分子生物學課件重點整理朱玉賢

PAGE56分子生物學課件重點整理朱玉賢第二章染色體與DNA染色體（chromosome）是細胞在有絲分裂時遺傳物質(zhì)存在的特定形式，是間期細胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密包裝的結(jié)果。真核生物的染色體在細胞生活周期的大部分時間里都是以染色質(zhì)(chromatin)的形式存在的。染色質(zhì)是一種纖維狀結(jié)構(gòu)，叫做染色質(zhì)絲，它是由最基本的單位—核小體(nucleosome)成串排列而成的。原核生物(prokaryote)：DNA形成一系列的環(huán)狀附著在非組蛋白上形成類核。染色體由DNA和蛋白質(zhì)組成。蛋白質(zhì)由非組蛋白和組蛋白（H1,H2A,H2B,H3,H4）DNA和組蛋白構(gòu)成核小體。組蛋白的一般特性：P24①進化上的保守性②無組織特異性③肽鏈氨基酸分布的不對稱性：堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。④組蛋白的可修飾性:甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。⑤H5組蛋白的特殊性：富含賴氨酸（24%）(鳥類、魚類及兩棲類紅細胞染色體不含H1而帶有H5)組蛋白的可修飾性在細胞周期特定時間可發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修飾作用較普遍，H2B有乙?；饔谩1有磷酸化作用。所有這些修飾作用都有一個共同的特點，即降低組蛋白所攜帶的正電荷。這些組蛋白修飾的意義：一是改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)，直接影響轉(zhuǎn)錄活性；二是核小體表面發(fā)生改變，使其他調(diào)控蛋白易于和染色質(zhì)相互接觸，從而間接影響轉(zhuǎn)錄活性。2、DNA1)DNA的變性和復性■變性（Denaturation)DNA雙鏈的氫鍵斷裂，最后完全變成單鏈的過程稱為變性?！鲈錾?yīng)(Hyperchromaticeffect)在變性過程中，260nm紫外線吸收值先緩慢上升，當達到某一溫度時驟然上升，稱為增色效應(yīng)?！鋈诮鉁囟龋∕eltingtemperature，Tm)變性過程紫外線吸收值增加的中點稱為融解溫度。生理條件下為85-95℃影響因素：G+C含量，pH值，離子強度，尿素，甲酰胺等■復性（Renaturation)熱變性的DNA緩慢冷卻，單鏈恢復成雙鏈。■減色效應(yīng)（Hypochromaticeffect)隨著DNA的復性，260nm紫外線吸收值降低的現(xiàn)象。2)C值反?，F(xiàn)象（C-valueparadox)C值是一種生物的單倍體基因組DNA的總量。真核細胞基因組的最大特點是它含有大量的重復序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開，這就是著名的“C值反?，F(xiàn)象”。（四）核小體(nucleosome)：用于包裝染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，是由DNA鏈纏繞一個組蛋白核[（H2A、H2B、H3、H4)*2的八聚體】構(gòu)成的。1、原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點●基因組很小，大多只有一條染色體●結(jié)構(gòu)簡煉●存在轉(zhuǎn)錄單元(trnascriptionaloperon)●多順反子(polycistron)重疊基因由基因內(nèi)基因、部分重疊基因、一個堿基重疊組成。2、真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點●真核基因組結(jié)構(gòu)龐大3×109bp、染色質(zhì)、核膜●單順反子●基因不連續(xù)性斷裂基因（interruptedgene）、內(nèi)含子(intron)、外顯子(exon)●非編碼區(qū)較多多于編碼序列(9:1)●含有大量重復序列■不重復序列/單一序列：在基因組中有一個或幾個拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。如：蛋清蛋白、血紅蛋白等功能：主要是編碼蛋白質(zhì)。■中度重復序列：在基因組中的拷貝數(shù)為101～104。如：rRNA、tRNA一般是不編碼蛋白質(zhì)的序列，在調(diào)控基因表達中起重要作用■高度重復序列：拷貝數(shù)達到幾百個到幾百萬個?！裥l(wèi)星DNA：A?T含量很高的簡單高度重復序列。1、DNA的一級結(jié)構(gòu)：指4種脫氧核苷酸的連接及其排列順序，DNA序列是這一概念的簡稱。堿基序列2）特征：●雙鏈反向平行配對而成●脫氧核糖和磷酸交替連接，構(gòu)成DNA骨架，堿基排在內(nèi)側(cè)●內(nèi)側(cè)堿基通過氫鍵互補形成堿基對（A：T，C：G）。2、DNA的二級結(jié)構(gòu)：指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所產(chǎn)生的雙螺旋結(jié)構(gòu)。2）分類：右手螺旋：A-DNA，B-DNA左手螺旋：Z-DNA3、DNA的高級結(jié)構(gòu)：指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。是一種比雙螺旋更高層次的空間構(gòu)象。2）主要形式：超螺旋結(jié)構(gòu)（正超螺旋和負超螺旋）（一）DNA的半保留復制（semi-nservativereplication）1、定義：由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方式稱半保留復制。3、DNA半保留復制的生物學意義：DNA的半保留復制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。（二）與DNA復制有關(guān)的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。5、DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶●以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物●反應(yīng)需要有模板的指導●反應(yīng)需要有3￠-OH存在●DNA鏈的合成方向為5￠?3￠性質(zhì)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生鏈合成--+聚合酶Ⅰ主要是對DNA損傷的修復；以及在DNA復制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。聚合酶Ⅱ修復紫外光引起的DNA損傷聚合酶ⅢDNA復制的主要聚合酶，還具有3→5’外切酶的校對功能，提高DNA復制的保真性6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3’-OH，另一端是5’-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來DNA連接酶在DNA復制、損傷修復、重組等過程中起重要作用7、DNA拓撲異構(gòu)酶(DNATopisomerase)：拓撲異構(gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的ε蛋白拓撲異構(gòu)酶Ⅱ：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負超螺旋引入DNA分子。同復制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶8、DNA解螺旋酶/解鏈酶（DNAhelicase)：通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3’?5’移動，而解螺旋酶I、II、III沿5’?3’移動。9、單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復性和保護單鏈不被核酸酶降解。（三）DNA的復制過程（大腸桿菌為例）雙鏈的解開RNA引物的合成DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段1、雙鏈的解開ftju制有特定的起始位點，叫做復制原點。ori(或o）、富含A、T的區(qū)段。從復制原點到終點，組成一個復制單位，叫復制子復制時，解鏈酶等先將DNA的一段雙鏈解開，形成復制點，這個復制點的形狀象一個叉子，故稱為復制叉雙鏈解開、復制起始P44大約20個DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保守序列相結(jié)合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna復制起始復合物使3個13bp直接重復序列變性,形成開鏈解鏈酶六體分別與單鏈DNA相結(jié)合(需DnaC幫助),進一步解開DNA雙鏈2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引發(fā)RNA引物的合成。引物長度約為幾個至10個核苷酸，3、DNA鏈的延伸DNA的半不連續(xù)復制（semi-discontinuousreplication)：DNA復制時其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復制。在DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導鏈；合成方向與復制叉移動的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。在DNA復制過程中，前導鏈能連續(xù)合成，而滯后鏈只能是斷續(xù)的合成5?￠3￠的多個短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。4、切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段（復制終止）當復制叉遇到約22個堿基的重復性終止子序列（Ter）時，Ter-Tus蛋白復合物能使DnaB不再將DNA解鏈，阻擋復制叉繼續(xù)前移。P47在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈（四）復制的幾種主要方式P421、雙鏈環(huán)狀、θ型復制、雙向等速2、滾環(huán)型：（1）模板鏈和新合成的鏈分開;（2）不需RNA引物，在正鏈3‘－OH上延伸（3）只有一個復制叉;3、D環(huán)復制單向復制的特殊方式如：動物線粒體DNA（五）真核生物中DNA的復制特點1、真核生物每條染色體上有多個復制起點，多復制子（約150bp左右）；2、復制叉移動的速度較慢（約50bp／秒），僅為原核生物的1／10。3、真核生物染色體在全部復制完之前,各個起始點不再重新開始DNA復制；真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。4、真核生物有多種DNA聚合酶。5、真核生物DNA復制過程中的引物及岡崎片段的長度均小于原核生物。（真核岡崎片段長約100-200bp，原核岡崎片段長約1000-2000bp。）（六）原核和真核生物DNA的復制特點比較復制起點（ori）：原核一個，真核多個；復制子：原核一個，真核多個；復制子長度：原核長；真核短；復制叉：原核多個；真核多個；復制移動速度：原核較快；真核較慢；真核生物染色體在全部完成復制前，各起始點的DNA復制不能再開始。而在快速生長的原核生物中，復制起點上可以連續(xù)開始新的DNA復制。原核生物染色體的復制與細胞分裂同步，可以多次復制；真核生物染色體的復制發(fā)生在S期，是細胞分類的特定時期，而且僅此一次。四、DNA的修復DNA修復系統(tǒng)功能錯配修復恢復錯配堿基切除修復切除突變的堿基核甘酸切除修復修復被破壞的DNADNA直接修復SOS系統(tǒng)修復嘧啶二體或甲基化DNADNA的修復，導致變異1、錯配修復（mismatchrepair）●Dam甲基化酶使母鏈位于5’GATC序列中腺甘酸甲基化●甲基化緊隨在DNA復制之后進行（幾秒種后至幾分鐘內(nèi)）●根據(jù)復制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯配堿基2、堿基切除修復excisionrepair所有細胞中都帶有不同類型、能識別受損核苷酸位點的糖苷水解酶，它能特意切除受損核苷酸上的N-β-糖苷鍵，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，統(tǒng)稱為AP位點。一些堿基在自發(fā)或誘變下會發(fā)生脫酰胺，然后改變配對性質(zhì)，造成氨基轉(zhuǎn)換突變腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤與胞嘧啶配對鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤與胞嘧啶配對胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏づc腺嘌呤配對3、核苷酸切除修復1）通過特異的核酸內(nèi)切酶識別損傷部位2）由酶的復合物在損傷的兩邊切除幾個核苷酸3）DNA聚合酶以母鏈為模板復制合成新子鏈4）DNA連接酶將切口補平4、DNA的直接修復在DNA光解酶的作用下將環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體甲基轉(zhuǎn)移酶使O6-甲基鳥嘌呤脫甲基生成鳥嘌呤，防止G-T配對SOS反應(yīng)(SOSresponse)：是細胞DNA受到損傷或復制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，細胞為求生存而產(chǎn)生的一種應(yīng)急措施。包括誘導DNA損傷修復、誘變效應(yīng)、細胞分裂的抑制以及溶原性細菌釋放噬菌體等。細胞癌變也與SOS反應(yīng)有關(guān)。兩個作用（1）DNA的修復；（2）產(chǎn)生變異五、DNA的轉(zhuǎn)座DNA的轉(zhuǎn)座或叫移位（transposition)：由可移位因子(transposableelement)介導的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座子（transposonTn）：存在于染色體DNA上可自主復制和位移的基本單位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)“轉(zhuǎn)座”這一命名并不十分準確，因為在轉(zhuǎn)座過程中，可移位因子的一個拷貝常常留在原來位置上，在新位點上出現(xiàn)的僅僅是它的拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA復制。原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：1、插入序列(IS)IS是最簡單的轉(zhuǎn)座子，不含有任何宿主基因，它們是細菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。2、復合轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)復合轉(zhuǎn)座子是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列

3、TnA家族TnA家族沒有IS序列、體積龐大(5000bp以上)、帶有3個基因，其中一個編碼β-內(nèi)酰胺酶(AmpR)，另兩個則是轉(zhuǎn)座作用所必須的。(三）轉(zhuǎn)座作用的機制轉(zhuǎn)座時發(fā)生的插入作用的普遍特征，是受體分子中有一段很短的(3～l2bp)、被稱為靶序列的DNA會被復制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個重復的靶序列之間。對于一個特定的轉(zhuǎn)座子來說，它所復制的靶序列長度是一樣的，如IS1兩翼總有9個堿基對的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。靶序列的復制可能起源于特定內(nèi)切酶所造成的黏性DNA末端。（三）轉(zhuǎn)座作用的遺傳學效應(yīng)p63（1）轉(zhuǎn)座引起插入突變（2）轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因（3）轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變（4）轉(zhuǎn)座引起的生物進化反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposon）：指通過RNA為中介，反轉(zhuǎn)錄成DNA后進行轉(zhuǎn)座的可動元件。第三章生物信息的傳遞（上）——從DNA到RNA轉(zhuǎn)錄(transcription)：生物體以DNA為模板合成RNA的過程。參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子RNA合成方向：5'到3'轉(zhuǎn)錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈；將另一條根據(jù)堿基互補原則指導mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈。DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因。轉(zhuǎn)錄單元（transcriptionunit）一段從啟動子開始至終止子結(jié)束的DNA序列。二、參與轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵酶與元件（一）RNA聚合酶●原核生物RNA聚合酶（大腸桿菌為例）全酶=核心酶+σ因子亞基基因相對分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動子識別βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶ω？11000（需查）1核心酶？σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動子真核細胞的三種RNA聚合酶特征比較酶位置轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對活性對α-鵝膏蕈堿的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質(zhì)hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核質(zhì)tRNA約10%存在物種特異性RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別

RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進行外切酶活性無5’3’，3’5’校對合成能力無有修復能力無有（二）啟動子(promoter)啟動子定義：指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。TATA區(qū)：酶的緊密結(jié)合位點（富含AT堿基，利于雙鏈打開）TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識別的信號轉(zhuǎn)錄起點與新生RNA鏈第一個核甘酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基。真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)核心啟動子（corepromoter）●定義：指保證RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點及轉(zhuǎn)錄起始位點上游TATA區(qū)●作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點，保證精確起始2、上游啟動子元件●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等●作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。（三）轉(zhuǎn)錄起始復合物二元閉合復合物、二元開鏈復合物、三元復合物。（原核）三、轉(zhuǎn)錄的基本過程1、起始位點的識別：RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合2、轉(zhuǎn)錄起始①RNA聚合酶全酶(a2s￠bb)與模板結(jié)合DNA雙鏈解開在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物5￠-pppG-OH+NTP?5￠-pppGpN-OH3￠+ppi轉(zhuǎn)錄起始復合物:RNApol(a2s￠bb)-DNA-pppGpN-OH3￠3、RNA鏈的延伸●亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；●在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。注意：9個核苷酸以前還在啟動子區(qū)，容易脫落，一旦形成9個以上的核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄正式進入眼神階段。4、轉(zhuǎn)錄終止終止子（terminator）：位于基因的末端，在轉(zhuǎn)錄終止點之前有一段回文序列（反向重復序列）約6-20bp。真核生物終止:由一段特定序列5′－AATAAA－3′和回文序列（反向重復序列）組成。分為兩類：●強終止子－內(nèi)部終止子：不依賴Rho(ρ)因子的終止?！袢踅K止子－需要ρ因子（rhofactor），又稱為ρ依賴性終止子（Rho-dependentterminator）不依賴r因子的終止當RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。終止位點上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；在終止位點前面有一段由4-8個A組成的序列，RNA的3’端為寡聚U發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U的共同作用使RNA從三元復合物中解離出來。依賴r因子的終止r因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。（二）、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程1.轉(zhuǎn)錄起始真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復雜。（1）.轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段順式作用元件(cis-actingelement)：影響自身基因表達活性的非編碼DNA序列。例：啟動子、增強子、弱化子等增強子：在啟動區(qū)存在的能增強或促進轉(zhuǎn)錄的起始的DNA序列。但不是啟動子的一部分。特點：1.遠距離效應(yīng)；2.無方向性；3.順式調(diào)節(jié)；4.無物種和基因的特異性；5.具有組織特異性；6.有相位性；7.有的增強子可以對外部信號產(chǎn)生反應(yīng)。（2）.轉(zhuǎn)錄因子：能直接、間接辨認和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactors,TF)。參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ--TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF、TFⅡE、TFⅡH（3）轉(zhuǎn)錄起始前復合物(pre-initiationcomplex,PIC)真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。（4）模板理論(piecingtheory)一個真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性、有專一性的復合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。2.轉(zhuǎn)錄延伸真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。3.轉(zhuǎn)錄終止——和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。四、轉(zhuǎn)錄后加工5’端加帽、3’端加尾、RNA的剪接、RNA的編輯1、在5’端加帽5’端的一個核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。帽子結(jié)構(gòu)功能：①能被核糖體小亞基識別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合；②m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA5’末端，以保護mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增強mRNA的穩(wěn)定。2、3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴AAUAAA：★準確切割。?！锛觩oly（A）多聚腺苷酸尾巴功能：提高了mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。3、RNA的剪接生物體內(nèi)內(nèi)含子的主要類型：

U-AG、AU-AC、Ⅰ類內(nèi)含子、Ⅱ類內(nèi)含子Ⅲ類內(nèi)含子參與RNA剪接的物質(zhì)：snRNA（核內(nèi)小分子RNA）、snRNP（與snRNA結(jié)合的核蛋白）、核內(nèi)RNA（U1、U2、U4、U5、U6）4、RNA的編輯編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現(xiàn)象。五、原核生物與真核生物mRNA的特征比較1、原核生物mRNA的特征●半衰期短●多以多順反子的形式存在單順反子mRNA：只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA。多順反子mRNA：編碼多個蛋白質(zhì)的mRNA。Z：β-半乳糖苷酶Y：透過酶A：乙酰基轉(zhuǎn)移酶ZYA為結(jié)構(gòu)基因●5’端無“帽子”結(jié)構(gòu)，3’端沒有或只有較短的poly（A）結(jié)構(gòu)。●SD序列：原核生物起始密碼子AUG上游7-12個核苷酸處有一被稱為SD序列的保守區(qū)。mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。P852、真核生物mRNA的特征“基因”的分子生物學定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核甘酸序列?！?’端存在“帽子”結(jié)構(gòu)●多數(shù)mRNA3’端具有poly（A）尾巴（組蛋白除外）●以單順反子的形式存在六、RNA合成與DNA合成異同點相同點：1、都以DNA鏈作為模板2、合成的方向均為5’→3’3、聚合反應(yīng)均是通過核苷酸之間形成的3’,5’-磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈延長。不同點：

復制轉(zhuǎn)錄模板兩條鏈均復制模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對稱轉(zhuǎn)錄）原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代雙鏈DNA（半保留復制）mRNA，tRNA，rRNA配對A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物RNA引物無第四章生物信息的傳遞（下）—從mRNA到蛋白質(zhì)翻譯：指將mRNA鏈上的核甘酸從一個特定的起始位點開始，按每三個核甘酸代表一個氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。蛋白質(zhì)合成的場所是核糖體。蛋白質(zhì)合成的模板是mRNA模板與氨基酸之間的接合體是tRNA蛋白質(zhì)合成的原料是20種氨基酸一、遺傳密碼?a?a三聯(lián)子（一）三聯(lián)子密碼：mRNA鏈上每三個核甘酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個氨基酸，這三個核甘酸就稱為密碼子或三聯(lián)子密碼(tripletcoden)?！裰?966年，20種氨基酸對應(yīng)的61個密碼子和三個終止密碼子全部被查清。（三）遺傳密碼的性質(zhì)1、連續(xù)性編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無間斷也無交叉?；驌p傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導致框移突變(frameshiftmutation)。從mRNA5￠端起始密碼子AUG到3￠端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開放閱讀框架(openreadingframe,ORF)。2、簡并性由一種以上密碼子編碼同一個氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并（degeneracy），對應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymouscodon）。3、通用性與特殊性蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動物細胞的線粒體、植物細胞的葉綠體。4、擺動性轉(zhuǎn)運氨基酸的tRNA上的反密碼子需要通過堿基互補與mRNA上的遺傳密碼子反向配對結(jié)合，在密碼子與反密碼子的配對中，前兩對嚴格遵守堿基配對原則，第三對堿基有一定的自由度，可以“擺動”，這種現(xiàn)象稱為密碼子的擺動性。二、tRNA的結(jié)構(gòu)、功能與種類（一）tRNA的結(jié)構(gòu)1、二級結(jié)構(gòu)：三葉草形2、三級結(jié)構(gòu)：“L”形（二）tRNA的功能1、解讀mRNA的遺傳信息2、運輸?shù)墓ぞ?，運載氨基酸t(yī)RNA有兩個關(guān)鍵部位：●3’端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。●與mRNA結(jié)合部位—反密碼子部位tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA鏈上的密碼子相識別，把所帶氨基酸放到肽鏈的一定位置。1、起始tRNA和延伸tRNA能特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA稱起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。真核生物：起始密碼子AUG所編碼的氨基酸是Met，起始AA-tRNA為Met-tRNAMet。原核生物：起始密碼子AUG所編碼的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA為fMet-tRNAfMet2、同工tRNA代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶識別（P119）。3、校正tRNA無義突變校正tRNA：可以通過改變反密碼子區(qū)校正無義突變錯義突變校正tRNA：通過反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質(zhì)。無義突變：在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。錯義突變：由于結(jié)構(gòu)基因中某個核甘酸的變化使一種氨基酸的密碼子變?yōu)榱硪环N氨基酸的密碼子，這種基因突變叫錯義突變。GGA（甘氨酸）AGA（精氨酸）四、氨酰-tRNA合成酶AA-tRNA合成酶是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，它既能識別tRNA，又能識別氨基酸，對兩者都具有高度的專一性。三、核糖體的結(jié)構(gòu)與功能核糖體是由rRNA（ribosomalribonucleicacid）和多種蛋白質(zhì)結(jié)合而成的一種大的核糖核蛋白顆粒，蛋白質(zhì)肽鍵的合成就是在這種核糖體上進行的。細菌是70s{50s\30s}哺乳動物是80s{60s\\40s}（二）核糖體的功能：合成蛋白質(zhì)在單個核糖體上，可化分多個功能活性中心，在蛋白質(zhì)合成過程中各有專一的識別作用和功能?！駇RNA結(jié)合部位——小亞基●結(jié)合或接受AA-tRNA部位（A位）——大亞基●結(jié)合或接受肽基tRNA的部位——大亞基●肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）——大亞基●形成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心）——大亞基四、蛋白質(zhì)合成的過程(生物學機制）氨基酸的活化 翻譯的起始肽鏈的延伸肽鏈的終止蛋白質(zhì)前體的加工(一)氨基酸的活化原核生物中，起始氨基酸是：甲酰甲硫氨酸起始AA-tRNA是：fMet-tRNAfMet真核生物中，起始氨基酸是：甲硫氨酸起始AA-tRNA是：Met-tRNAMet(二)翻譯的起始原核生物（細菌）為例：所需成分：30S小亞基、50S大亞基、模板mRNA、fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+翻譯起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、翻譯起始(翻譯起始復合物形成)又可被分成3步：（P129）1.核蛋白體大小亞基分離2、30S小亞基通過SD序列與mRNA模板相結(jié)合。3.在IF-2和GTP的幫助下，fMet-tRNAfMet進入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對。4、帶有tRNA、mRNA和3個翻譯起始因子的小亞基復合物與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放翻譯起始因子。

真核生物翻譯起始的特點●核糖體較大,為80Ｓ；●起始因子比較多；●mRNA5′端具有m7Gppp帽子結(jié)構(gòu)●Met-tRNAMet●mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′端polyA都參與形成翻譯起始復合物；真核生物翻譯起始復合物形成(區(qū)別原核生物)原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合。而在真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始復合物（P131）。(三)肽鏈的延伸肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個氨基酸就是一個循環(huán)，每個循環(huán)包括：AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位。延伸因子(elongationfactor,EF)：原核生物：EF-T(EF-Tu,EF-Ts)、EF-G真核生物：EF-1、EF-21、AA-tRNA與核糖體A位點的結(jié)合需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts兩種延伸因子2、肽鍵形成：是由轉(zhuǎn)肽酶/肽基轉(zhuǎn)移酶催化3、移位：核糖體向mRNA3’端方向移動一個密碼子。需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子A位點是新到來的氨酰-tRNA的結(jié)合位點。P位點是肽酰-tRNA的結(jié)合位點。E位點是延伸過程中釋放tRNA的位點，即，去氨酰-tRNA通過E位點脫出，釋放到核糖體外的胞質(zhì)中。（四）肽鏈的終止RF1：識別終止密碼子UAA和UAG終止因子RF2：識別終止密碼子UAA和UGARF3：具GTP酶活性，刺激RF1和RF2活性，協(xié)助肽鏈的釋放真核生物只有一個終止因子（eRF）(五)蛋白質(zhì)前體的加工1、N端fMet或Met的切除2、二硫鍵的形成3、特定氨基酸的修飾磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化和羧基化4、切除新生肽鏈中非功能片段（六）蛋白質(zhì)折疊由核糖體合成的所有新生肽鏈必須通過正確的折疊才能形成動力學和熱力學穩(wěn)定的三位構(gòu)象，從而表現(xiàn)出生物學活性或功能。新生多肽→一級結(jié)構(gòu)→二級結(jié)構(gòu)→三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)具有活性→（對于寡聚蛋白需要組裝稱為四級結(jié)構(gòu)才有活性。(七)蛋白質(zhì)合成抑制劑青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細胞核糖體發(fā)生作用，從而阻遏原核生物蛋白質(zhì)的合成，抑制細菌生長。被廣泛用于人類醫(yī)學。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細胞核糖體結(jié)合，又能與真核生物核糖體結(jié)合，妨礙細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，影響細胞生長。氯霉素有時也用于治病，但劑量和周期受到較嚴控制。五、蛋白質(zhì)的運轉(zhuǎn)機制1、翻譯-運轉(zhuǎn)同步機制2、翻譯后運轉(zhuǎn)機制(1)線粒體蛋白質(zhì)跨膜運轉(zhuǎn)(2)葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜運轉(zhuǎn)3、核定位蛋白的運轉(zhuǎn)機制4、蛋白質(zhì)的降解?*蛋白質(zhì)的合成位點與功能位點常常被細胞內(nèi)的膜所隔開，蛋白質(zhì)需要運轉(zhuǎn)。?*核糖體是真核生物細胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場所，任何時候都有許多蛋白質(zhì)被輸送到細胞質(zhì)、細胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各個部分，補充和更新細胞功能。?*細胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，蛋白質(zhì)必須準確無誤地定向運送才能保證生命活動的正常進行。?*細胞中蛋白質(zhì)的合成：絕大多數(shù)在細胞質(zhì)中合成；一小部分在細胞器（葉綠體和線粒體）中合成。?*定位于細胞器內(nèi)的大部分蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)中合成，細胞器內(nèi)合成的留在細胞器內(nèi)。?*蛋白質(zhì)插入或穿過生物膜的過程稱為蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)（proteintranslocation）。蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)的兩種方式翻譯-運轉(zhuǎn)同步（co-translationaltranslocation）◆是即將進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的易位方式；◆蛋白質(zhì)正合成的時候就可與運轉(zhuǎn)裝置結(jié)合；◆蛋白質(zhì)合成時，核糖體定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，稱膜結(jié)合核糖體(membrane-boundribosome）?！舴置诘鞍踪|(zhì)大多是以同步機制運輸?shù)姆g后運轉(zhuǎn)（post-translationaltranslocation）◆蛋白質(zhì)翻譯完成后從核糖體上釋放，然合擴散至合適的靶膜并與運轉(zhuǎn)裝置結(jié)合?！舻鞍踪|(zhì)合成時，其核糖體不與任何細胞器相連，稱游離核糖體(freeribosome)◆在細胞器發(fā)育過程中，由細胞質(zhì)進入細胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運轉(zhuǎn)機制運輸?shù)摹！魠⑴c生物膜形成的蛋白質(zhì)，依賴于上述兩種不同的運轉(zhuǎn)機制鑲?cè)肽?nèi)。蛋白性質(zhì)運轉(zhuǎn)機制主要類型分泌蛋白質(zhì)在結(jié)合核糖體上合成，并以翻譯-運轉(zhuǎn)同步機制運輸免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等細胞器發(fā)育蛋白質(zhì)在游離核糖體上合成，以翻譯后運轉(zhuǎn)機制運輸核、葉綠體、線粒體、乙醛酸循環(huán)體、過氧化物酶體等細胞器中的蛋白質(zhì)膜的形成兩種機制兼有質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、類囊體中的蛋白質(zhì)1、翻譯-運轉(zhuǎn)同步機制信號肽假說●信號肽：能啟動蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)的任何一段多肽。（常指新合成多肽鏈中用于指導蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的N-末端氨基酸序列（有時不一定在N端））?！窠^大部分被運入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個信號肽?！裥盘栃蛄刑攸c：（1）一般帶有10-15個疏水氨基酸；（2）在靠近該序列N-端常常有1個或數(shù)個帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點處常常帶有數(shù)個極性氨基酸，離切割位點最近的那個氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（丙氨酸或甘氨酸）?！裥盘栯募僬f內(nèi)容：（1）蛋白質(zhì)合成起始首先合成信號肽（2）SRP（信號識別蛋白）與信號肽結(jié)合，翻譯暫停（3）SRP與SRP受體結(jié)合，核糖體與膜結(jié)合，翻譯重新開始（4）信號肽進入膜結(jié)構(gòu)（5）蛋白質(zhì)過膜，信號肽被切除，翻譯繼續(xù)進行（6）蛋白質(zhì)完全過膜，核糖體解離信號肽與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的關(guān)系P144（1）完整信號肽是保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的必要條件；（2）僅有信號肽不足以保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運發(fā)生；（3）信號序列切除并不是轉(zhuǎn)運所必需；（4）并非所有運轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)都有可降解的信號肽。蛋白質(zhì)翻譯運轉(zhuǎn)同步運輸?shù)幕具^程可分兩個階段：首先：帶有新生肽鏈的核糖體與膜結(jié)合；然后：新生肽鏈進入膜通道并易位。核糖體與膜結(jié)合需要信號識別顆粒（signalrecognitionparticle,SRP）。SRP有兩種能力：◆結(jié)合新合成的分泌型蛋白的信號序列；◆結(jié)合位于膜上的SRP受體。2、翻譯后運轉(zhuǎn)機制

前導肽及其特性:

?翻譯后跨膜易位的蛋白質(zhì)，前體一般含前導肽(leaderpeptide)，前導肽在跨膜運轉(zhuǎn)中起重要作用。

?過膜后，前導肽水解，蛋白質(zhì)變?yōu)橛泄δ艿牡鞍踪|(zhì)。前導肽的一般特性：（1）帶正電荷堿性氨基酸（Arg）較豐富，分散于不帶電荷的氨基酸序列之間；（2）缺少帶負電荷的酸性氨基酸；（3）羥基氨基酸（Ser）含量較高；（4）有形成兩親（親水和疏水）α-螺旋能力。線粒體蛋白質(zhì)跨膜運轉(zhuǎn)Hsp70為分子伴侶分子伴侶：結(jié)合在一些不完全裝配或不恰當折疊蛋白上，幫助它們折疊或防止它們聚集的蛋白質(zhì)。分子伴侶的生物學功能(1)幫助新生蛋白質(zhì)正確折疊(2)糾正錯誤折疊或介導其降解泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme，E1)泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugatingenzyme，E2)泛素蛋白連接酶(ubiquitin-proteinligatingenzyme,E3)E1,E2,E3的作用：E1激活泛素分子，E2就負責把泛素分子綁在被降解蛋白質(zhì)上。E3能識別被降解的蛋白質(zhì)。第五章分子生物學研究法﹡重組DNA技術(shù)-基因工程﹡分子雜交及相關(guān)技術(shù)﹡聚合酶鏈式反應(yīng)的原理和應(yīng)用﹡DNA多態(tài)性及其檢測基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點突變和PCR擴增等?；蚬こ蹋褐冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入新的宿主細胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達?；蚬こ碳夹g(shù)實際上是核酸操作技術(shù)的一部分。1、理論上的三大發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)主要是DNADNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復制機制遺傳密碼子的破譯2、技術(shù)上的三大發(fā)明限制酶和連接酶體外切割和連接DNA片斷質(zhì)粒改造成載體以攜帶DNA片斷克隆逆轉(zhuǎn)錄酶的使用①常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標記、補平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基②載體vector自我復制克隆載體、表達載體原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）真核載體：動物病毒載體pLXSN載體的條件?分子?。?lt;10Kb）?有限制酶酶切位點?可自主復制?有足夠的copy數(shù)?帶篩選的標志1982年--轉(zhuǎn)基因小鼠1997年克隆綿羊“多利”1998年

--克隆鼠2001年2月--人類基因組重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技術(shù)。重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細胞或生物體內(nèi)，以達到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點突變和PCR擴增等?；蚬こ蹋褐冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入新的宿主細胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達。基因工程技術(shù)實際上是核酸操作技術(shù)的一部分?；蛘哒f基因操作技術(shù)服務(wù)于基因工程。一、限制酶限制性內(nèi)切核酸酶(restrictiveendonucleases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術(shù)刀”）。發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。1、限制酶的命名命名原則：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。如：屬名菌株名EcoRI種名編號EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個限制酶。2、限制酶的特點：（1）.限制性內(nèi)切酶一般識別完全的回文結(jié)構(gòu)，它具有兩個基本特點：①能夠在中間劃一個對稱軸，兩側(cè)的序列兩兩對稱互補配對；②兩條互補鏈的5’—3’的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180度，則兩條鏈重疊。（2）.識別４-8個相連的核苷酸組成的特定核甘酸序列。（3）切割方式有兩種①錯位切割，產(chǎn)生互補性的粘性末端。錯位切割所產(chǎn)生的DNA末端，兩條鏈不平齊，一條鏈凸出，一條鏈凹進，這種末端稱為黏性末端。帶有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互補配對，連接成新的重組分子。②

沿對稱軸切割，產(chǎn)生平齊末端切割后，DNA末端的一條鏈多出一至幾個核苷酸，成為突出末端，又稱粘性末端包括3’突出、5’突出。切割兩條鏈時產(chǎn)生兩端平整的DNA分子，稱為平末端。（4）具有同裂酶來源不同的限制性內(nèi)切酶識別同樣的核甘酸靶序列。如：BamHI和BstI具有相同的識別序列GGATCC。（5）具有同尾酶來源各異，識別的靶序列也不同，但卻產(chǎn)生相同的黏性末端，故同尾酶產(chǎn)生的黏性末端可以連接起來，但一般不能再被原來的任何一種酶所切割。如：TaqI、ClaI和AccI為一組同尾酶，其中任何一種酶切割DNA分子都產(chǎn)生5′端CG凸出的粘性末端。二、目的基因及載體

（一）目的基因（一）目的基因的獲得1）化學合成法：較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物、測序引物、定點突變、核酸雜交探針1）DNA的化學合成單鏈DNA短片段的合成已成為分子生物學和生物技術(shù)實驗室的常規(guī)技術(shù)。化學合成DNA分子是把新的脫氧核糖核苷酸加到DNA雙鏈的5’端，而在細胞中DNA分子合成的方向恰恰相反。整個DNA的化學合成過程可以在一個反應(yīng)柱上連續(xù)進行，并且可以對合成過程進行計算機控制。目前常用的化學合成DNA的方法是磷酰胺法。2）基因組文庫和cDNA文庫基因庫，也叫基因組文庫，DNA文庫（DNAlibrary)是指用克隆的方法將一種生物的全部基因組長期以重組體方式保持在適當?shù)乃拗髦?。將生物細胞基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。這樣保存的基因組是多拷貝、多片段，當需要某一片段時，可以在這樣的“圖書館”中查找（沒有目錄）。cDNA文庫首先獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，經(jīng)克隆后形成文庫。cDAN文庫和基因組文庫的不同之處在于，cDNA文庫除卻了mRNA拼接過程中除去的內(nèi)含子等成分，便于DNA重組的使用。其復雜性比基因文庫低得多。主要用于研究蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可根據(jù)克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出來。組建一個cDNA文庫的步驟：1)分離表達目的基因的組織或細胞2)從組織或細胞中制備總體RNA和mRNA3）第一條cDNA鏈的合成，需要RNA模板，cDNA合成引物，逆轉(zhuǎn)錄酶，4種脫氧核苷三磷酸以及相應(yīng)的緩沖液(Mg2+)等。4)第二條cDNA鏈的合成5)cDNA的甲基化和接頭的加入6)雙鏈cDNA與載體的連接（二）載體載體（Vector）:將外源目的DNA導入受體細胞，并能自我復制和增殖的工具。載體具以下特征：1)分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進入宿主細胞并在其中增殖；（質(zhì)粒大于15kb時，其將外源DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌的效率將大大降低。）2)有多種限制酶切點，每種限制酶最好只有單一切點；3)被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復制能力，并有可選擇的標記基因（如，抗藥基因）。4）可以在載體細胞中獨立復制，即本身是一個復制子?；蚬こ梯d體的分類根據(jù)載體的分子生物學特性劃分（1）.

質(zhì)粒型載體—環(huán)狀dsDNA分子，自主復制（質(zhì)粒DNA載體）。如：質(zhì)粒載體（2）.

病毒型載體—環(huán)狀、線狀、ss-和ds-DNA分子，形成病毒顆粒。如：噬菌體載體（3）.混合型載體—具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細胞生物學特性。如：柯斯質(zhì)粒載體用于原核生物宿主的載體目前已構(gòu)建應(yīng)用的基因工程載體主要有：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體。（一）.質(zhì)粒（plasmid）：質(zhì)粒是細胞染色體或核區(qū)DNA外能夠自主復制的很質(zhì)粒載體特點1、至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。2、

至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源DNA插入。3、

至少應(yīng)有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。*注：前三個特點必不可少。1、標記基因的作用1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。2、

標記基因的種類1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr2）生化標記基因其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ3、常用的遺傳標記基因及其作用機制1)四環(huán)素抗性基因（Tetr，Tcr）2)氨芐青霉素抗性基因（Ampr，Apr）3)氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）三DNA重組基本程序1.分—載體和目的基因的分離2.切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用3.接—載體與目的基因連接成重組體4.轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細胞5.篩—目的基因序列克隆的篩選和鑒定6.表－目的基因在宿主細胞的表達目的基因的獲取方法：從基因組中提取、CDNA法、化學合成法、PCR法。鑒定得到的目的基因的鑒定方法：抗性選擇、提取質(zhì)粒電泳鑒定大小、快速提取酶切鑒定、菌落雜交法、DNA序列分析。第二節(jié)分子雜交及相關(guān)技術(shù)分子雜交：是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上,然后用標記的探針與被固定的分子雜交,經(jīng)顯影后顯示出目的分子所處的位置的過程.分子雜交包括：DNA-DNA雜交（原位雜交、點雜交、Southern雜交），DNA-RNA雜交（Northern雜交）及蛋白雜交（Western雜交）等。一、雜交探針（Probe）的獲得Probe：探針，是由放射性同位素、生物素或熒光染料等進行標記后，能與目的基因片段特異性雜交的已知序列的核酸片段。根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。DNA探針：DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列?？蓮囊呀⒌幕蚪M文庫中篩選分離并克隆制備。cDNA探針（complementaryDNA）：

cDNA是指互補于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）?？梢詮囊褬?gòu)建的cDNA文庫中篩查和分離目的基因探針。RNA探針：RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復制過程中得到標記的，標記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。寡核苷酸探針：根據(jù)已知基因序列，人工合成一段互補的DNA片段。一般長約15～50個bpRNA探針和cRNA探針具有DNA探針所不能比擬的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標記方法復雜等缺點。前三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。三、DNA雜交常用的方法用途：用于快捷地檢查出菌落中是否有某個基因，但不能檢出基因的大小或重復的程度。（二）.SouthernDNA印跡雜交將重組體DNA用限制酶切割，分離出目的DNA后進行電泳分離，再將其原位轉(zhuǎn)至薄膜上，固定后用探針雜交的方法叫Southern雜交。用途：用來檢查DNA樣品中是否存在有某個特定的基因，而且還可知道其大小及酶切位點的分布。SouthernDNA印跡雜交主要步驟：DNA提取，限制性內(nèi)切酶切割成DNA片段。DNA電泳。印跡，將進行DNA電泳的凝膠置于印跡設(shè)備中，緩沖液內(nèi)含有堿，在印跡過程中DNA變性，變成單鏈DNA。凝膠上的DNA分子通過毛細管作用或電導作用被原封不動地“吸印”到濾膜上。80℃烘烤1-2小時，DNA片段牢固結(jié)合到膜上。帶有DNA的濾膜與雜交探針一起溫育，探針與DNA結(jié)合。洗去沒有結(jié)合的游離探針。用X光底片曝光后所得的放射性自顯影圖片，同溴化乙錠染色的凝膠譜帶進行對照比較，便可鑒定出那一條限制片段是與探針核苷酸同源的。（三）.菌落印跡原位雜交(insituhybridization)讓含重組體的菌落或噬菌斑由平板轉(zhuǎn)移到膜上并釋放出DNA，變性并固定在膜上，再同DNA探針雜交的方法叫原位雜交。用途：用于在轉(zhuǎn)化菌落中篩選帶有目的基因的重組克隆四、RNA雜交常用方法NorthernRNA印跡雜交：將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜或其它化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法，被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA.用途：用來檢查基因組中某個特定的基因是否得到轉(zhuǎn)錄。原理及步驟：提取總RNA、提純分離mRNA、瓊脂糖凝膠電泳分離RNA、轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜、雜交檢測關(guān)于印跡技術(shù)的概念印跡是將DNA、RNA或蛋白質(zhì)固定在固體支持物的過程。印跡的目的是減少待測物質(zhì)的流動性，防止丟失、擴散，保持原有的位置，便于反復使用，容易進行斑點和序列分析，簡化分離手續(xù)。Southern雜交、Northern雜交和Western印跡、Eastern印跡實際上都是印跡技術(shù)。但印記轉(zhuǎn)移的目標物質(zhì)不同，鑒別方法也不同。五、蛋白質(zhì)印跡法（Westernbloting)Westernblotting分析(p189)是蛋白質(zhì)分析的技術(shù)在基因表達研究中，應(yīng)用非常廣泛，因為蛋白質(zhì)是基因的產(chǎn)物，研究蛋白質(zhì)的變化來分析判斷基因轉(zhuǎn)錄的高與低。步驟：細胞→提取總蛋白質(zhì)→聚丙烯酰胺凝膠電泳→轉(zhuǎn)膜（Westernblotting，常用醋酸纖維膜）→固定→用化學發(fā)光試劑標記（抗體抗原反應(yīng)）→分析相對量以判斷表達量的多少。第三節(jié)聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）PCR是模擬體內(nèi)DNA復制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。1.增效PCR（boosterPCR）2.巢式PCR（nestPCR）3、多重PCR4、逆轉(zhuǎn)錄PCR(retro-transcriptionPCR，簡稱RTPCR)5.不對稱PCR6.反向PCR7、錨定PCR（AnchoredPCR,A-PCR）先合成cDNA，并用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在其3’-可變區(qū)末端加上一個PolyG尾巴，所用引物是具5’-polyC尾巴，可以與PolyG尾巴結(jié)合，是一個固定點，無論其余部分序列如何，只識別片段末端，由此進行PCR擴增，叫錨定PCR。錨定PCR主要用于分析具有可變末端的DNA序列.PCR技術(shù)的應(yīng)用

1.遺傳性疾病的基因診斷2.傳染病的診斷(肝炎病毒)3.癌基因檢測4.法醫(yī)學(親子鑒定)上的應(yīng)用5.DNA測序6.基因克隆7.引入基因點突變,基因融合等第四節(jié)DNA多態(tài)性（DNAPolymorphism）群體中每個個體（體細胞）的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100～500bp就有一個是不相同的，它們多位于內(nèi)含子序列中，表型并沒有改變，這種表現(xiàn)稱為DNA多態(tài)。常用做遺傳分析中的標記。除一卵雙生子外，沒有兩個個體的基因組DNA是完全相同的。DNA多態(tài)性有兩類：1.位點多態(tài)性：是由于等位基因之間在特定的位點上DNA序列存在差異，也就是基因組中散在的堿基的不同，包括點突變（轉(zhuǎn)換和顛換），單個堿基的置換、缺失和插入。突變是基因多態(tài)性的一種特殊形式，單個堿基的置換又稱為單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。2.序列長度多態(tài)性：又稱可變數(shù)目變異串聯(lián)重復序列（variablenumberoftandemrepeats,VNTRS），重復序列以各自的核心序列（重復單元）首尾相連多次重復，散在地分布于染色體上，以插入/缺失方式形成多態(tài)。VNTR兩側(cè)的酶切位點固定，但兩酶切點之間的串聯(lián)重復拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長度的片段。PCR-SSCP(Single-StrandedConformationPolymorphroism)SSCP：單鏈構(gòu)象多態(tài)性是指單鏈DNA由于堿基序列不同而引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同。據(jù)此，可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測。通常與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)。基因芯片，又稱生物芯片，DNA芯片，DNA探針微陣列（Microarray）。它集成了大量的密集排列的基因探針，這些探針位于芯片的特定位點上，可與被熒光標記的若干靶核酸序列互補匹配，利用基因芯片雜交圖象，可以確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補匹配的原理確定靶基因的序列，實現(xiàn)核酸序列的分子識別?；蛐酒茉谕粫r間內(nèi)分析大量的基因，實現(xiàn)生物基因信息的大規(guī)模檢測。1.基因組掃描2.尋找基因功能3.基因型及單堿基多態(tài)（SNP）4.突變檢測5.基因表達6.基因測序7.藥物篩選幾乎所有的生物學研究領(lǐng)域。作為一種高通量的基因檢測方法，具有巨大的應(yīng)用潛力。第六章原核生物基因表達調(diào)控基因表達(geneexpression)：在一定調(diào)節(jié)機制控制下，基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生其蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)錄后直接產(chǎn)生其RNA產(chǎn)物，如tRNA、rRNA等的過程。大多數(shù)基因的表達產(chǎn)物是蛋白質(zhì),部分基因如tRNA和rRNA基因表達產(chǎn)物是RNA。二、基因表達調(diào)控圍繞基因表達過程中發(fā)生的各種各樣的調(diào)節(jié)方式都通稱為基因表達調(diào)控.轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控翻譯水平的調(diào)控DNA水平包括基因丟失、基因重排、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。RNA水平包括轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工、mRNA從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)動、mRNA穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)水平包括翻譯過程；翻譯后加工的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。三、基因表達的特性：1）時間特異性或階段特異性2）空間特異性或組織細胞特異性1、時間特異性按功能需要，某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達的時間特異性(temporalpecificity)。多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性(stagespecificity)。2、空間特異性（spatialspecificity）:在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達的空間特異性(spatialspecificity)?；虮磉_伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cellortissuespecificity)。四、基因表達的方式組成性基因表達適應(yīng)性表達（誘導和阻遏表達）1、組成性基因表達指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因的表達。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶等代謝過程中十分必須的蛋白質(zhì)或酶的表達。某些基因在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因(house-keepinggene)。如：微管蛋白基因、糖酵解酶系基因、核糖體蛋白基因等。2、適應(yīng)性表達（誘導和阻遏表達）指環(huán)境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。誘導表達（induction）指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被激活，從而使基因的表達產(chǎn)物增加。這類基因稱為可誘導基因。阻遏表達（repression）指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被抑制，從而使基因的表達產(chǎn)物減少。這類基因稱為可阻遏基因。在一定機制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無論其為何種表達方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達，即為協(xié)調(diào)表達(coordinateexpression)，這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)(coordinateregulation)。五、基因表達調(diào)控的基本原理：1.基因表達調(diào)控的多層次和復雜性四個基本調(diào)控點（1）基因結(jié)構(gòu)的活化（2）轉(zhuǎn)錄起始：最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)（3）轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運（4）翻譯及翻譯后加工2.基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素基因表達的調(diào)節(jié)與基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，生物個體或細胞所處的內(nèi)、外環(huán)境，以及細胞內(nèi)所存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)。三個基本要素：1）特異的DNA調(diào)節(jié)序列2）調(diào)節(jié)蛋白3）RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素1、特異DNA序列原核生物的操縱子真核生物的順式作用元件2、調(diào)節(jié)蛋白真核生物的順式作用元件：是指可影響自身基因表達活性的特異DNA序列。通常是非編碼序列。包括啟動子、增強子及沉默子等2、調(diào)節(jié)蛋白是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白因子，如原核生物的阻遏蛋白和CAP蛋白（降解物基因活化蛋白）、真核生物的基本轉(zhuǎn)錄因子和特異轉(zhuǎn)錄因子等。3、RNA聚合酶原核啟動序列或真核啟動子是由轉(zhuǎn)錄起始點、RNA聚合酶結(jié)合位點及控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)組件組成。啟動序列影響其與RNA聚合酶的親和力，而親和力大小則直接影響轉(zhuǎn)錄起動的頻率。六、基因表達調(diào)控的生物學意義1、適應(yīng)環(huán)境、維持生長和增殖2、維持個體發(fā)育與分化基因表達調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控原核生物主要是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因的表達。當需要某種基因產(chǎn)物時，就大量合成這種mRNA，當不需要這種基因產(chǎn)物時就抑制這種mRNA的轉(zhuǎn)錄，就是讓相應(yīng)的基因不表達。通常所說的基因不表達，并不是說這個基因就完全不轉(zhuǎn)錄為mRNA，而是轉(zhuǎn)錄的水平很低，維持在一個基礎(chǔ)水平（本底水平）。基因表達完全關(guān)閉的情況使極為少見的。1、負調(diào)控negativeregulation在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是表達的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被關(guān)閉，這樣的控制系統(tǒng)就叫做負控系統(tǒng)。其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)叫做阻遏蛋白兩種類型：負控誘導和負控阻遏2、正調(diào)控positiveregulation在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是關(guān)閉的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被開啟，這樣的控制系統(tǒng)就叫做正控系統(tǒng)。其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)叫做無輔基誘導蛋白（激活蛋白)兩種類型:正控誘導和正控阻遏系統(tǒng)（二）特殊代謝物調(diào)節(jié)基因表達的類型1、可誘導調(diào)節(jié)一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導下使基因活化。調(diào)節(jié)分解代謝的操縱子，同時受cAMP-CAP的活性調(diào)節(jié)2、可阻遏調(diào)節(jié)一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來開啟的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)閉狀態(tài)，基因的表達被阻遏.調(diào)節(jié)合成代謝的操縱子（三）原核生物基因表達調(diào)控的特點調(diào)節(jié)的主要環(huán)節(jié)在轉(zhuǎn)錄水平上進行σ因子決定RNA聚合酶識別特異性主要通過操縱子模式進行調(diào)節(jié)阻遏蛋白對轉(zhuǎn)錄的抑制作用（阻遏機制）是普遍存在的負調(diào)控作用原核生物中基因的組織形式幾個作用相關(guān)的基因在染色體上串連排列在一起，由同一個調(diào)控系統(tǒng)來控制。這樣的一個整體稱為一個操縱元(operon)。二、弱化子對基因活性的影響1、弱化子在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列，當操縱子被阻遏時，RNA合成被終止，這段核苷酸起終止轉(zhuǎn)錄信號作用.2、弱化子作用機制RNA分子在分子內(nèi)采用不同的堿基配對方式，形成不同的二級結(jié)構(gòu)而參與調(diào)控。當不同的結(jié)構(gòu)對是否允許終止存在差異時，改變二級結(jié)構(gòu)可對轉(zhuǎn)錄終止進行調(diào)控三、降解物對基因活性的調(diào)節(jié)1、葡萄糖效應(yīng)（降解物抑制作用）是指當葡萄糖和其它糖類一起作為細菌的碳源時葡萄糖總是優(yōu)先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖類的利用的現(xiàn)象。2、降解物對基因活性的調(diào)節(jié)葡萄糖通過降低cAMP的含量而抑制基因表達四、細菌的應(yīng)急反應(yīng)1、細菌的應(yīng)急反應(yīng)指細菌在惡劣生長環(huán)境中關(guān)閉tRNA和核糖體形成的能力。2、細菌的應(yīng)急反應(yīng)的機制應(yīng)急信號：鳥苷四磷酸（ppGpp）、鳥苷五磷酸（pppGpp）誘導物：空載tRNA乳糖操縱子模型1、Z、Y、A基因的產(chǎn)物為一條多順反子mRNAlacZ：編碼β-半乳糖苷酶，它可以將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖；lacY：編碼半乳糖苷透性酶，它能將乳糖運送透過細菌的細胞壁；lacA：編碼硫代半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，進行乳糖代謝。cAmp-CAP代謝激活蛋白（Cataboliteactivatingprotein,CAP）是cAmp的受體蛋白（cyclicAmpreceptorprotein,CRP）cAmp-CAP復合物，是lac操縱元的正調(diào)控因子4、葡萄糖對lac操縱子的影響葡萄糖腺苷酸環(huán)化酶活性降低ATP無法轉(zhuǎn)變成cAMP不能形成CAP-cAMP復合蛋白RNA酶無法結(jié)合在DNA上結(jié)構(gòu)基因不表達。代謝物阻遏效應(yīng)研究認為葡萄糖的某些降解產(chǎn)物抑制lacmRNA的合成，這種效應(yīng)稱之為代謝物阻遏效應(yīng).特殊代謝物調(diào)節(jié)基因活性的類型可誘導調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)分解代謝的操縱子，同時受cAMP-CAP的活性調(diào)節(jié)可阻遏調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)合成代謝的操縱子（三）trp操縱子的阻遏調(diào)控機制色氨酸操縱子主要參與調(diào)控一系列用于色氨酸合成代謝的酶蛋白的轉(zhuǎn)錄合成。當細胞內(nèi)缺乏色氨酸時，此操縱子開放，而當細胞內(nèi)合成的色氨酸過多時，此操縱子被關(guān)閉。色氨酸操縱子的調(diào)控機制與乳糖操縱子類似，但通常情況下，操縱子處于開放狀態(tài)，其輔阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合而阻遏轉(zhuǎn)錄。而當色氨酸合成過多時，色氨酸作為輔阻遏物與輔阻遏蛋白結(jié)合而形成阻遏蛋白，后者與操縱基因結(jié)合而使基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。（一）弱化子在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列，當操縱子被阻遏時，RNA合成被終止，這段核苷酸起終止轉(zhuǎn)錄信號作用.（四）轉(zhuǎn)錄的弱化作用mRNA轉(zhuǎn)錄的終止是通過前導肽基因的翻譯來調(diào)節(jié)的。在前導肽基因中有兩個相鄰的色氨酸密碼子，故這個前導肽的翻譯必定對tRNATrp的濃度敏感。（五）衰減子的生物學意義活性阻遏物和非活性阻遏物的轉(zhuǎn)變可能較慢，而tRNA負載與否可能更為靈敏；氨基酸的主要用途是合成蛋白質(zhì)，因而以tRNA負載情況為標準來進行控制可能更為恰當.當細胞內(nèi)氨基酸高于某一水平時，可以實現(xiàn)完全的阻遏；而只有低于這一水平時，才需用衰減子這個調(diào)節(jié)系統(tǒng)來進行調(diào)節(jié)，阻遏蛋白和衰減子調(diào)節(jié)機制都是為了避免浪費，提高效率。第七章真核生物基因表達調(diào)控基因表達(geneexpression)--基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。rRNA、tRNA的合成屬于基因表達真核生物基因表達的調(diào)控的水平DNA水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控翻譯水平的調(diào)控翻譯后水平的調(diào)控真核基因組的結(jié)構(gòu)特點1、在真核細胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，不存在原核生物中常見的多基因操縱子形式。2、真核細胞DNA都與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部分DNA是裸露的。3、高等真核細胞DNA中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子。4、真核生物能有序地根據(jù)生長發(fā)育階段的需要進行DNA片段重排，還能在需要時增加細胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。5、在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對較大，一般通過改變整個所控制基因5‘上游區(qū)DNA構(gòu)型來影響它與RNA聚合酶的結(jié)合能力。在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動子上游不遠處，調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點上可直接促進或抑RNA聚合