應(yīng)按3或4的間隔排列；氫鍵的指向：α螺旋中所有的氫鍵指向同一方向，沿螺旋軸形成一個由N端指向C端的偶極矩，因而設(shè)計α螺旋時，常使帶正電荷的AA殘基靠近C端，帶負(fù)電荷的AA殘基靠近N端；帽子結(jié)構(gòu)：由于a螺旋兩端各有3個殘基的氫鍵能力未得到全部滿足，為穩(wěn)定a螺旋，常常在其兩端各加一個N帽和C帽。形成N帽的氨基酸殘基有Gly、Asn、Ser和Met等，形成C帽的有Gly、Ser、Arg和Gln等。目前十九頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)（2）β折疊片結(jié)構(gòu)設(shè)計β折疊片的設(shè)計比α螺旋困難。Why？β折疊片的氫鍵在不同的β折疊股間形成，由此β折疊片的形成與序列的“上下文”的關(guān)系更密切。單個氨基酸殘基平均形成的氫鍵數(shù)較螺旋中少，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差。單條β折疊股結(jié)構(gòu)不能穩(wěn)定存在。如何來研究？有了方法才能進(jìn)行研究——模板組裝合成法

將序列固定在一個模板上，來研究其形成規(guī)律。β折疊片的設(shè)計原則：根據(jù)模型肽、全β結(jié)構(gòu)、α/β結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)設(shè)計的經(jīng)驗(yàn)選擇形成β折疊片傾向性較大的氨基酸殘基(如Val、Ile、Tyr)使親水性殘基和疏水性殘基相間排列。目前二十頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)（3）轉(zhuǎn)角的設(shè)計：轉(zhuǎn)角的作用：連接不同二級結(jié)構(gòu)的常見單元，對維持各種二級結(jié)構(gòu)的空間相對位置和穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)起著重要的作用。不同類的轉(zhuǎn)角對每個位置的氨基酸殘基的二面角有一定的要求。二面角決定連接的兩個二級結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。轉(zhuǎn)角設(shè)計的關(guān)鍵選擇合適的轉(zhuǎn)角類型。某些氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有終止作用如：Pro和Gly是α螺旋的中斷者；Glu是β—折疊的中斷者；設(shè)計時可利用這些氨基酸殘基來終止和分隔不同的二級結(jié)構(gòu)。目前二十一頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)2、超二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的設(shè)計主要結(jié)構(gòu)類別：α-α；β

-

β，β-發(fā)夾；三級結(jié)構(gòu)；全蛋白。設(shè)計的重要問題（兩個）氨基酸選擇：根據(jù)AA形成二級結(jié)構(gòu)的傾向性，選擇各二級結(jié)構(gòu)片段的氨基酸殘基疏水中心的形成：最重要的一點(diǎn)就是考慮疏水中心的形成。螺旋—螺旋結(jié)構(gòu)：很多跨膜蛋白中存在，是研究得比較多的超二級結(jié)構(gòu)。序列有一個明顯的結(jié)構(gòu)特征，即存在一個周期性重復(fù)的七肽例如：七肽abcdefg，其中a和d位置處于螺旋間的界面因而設(shè)計時應(yīng)選擇疏水性氨基酸殘基，其他位置暴露的表面，應(yīng)選擇親水的氨基酸殘基。目前二十二頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)（另一種常見的超二級結(jié)構(gòu)）合成β-發(fā)夾模型的重要性，Why？β-發(fā)夾在β-折疊片形成中具有成核作用。單獨(dú)β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不能穩(wěn)定存在，形成分子間β-折疊片才能穩(wěn)定。若能合成β-發(fā)夾模型肽，才能對β-折疊片中各種穩(wěn)定因素進(jìn)行研究。β-發(fā)夾模型的設(shè)計與合成研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白B1結(jié)構(gòu)域中的一個片段在水溶液中能夠折疊成單體的天然β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，設(shè)計出了8個氨基酸殘基組成的具有β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的模型肽。β-發(fā)夾設(shè)計的關(guān)鍵：β-轉(zhuǎn)角的設(shè)計，特別是選擇合適的轉(zhuǎn)角類型。目前二十三頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)三級結(jié)構(gòu)的設(shè)計設(shè)計思路：模仿天然蛋白質(zhì)中較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)模塊。設(shè)計較難，但已有多個成功的設(shè)計實(shí)例，如：Richardson等設(shè)計的全β蛋白質(zhì)—著名的

betabellin（β-桶），由前后兩個β-折疊組成，每個折疊由4股組成。

如：Goraj等設(shè)計的octarellin即(α/β)8。結(jié)構(gòu)單元是turn-βstrand-turn-αhelix。構(gòu)建的合成基因在E.coli中的表達(dá)

三級結(jié)構(gòu)設(shè)計極為困難，為使結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，設(shè)計中常引入二硫鍵或金屬離子。但Struthers等根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)成功地設(shè)計了一個23肽ββα三級結(jié)構(gòu)，不含二硫鍵，也沒有金屬離子，其結(jié)構(gòu)通過NMR檢測證實(shí)。結(jié)構(gòu)中同時包含了α-螺旋、β-折疊以及轉(zhuǎn)角，全部使用天然氨基酸。其重要意義——是第一個全自動設(shè)計的蛋白質(zhì)。

是迄今為止幾個成功的三級結(jié)構(gòu)設(shè)計實(shí)例之一。此外，F(xiàn)edorov等還進(jìn)行了自然界不存在的全新結(jié)構(gòu)設(shè)計的嘗試。在目前的設(shè)計中，CD譜計算的二級結(jié)構(gòu)含量與目標(biāo)基本相符，就算設(shè)計成功。正常折疊的問題目前二十四頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)全新蛋白設(shè)計局限性（對結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系——認(rèn)識不足）對一些結(jié)構(gòu)簡單、規(guī)律明顯的蛋白質(zhì)分子的設(shè)計。其中最著名的例子——四螺旋束和β-筒結(jié)構(gòu)。四螺旋束和β-筒結(jié)構(gòu)是自然界中廣泛存在的結(jié)構(gòu)類型，（穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)）例如：在細(xì)胞色素、蚯蚓血紅蛋白、煙草鑲嵌病毒外殼蛋白等多種蛋白質(zhì)都含有相連的四螺旋束。為什么要設(shè)計這些蛋白結(jié)構(gòu)，具有什么特點(diǎn)？結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，這些蛋白的同源性很小，具有相似的三維結(jié)構(gòu)，因此，這些結(jié)構(gòu)類型成為從頭設(shè)計的目標(biāo)。Degrado等設(shè)計的四螺旋束從頭設(shè)計β結(jié)構(gòu)簡要介紹這兩種結(jié)構(gòu)科學(xué)研究的切入點(diǎn)和選材非常重要。目前二十五頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)四螺旋束結(jié)構(gòu)設(shè)計——蛋白質(zhì)全新分子設(shè)計的“里程碑”

Degrado等（杜邦公司）設(shè)計合成的四螺旋束結(jié)構(gòu)：4段螺旋的序列完全相同，各由16個氨基酸殘基組成，螺旋之間的3段連接也完全相同，各由3個AA殘基組成，共74個AA殘基。。一級序列：螺旋(helix):Gly-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Gly

連接(loop)：Pro-Arg-Arg

肽鏈：NH-Met-Helix-Ioop-Helix-Loop-Helix-Loop-Helix-COOH設(shè)計構(gòu)想一級序列設(shè)計，著重選擇了Leu、Lys和Glu三種殘基。其中僅Leu為疏水殘基，排布在螺旋內(nèi)側(cè)，Lys和Glu為帶電荷殘基，排布在螺旋外側(cè)，螺旋的兩端各加上1個Gly，中斷螺旋，后面加上連接肽段。整個四螺旋束結(jié)構(gòu)具有對稱性。相鄰螺旋反平行，螺旋軸夾角大約18度。疏水殘基在內(nèi)部，極性殘基在表面，整個螺旋呈兩性。這個設(shè)計實(shí)例被譽(yù)為蛋白質(zhì)分子設(shè)計的“里程碑”Degrado等設(shè)計的四螺旋束目前二十六頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)β折疊結(jié)構(gòu)設(shè)計舉例β喇叭筒狀蛋白質(zhì)由2個完全相同的β折疊片層組成，每一片層包含4條β-折疊股。前3條β折疊股各有8個殘基，最后一條由7個殘基，每一片層31個殘基。設(shè)計思想：考慮到形成β折疊的傾向性以及肽鏈之間的相互作用，選擇了Thr、Ser、Val、Leu、Ile和Ala等殘基。Thr和Ser是極性殘基，位于表面，以便與溶劑形成氫鍵；Val、Leu和Ile是疏水性殘基，構(gòu)成β形成體；Ala體積小，有利于內(nèi)部堆積。殘基位置排布，充分考慮了β鏈之間的成對效應(yīng)，盡可能地安排疏水殘基與疏水殘基相對排列，帶異性電荷的殘基相對排列，帶有大支鏈的殘基與不帶支鏈的殘基相對排列，這樣的排布使得在肽鏈之間產(chǎn)生最強(qiáng)的相互作用。兩個片層依靠交聯(lián)分子連接在一起，形成了一個筒狀結(jié)構(gòu)。從頭設(shè)計β結(jié)構(gòu)目前二十七頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)三、蛋白質(zhì)功能的全新設(shè)計模仿特定功能的結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ) ——進(jìn)行蛋白質(zhì)功能的全新設(shè)計。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的功能。因而蛋白質(zhì)功能的設(shè)計也離不開蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，目前，以特定的結(jié)構(gòu)域模擬天然蛋白質(zhì)的功能。最終實(shí)現(xiàn)人工設(shè)計功能蛋白。

設(shè)計思路——舉例目前二十八頁\總數(shù)三十一頁\編于十七點(diǎn)螺旋—螺旋結(jié)構(gòu)——模擬離子通道蛋白。“翻轉(zhuǎn)