細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施與基本條件演示文稿

細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施與基本條件演示文稿目前一頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)（優(yōu)選）細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施與基本條件目前二頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室與其他一般實(shí)驗(yàn)室的主要區(qū)別在于，要求保持嚴(yán)格無菌環(huán)境，避免微生物及其他有害因子的影響。一般來講，它應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無菌操作、培養(yǎng)、制備、清洗、消毒滅菌處理和儲(chǔ)藏。

目前三頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)

一般來講，它應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無菌操作、培養(yǎng)、制備、清洗、消毒滅菌處理和儲(chǔ)藏。各區(qū)最好分別設(shè)置于相連的各個(gè)房間，特別是無菌操作室最好能單獨(dú)設(shè)置。如安排在一大實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，則無菌操作區(qū)與清洗、消毒滅菌區(qū)應(yīng)分別位于兩端，而培養(yǎng)、制備和儲(chǔ)藏區(qū)位于此兩區(qū)之間。動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置1.1細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置目前四頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)有其特殊的設(shè)置，如具有光照條件的培養(yǎng)室，試管苗培育所需的溫室和移植馴化室等。植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置目前五頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)基本實(shí)驗(yàn)室1.1清洗間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30~50m2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料等。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置2個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1~2個(gè)洗液缸，專門用于洗滌對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。還應(yīng)配置落水架、干燥箱、超聲波清洗器、純水制備等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。目前六頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)超聲波清洗機(jī)電熱干燥箱純水儀洗瓶機(jī)目前七頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)

主要用于有關(guān)培養(yǎng)用液體、培養(yǎng)基母液和培養(yǎng)基的配制等。

面積60m2左右，配備的主要儀器設(shè)備有：冰箱、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、藥品柜、器械柜、天平、微波爐、pH計(jì)、玻璃棒、燒杯、磁力攪拌器、培養(yǎng)基分裝器、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管（器）、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶等。冰箱以體積180~200L為宜，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液、激素、維生素等貴重藥品、彩色膠卷及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。1.2

制備室目前八頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)pH計(jì)天平移液器目前九頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)

用于培養(yǎng)細(xì)胞所用器械、培養(yǎng)基的消毒與滅菌。

配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過濾設(shè)備、干燥箱、消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號(hào)的滅菌鍋。一般實(shí)驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動(dòng)控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。

如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并成一個(gè)準(zhǔn)備間，要求設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。1.3消毒間目前十頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)目前十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)

無菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯(cuò)開，兩個(gè)門也不要同時(shí)開啟，以保證無菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。

室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)、紫外燈、酒精燈、解剖鏡、各種接種器械等。

1.4無菌操作室目前十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)超凈工作臺(tái)離心機(jī)目前十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣扇。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照時(shí)間及其強(qiáng)度由日光燈和自動(dòng)定時(shí)開關(guān)控制。

培養(yǎng)室應(yīng)配有若干培養(yǎng)架，上面固定日光燈、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。1.5培養(yǎng)室目前十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)目前十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)2、輔助實(shí)驗(yàn)室

2.1鑒定室細(xì)胞學(xué)鑒定室其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等生化分析室在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的生化分析實(shí)驗(yàn)室，以便于對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、天平、PCR儀等目前十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)PCR酶標(biāo)儀顯微鏡目前十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。2.2溫室目前十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)1.2常用儀器與設(shè)備基本設(shè)備：水純化裝置、冰箱、天平、酸度計(jì)、電爐、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器、離心機(jī)及離心管、移液器（管）、吸管等。滅菌設(shè)備：蒸汽壓力滅菌鍋、電熱干燥箱、過濾除菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。無菌操作設(shè)備：超凈工作臺(tái)光溫控制設(shè)備：時(shí)間程序控制器、空調(diào)及溫度感應(yīng)器。目前十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備根據(jù)需要而定，包括培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等。細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備：光學(xué)顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、倒置顯微鏡等。除上述基本設(shè)備外，如果有條件和需要還可配制攝影設(shè)備、生化分析設(shè)備等。培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具：玻璃器皿、新型材料器皿及金屬材質(zhì)用具目前二十頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)超凈工作臺(tái)基本原理：將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的、均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。側(cè)流式（或垂直式）超凈工作臺(tái)：凈化后的空氣氣流由左側(cè)（或右側(cè)）通過工作臺(tái)面流向?qū)?cè)，也有從上向下（或從下向上）流向?qū)?cè)，形成氣流屏障以保持工作區(qū)無菌；在凈化氣流和外邊氣體交界處可因氣流的流動(dòng)出現(xiàn)負(fù)壓，使少許未凈化氣體混入，有發(fā)生污染的可能性外流式（或水平層流式）超凈工作臺(tái)：使凈化后的空氣面向操作者流動(dòng)，外方氣流不致混入操作區(qū)；不能進(jìn)行有害物質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作；因多為開放式，沒有防護(hù)擋板，操作和拿取物品方便，但可能受外界氣流流動(dòng)的影響而引起不潔空氣混入。目前二十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)用于細(xì)胞培養(yǎng)中的有些器械、器皿烘干使用、玻璃器皿干燥消毒溫度范圍：50~300℃實(shí)驗(yàn)室常用：鼓風(fēng)式電熱干燥箱優(yōu)點(diǎn)：溫度均勻、效果較好；缺點(diǎn)：升溫過程較慢注意事項(xiàng)：1、升溫時(shí)不能先升溫后鼓風(fēng)，應(yīng)鼓風(fēng)與升溫同時(shí)開始，至100℃時(shí)停止鼓風(fēng)2、消毒后，不能立即打開箱門以免驟冷而致玻璃器皿損壞，應(yīng)等溫度自然下降至100℃以下時(shí)方可開門3、溫度過高可致包裹玻璃器皿的紙或棉花燒焦，燒焦碎屑影響細(xì)胞的生長電熱干燥箱目前二十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)水純化裝置所有與培養(yǎng)細(xì)胞接觸的液體均需用純水配制；三次蒸餾水冰箱儲(chǔ)存各種溶液和短期保存組織標(biāo)本等；-20℃儲(chǔ)存需冷凍保持生物活性及較長時(shí)期存放的制劑，酶、血清、抗生素、谷氨酰胺等專屬專用，不存放揮發(fā)、易燃等對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)保持清潔目前二十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)壓力蒸汽消毒器直接或間接與細(xì)胞接觸的物品均須消毒滅菌處理內(nèi)熱源侵入式電加熱壓力蒸汽消毒器注意事項(xiàng)：嚴(yán)格按照操作說明執(zhí)行細(xì)胞計(jì)數(shù)板也稱血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性細(xì)胞的觀察電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀自動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)，尤其適用于進(jìn)行細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn)?zāi)壳岸捻揬總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)過濾除菌裝置適用對(duì)象：含維生素、蛋白質(zhì)、多肽、生長因子等物質(zhì)的人工合成培養(yǎng)液、血清、胰蛋白酶等，高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失活Zeiss濾器金屬，直徑142mm和293mm抽濾式（負(fù)壓）：進(jìn)液口與一盛液瓶相連，緩慢使氣體回流，在抽濾瓶與真空抽氣泵之間連一個(gè)負(fù)壓瓶加壓式（正壓）：連一正壓泵或蠕動(dòng)泵的密閉濾器，通N2氣體以造成容器內(nèi)壓力，使濾液濾過，調(diào)整N2壓力不超過19.6kPa；壓力比較恒定，濾過效果好，蛋白質(zhì)不易變性目前二十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)玻璃漏斗式濾器濾板與玻璃漏斗為一體，根據(jù)濾板的孔徑可分為G1~G6幾種規(guī)格，僅G5和G6能達(dá)到濾過除菌的要求適用于各種培養(yǎng)液的過濾除菌，不宜過濾血清等粘稠液體；僅抽濾式，用后清洗麻煩微孔濾膜濾器換膜式濾器和一次性濾器微孔濾膜，孔徑0.1μm（可去除支原體）、0.22μm（除菌效果較保險(xiǎn)）、0.45μm和0.8μm目前二十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)離心機(jī)分離細(xì)胞、調(diào)整細(xì)胞濃度、洗滌、收集細(xì)胞等低速；高速（DNA、RNA提?。⒋笕萘?、控溫離心機(jī)（神經(jīng)細(xì)胞）移液管：玻璃、塑料材質(zhì)；1、2、5、10、20ml吸管移液器：微量移液器、多通道可調(diào)式微量移液器、電動(dòng)移液器離心管：塑料和玻璃材質(zhì)天平目前二十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)

動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的常用儀器設(shè)備有：培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱（適合開放式或半開放式細(xì)胞培養(yǎng)，恒定提供定量CO2，通常使用條件為37℃、5%CO2）顯微操作儀：細(xì)胞核移植、染色體操作、顯微注射、胚胎切割等細(xì)胞融合儀：細(xì)胞融合細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器：程序化冷凍儀、液氮容器（液氮溫度低達(dá)-196℃，防止凍傷；液氮揮發(fā)，定期觀察，補(bǔ)充）培養(yǎng)用器皿手術(shù)器械：解剖、取材、剪切組織及操作時(shí)持取物件目前二十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)培養(yǎng)用器皿透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃：多數(shù)細(xì)胞可生長，易于清洗、消毒，可反復(fù)使用，透明便于觀察；易碎、清洗時(shí)費(fèi)人力無毒、透明光滑的特制塑料：一次性使用，方便；費(fèi)用較高1）培養(yǎng)皿：玻璃或塑料制成，盛取、分離、處理組織或作細(xì)胞毒性、集落形成、單細(xì)胞分離、同位素?fù)饺?、?xì)胞繁殖等實(shí)驗(yàn)，常用規(guī)格3.5cm、6cm、9cm、10cm等2）培養(yǎng)瓶：培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同，形態(tài)各異；細(xì)胞傳代：瓶壁厚薄均勻，瓶口大小一致，口徑一般不小于1cm；規(guī)格有10ml、25ml、50ml、100ml、200ml等；外周血培養(yǎng)常用10ml普通原瓶目前二十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)3）培養(yǎng)板：細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞克隆及各種檢測(cè)；常用規(guī)格有4孔、6孔、12孔、24孔、96孔等4）旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器：用于某些特殊細(xì)胞或需要收獲大量細(xì)胞的培養(yǎng)手術(shù)器械：解剖、取材、剪切組織及操作時(shí)持取物件；手術(shù)刀柄、手術(shù)剪、鑷子、止血鉗、持針器；各種器械至少配備兩套，使用后及時(shí)清洗，做防銹處理；高壓蒸汽消毒或75%酒精浸泡消毒目前三十頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的常用儀器設(shè)備有：光照培養(yǎng)箱：植物材料少量培養(yǎng)；光照、暗箱；調(diào)濕與不可調(diào)濕；人工氣候箱（全自動(dòng)調(diào)溫、調(diào)濕、控光）人工氣候室：模擬自然界的各種氣象條件，精確控制室內(nèi)的溫度、光照、濕度、CO2等，在種子發(fā)芽、植物培養(yǎng)、組培、植保等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛搖床：細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，常用振蕩速度100r/min培養(yǎng)瓶：玻璃三角瓶、試管、光口玻璃瓶；硼硅酸鹽玻璃器皿目前三十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)2.1動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的常用儀器設(shè)備有：

培養(yǎng)箱（恒溫培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱）、顯微操作儀、細(xì)胞融合儀、細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器（程序化冷凍儀和液氮容器）、培養(yǎng)用器皿、手術(shù)器械2.2

植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的常用儀器設(shè)備有：

光照培養(yǎng)箱、人工氣候箱、搖床和培養(yǎng)瓶目前三十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)第2章清洗與消毒

離體培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都十分敏感，微生物、細(xì)胞碎片以及非營養(yǎng)性化學(xué)成分都可能影響細(xì)胞的生長，對(duì)培養(yǎng)器皿清洗與消毒的要求極為苛刻。因此，清洗和消毒是否徹底直接關(guān)系到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。掌握清洗、消毒知識(shí)，學(xué)會(huì)清洗、消毒方法是細(xì)胞培養(yǎng)工作的基本功。

目前三十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)洗滌液的配制一、清洗目前三十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸和沖洗

清洗后的玻璃器皿要求干凈、透明、無油跡，且無任何殘留物質(zhì)新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于4h），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。使用過玻璃器皿：先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計(jì)量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。目前三十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)膠塞清洗

新購置的瓶塞帶有滑石粉及雜質(zhì)。方法：先用自來水沖洗；每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH（洗衣粉）煮沸10~20min；自來水沖洗后，1%稀鹽酸浸泡30min，或蒸餾水沖洗后再煮沸10~20min，晾干備用。目前三十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，無毒、特殊包裝優(yōu)點(diǎn)在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用越來越廣泛。第一次使用塑料器皿時(shí)，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH=1）清洗，接著依次用無離子水、1mol/LKOH和無離子水清洗，然后用10-3mol/LEDTA除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。

使用過程中，注意：防止劃痕；用后及時(shí)浸泡塑料器皿的清洗目前三十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

金屬用品洗滌除菌過濾器洗滌

用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。包裝便于消毒、儲(chǔ)存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染目前三十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十九點(diǎn)滅菌工作是極其重要的。對(duì)于初學(xué)者來說，首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念

有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超凈工作臺(tái)臺(tái)面，未處理的工具和手等。

無菌的范疇：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等）

物理或化學(xué)處理；火烤后的物體；

健康的動(dòng)植物不與外部表面接觸的組織內(nèi)部可能是無菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）二、消毒