臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控方法課件

臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控方法衛(wèi)生部臨床檢驗中心李金明1精選ppt臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控方法衛(wèi)生部臨床檢驗中心李金明1存在的問題概念不清不知道具體怎么做不會寫室內(nèi)質(zhì)控的SOP不知道如何選擇室內(nèi)質(zhì)控物不會分析室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果2精選ppt存在的問題概念不清2精選ppt室內(nèi)質(zhì)控SOP存在的問題責(zé)任人不清。質(zhì)控物的來源及濃度不清或不全，并且通常沒有說明陰性質(zhì)控物的來源。有些是自制，但制備方法不規(guī)范，沒有任何的質(zhì)量檢驗，定量結(jié)果沒有溯源性。沒有明確所選用的質(zhì)控方法。對前20次的測定的室內(nèi)質(zhì)控沒有解決方法。沒有明確的失控判斷標(biāo)準(zhǔn)，只是做了一些失控的含糊敘述。并且一般都沒有陰性失控的判斷方法。沒有失控后的分析及處理措施。3精選ppt室內(nèi)質(zhì)控SOP存在的問題責(zé)任人不清。3精選ppt室內(nèi)質(zhì)量控制（InternalQualityControl,IQC)的概念由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作?？筛爬?(1)執(zhí)行者：實驗室技術(shù)人員；(2)目的：監(jiān)測實驗室測定的重復(fù)性；(3)功能：決定了當(dāng)批測定的有效性，報告可否發(fā)出。是對實驗室測定的即時性評價。

4精選ppt室內(nèi)質(zhì)量控制（InternalQualityContro室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的基本內(nèi)容主要包括三個方面：（1）測定前的質(zhì)量控制；（2）統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制；（3）質(zhì)量控制的評價。5精選ppt室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的基本內(nèi)容主要包括三個方面：5精選pp測定前的質(zhì)量控制實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理理想的試劑和操作方法人員培訓(xùn)

6精選ppt測定前的質(zhì)量控制實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理6精選ppt實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理實驗室空間及工作流程的設(shè)計實驗室環(huán)境條件的控制：溫濕度控制設(shè)備、穩(wěn)壓或不間斷電源7精選ppt實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理實驗室空間及工作流程的設(shè)計7精選p理想的PCR實驗室設(shè)計A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)8精選ppt理想的PCR實驗室設(shè)計A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)理想的PCR實驗室設(shè)計B9精選ppt產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間臨床PCR實驗室設(shè)計的一般原則各區(qū)獨立注意風(fēng)向因地制宜方便工作“十六字口訣”10精選ppt臨床PCR實驗室設(shè)計的一般原則各區(qū)獨立“十六字口訣”10精選產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗11精選ppt產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間臨床PCR實驗室質(zhì)量管理的特點

“無基因”概念實驗室要有嚴(yán)格的人員進入限制和程序使用合格的試劑和消耗品12精選ppt臨床PCR實驗室質(zhì)量管理的特點“無基因”概念12精選ppPCR實驗室“污染”的主要來源臨床標(biāo)本中存在的大量待測微生物科研中得到的質(zhì)?？寺∫郧胺治鲅芯康奶囟ㄎ⑸锎罅看嬖谟趯嶒灜h(huán)境中的特定微生物以前擴增產(chǎn)物的殘留污染。這也是PCR實驗室最容易產(chǎn)生的將造成假陽性的“污染”。

13精選pptPCR實驗室“污染”的主要來源臨床標(biāo)本中存在的大量待測微生物PCR實驗室的重要防“污染”措施實驗室的嚴(yán)格分區(qū)及工作程序的嚴(yán)格遵守

化學(xué)方法：實驗臺面可使用10％的次氯酸鈉（漂白劑）清洗；有些物品比如放置擴增反應(yīng)管的盤必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時，在轉(zhuǎn)回之前，應(yīng)將其置于2％~10％的次氯酸鈉溶液中過夜，并充分沖洗。紫外照射：實驗臺面、儀器設(shè)備、實驗室空間UNG14精選pptPCR實驗室的重要防“污染”措施實驗室的嚴(yán)格分區(qū)及工作程序的儀器設(shè)備及管理PCR儀、離心機、加樣器、恒溫設(shè)備等應(yīng)建立技術(shù)檔案，并定期維護;PCR儀、加樣器、恒溫設(shè)備應(yīng)定期進行校準(zhǔn)15精選ppt儀器設(shè)備及管理15精選ppt理想的試劑:試劑的質(zhì)檢核酸提取或標(biāo)本處理方法的抗干擾能力（能否有效地去掉PCR抑制物）測定下限(Detectionlimit)（定性測定）測定準(zhǔn)確性和線性范圍批內(nèi)變異和批間變異試劑批間的一致性有否污染其他：外包裝、試劑的完整性、有效期、說明書等16精選ppt理想的試劑:試劑的質(zhì)檢核酸提取或標(biāo)本處理方法的抗干擾能力（能理想的操作方法按照試劑盒說明書操作即可嗎?操作中影響測定結(jié)果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)寫出具有可操作性的SOP17精選ppt理想的操作方法17精選ppt人員培訓(xùn)培訓(xùn)所涉及的范圍:儀器設(shè)備使用、維護和校準(zhǔn)；試劑、方法原理；質(zhì)量管理體系；相關(guān)法律法規(guī)、相關(guān)領(lǐng)域的新技術(shù)、新理念和新進展；實驗操作技能等。如何培訓(xùn)：講座、討論、自學(xué)和參加培訓(xùn)班等。培訓(xùn)的評估：書面考試、實驗考核、討論心得、論文、綜述等。18精選ppt人員培訓(xùn)培訓(xùn)所涉及的范圍:儀器設(shè)備使用、維護和校準(zhǔn)；試劑、方統(tǒng)計質(zhì)控方法質(zhì)控物濃度的選擇每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置質(zhì)控規(guī)則Levey-Jennings質(zhì)控圖方法“即刻法”質(zhì)控方法“假陽性”的統(tǒng)計質(zhì)控方法19精選ppt統(tǒng)計質(zhì)控方法質(zhì)控物濃度的選擇19精選ppt質(zhì)控物濃度的選擇定量測定：測定線性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度定性測定：接近方法測定下限的濃度陰性質(zhì)控物20精選ppt質(zhì)控物濃度的選擇定量測定：測定線性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置標(biāo)本數(shù)量如小于30，弱陽性和陰性質(zhì)控各1份，標(biāo)本數(shù)量增加，質(zhì)控物數(shù)量相應(yīng)按比例增加均勻分散于臨床標(biāo)本中，與臨床標(biāo)本一同處理（核酸提?。U增時的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。但在擴增儀中的位置，不應(yīng)永久性的固定的在一個孔，而應(yīng)在每次擴增檢測時，進行相應(yīng)的順延，以使在一定的時間內(nèi)，可以盡可能的監(jiān)測每一個孔的擴增有效性。21精選ppt每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置標(biāo)本數(shù)量如小于30，弱陽性和陰性質(zhì)控樣本的種類陰性原血清樣本實驗過程中帶入的空管僅含擴增反應(yīng)混合液的管22精選ppt陰性質(zhì)控樣本的種類陰性原血清樣本22精選ppt陰性原血清樣本的功能監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的“污染”由實驗操作所致的標(biāo)本間的交叉污染。具體地說，如強陽性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染、強陽性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫孵育時蓋子崩開等擴增反應(yīng)試劑的污染。

23精選ppt陰性原血清樣本的功能監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的“污染”23精核酸提取過程中帶入的空管監(jiān)測核酸提取過程中的實驗室“污染”的存在（在整個實驗過程中，開口放置于核酸提取的操作臺面區(qū)域內(nèi)，最后以水為基質(zhì)，進行擴增）24精選ppt核酸提取過程中帶入的空管監(jiān)測核酸提取過程中的實驗室“污染”的僅含擴增反應(yīng)混合液的管監(jiān)測試劑的“污染”25精選ppt僅含擴增反應(yīng)混合液的管監(jiān)測試劑的“污染”25精選ppt質(zhì)控規(guī)則的表達方式及定義

質(zhì)控規(guī)則的表達方式質(zhì)控規(guī)則的功能常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義

26精選ppt質(zhì)控規(guī)則的表達方式及定義質(zhì)控規(guī)則的表達方式26精選ppt質(zhì)控規(guī)則的表達方式通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控測定中超出質(zhì)量控制限的測定值的個數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值±1～3SD來表示。當(dāng)質(zhì)控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值±3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測定值中，如果有一個測定值超出均值±3s范圍，即可將該批測定判為失控。27精選ppt質(zhì)控規(guī)則的表達方式通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控質(zhì)控規(guī)則的功能

簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控。28精選ppt質(zhì)控規(guī)則的功能簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控。2常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義

符號

定義12S一個質(zhì)控測定值超出±2s控制限。13S一個質(zhì)控測定值超出±3s控制限。22S兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或－2s控制限。R4S同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的差值超出4s控制限。41S四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或－1s控制限。7T七個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變化。10X十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（）的同一側(cè)。29精選ppt常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義符號Levey-Jennings質(zhì)控圖方法也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質(zhì)量控制。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。30精選pptLevey-Jennings質(zhì)控圖方法也稱Shewhart質(zhì)質(zhì)控圖31精選ppt質(zhì)控圖31精選ppt32精選ppt32精選pptLevey-Jennings質(zhì)控圖

基本的統(tǒng)計學(xué)含義穩(wěn)定條件下，在20個IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個。如以±3s為失控限，假失控的概率為0.3%。33精選pptLevey-Jennings質(zhì)控圖

基本的統(tǒng)計學(xué)含義穩(wěn)定條件“即刻法”質(zhì)控方法“即刻法”質(zhì)控方法的實質(zhì)是一種統(tǒng)計學(xué)方法，即Grubs異常值取舍法；只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。34精選ppt“即刻法”質(zhì)控方法“即刻法”質(zhì)控方法的實質(zhì)是一種統(tǒng)計學(xué)方法，“假陽性”的統(tǒng)計學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法基于日常檢驗的陽性率比值(呈正態(tài)分布)直接概率計算方法（不呈正態(tài)分布）35精選ppt“假陽性”的統(tǒng)計學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法基于日常檢驗的陽性率比值(呈正基于日常檢驗的陽性率比值半Levey-Jennings質(zhì)控圖法36精選ppt基于日常檢驗的陽性率比值半Levey-Jennings質(zhì)控圖質(zhì)控規(guī)則當(dāng)陰性質(zhì)控樣本為陽性時,不管陽性率測定比值為何，均為失控，所有陽性標(biāo)本須重新測定，并增加一倍陰性質(zhì)控樣本。如果陰性質(zhì)控樣本為陰性，某次測定陽性比值超出+3SD,則為失控,為1+3S規(guī)則。本次結(jié)果陰性結(jié)果根據(jù)陽性質(zhì)控樣本的情況,決定是否可以發(fā)出,所有陽性樣本結(jié)果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽性率增高的原因，并在增加一倍陰性質(zhì)控樣本的情況下重新檢測。37精選ppt質(zhì)控規(guī)則當(dāng)陰性質(zhì)控樣本為陽性時,不管陽性率測定比值為何，均為可能的幾種失控表現(xiàn)

曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由于某一天操作上的失誤導(dǎo)致實驗室被污染如標(biāo)本泄漏，產(chǎn)物泄漏，試劑被污染等向上的趨勢性變化：可能存在累積性的產(chǎn)物污染，實驗室擴增產(chǎn)物逐漸累積，從而使病人結(jié)果的陽性率逐漸增高。此時實驗室需要進行徹底清潔。38精選ppt可能的幾種失控表現(xiàn)曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由直接概率計算法按統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。當(dāng)一個小概率事件發(fā)生時，則可能有誤差存在，有必要對其發(fā)生的原因進行分析。對每天的日常病人結(jié)果中陽性率出現(xiàn)的概率進行計算，如果這種結(jié)果出現(xiàn)的概率小于5%時，則可判為失控。39精選ppt直接概率計算法按統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為根據(jù)二項式分布的概率計算在一個實驗室中某檢測項目結(jié)果的陽性率為p,計算在n個血液樣本中有k個陽性結(jié)果的概率。根據(jù)二項式分布的概率計算公式如下：P(X=k)=n!/[k!(n-k)!]pk(1-p)n-k(1)其中n為當(dāng)次實驗檢測標(biāo)本數(shù)，k為陽性個數(shù)，p為陽性率。P(X=k)5%為失控。此時，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。40精選ppt根據(jù)二項式分布的概率計算在一個實驗室中某檢測項目結(jié)果的陽性率根據(jù)二項式分布的概率計算如果一個實驗室檢測HBVDNA，平常病人結(jié)果的陽性率為10%，即p=0.1,在某一次檢測25個樣本出現(xiàn)6個陽性結(jié)果，19個陰性結(jié)果，則檢測過程中是存在污染的可能性可通過下述方法計算。即計算在25個樣本中出現(xiàn)6個或6個以上陽性結(jié)果的概率，此時的概率為1-（獲得0個或1個或2個或3個或4個或多5個陽性結(jié)果的概率）即：1-[P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)]=1-[(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15]=0.0334則在這個實驗室一次檢測25個標(biāo)本獲得6個或6個以上陽性結(jié)果的概率為3.34%，小于5%，屬于小概率事件，即發(fā)生的可能性很小，可能有污染所致假陽性結(jié)果的可能。41精選ppt根據(jù)二項式分布的概率計算如果一個實驗室檢測HBVDNA，平根據(jù)泊松分布的概率計算在血液篩查檢測中，許多實驗室或檢測項目如HCVRNA、CT、結(jié)核桿菌、淋球菌的陽性結(jié)果率均較低，這時雖然可以使用公式（1）計算概率，但如果標(biāo)本量很大，使用泊松分布來估計二項式分布是一種更為簡便的方法。。根據(jù)泊松分布，可使用下式計算概率：P(X=k)=(np)ke-np/k!(2)

P(X=k)5%為失控。此時，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。42精選ppt根據(jù)泊松分布的概率計算在血液篩查檢測中，許多實驗室或檢測項目根據(jù)泊松分布的概率計算一個實驗室中，某項目每次檢測結(jié)果的陽性率約為2%，則在100個樣本中出現(xiàn)8個陽性結(jié)果的概率。根據(jù)泊松分布，可使用公式（2）計算概率，此時n=100,p=0.02,k=8,np=2代入公式（2）計算得P(X=10)=28e-2/8!=0.0009。43精選ppt根據(jù)泊松分布的概率計算一個實驗室中，某項目每次檢測結(jié)果的陽性標(biāo)本間交叉污染的概率計算如果所有陽性結(jié)果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則可能存在標(biāo)本間的交叉污染，即陽性樣本污染了它鄰近的陰性樣本，這種情況的概率計算公式如下：P=(n-r+1)/[n!/r!(n-r)!]（3）其中n為當(dāng)次實驗檢測標(biāo)本數(shù)，r為連續(xù)出現(xiàn)陽性的個數(shù)。當(dāng)某次實際測定標(biāo)本連續(xù)陽性的概率大于所計算的概率，則判為失控。陰性標(biāo)本結(jié)果可以發(fā)出，陽性標(biāo)本要考慮標(biāo)本間交叉污染的問題。44精選ppt標(biāo)本間交叉污染的概率計算如果所有陽性結(jié)果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則標(biāo)本間交叉污染的概率計算如在一次檢測100個標(biāo)本的HBVDNA檢測中，所有兩個陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為：P=(100-2+1)/[100!/2!(100-2)!]=99/4950=0.02概率為2.0%。

因此，如在100個標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)兩個為陽性次數(shù)有3次，即概率為3.0%，則為失控。而在一次檢測100個標(biāo)本，所有三個陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為：P=(100-3+1)/[100!/3!(100-3)!]=98/161700=0.0006概率為0.06%。

因此，如果如在100個標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)三個為陽性次數(shù)有1次，即概率為1.0%，為失控。45精選ppt標(biāo)本間交叉污染的概率計算如在一次檢測100個標(biāo)本的HBVD室內(nèi)質(zhì)量控制的評價IQC是一個集體活動，不光是對實驗室一次測定的有效性的判斷，也反應(yīng)了實驗室測定趨勢的變化。IQC的失控不能做為處罰的依據(jù)，應(yīng)建設(shè)性的找出失控的原因，針對其采取措施加以改進。對IQC應(yīng)定期進行評價。46精選ppt室內(nèi)質(zhì)量控制的評價IQC是一個集體活動，不光是對實驗室一次測陽性質(zhì)控樣本失控的常見原因核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴增抑制物的殘留、所用耗材如離心管有PCR抑制物等。儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。47精選ppt陽性質(zhì)控樣本失控的常見原因核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中陽性質(zhì)控樣本測定結(jié)果偏低或為陰性結(jié)果偏低陰性臨床標(biāo)本中無強陽性臨床標(biāo)本中有較強陽性臨床標(biāo)本中有陽性臨床標(biāo)本全為陰性觀察臨床標(biāo)本情況所用離心管含抑制物Taq酶活性降低核酸提取試劑效率低更換進口離心管更換Taq酶再檢測更換核酸提取試劑所有標(biāo)本重新檢測核酸提取中靶核酸丟失核酸提取中抑抑物殘留核酸提取試劑混入擴增儀孔間溫度差異隨機誤差檢測質(zhì)控樣本及3~5份已知陽性樣本質(zhì)控樣本測定正常且陽性樣本有些值增加質(zhì)控及已知陽性樣本測定仍異常按系統(tǒng)誤差途徑分析重新提取或已知濃度DNA在同一孔內(nèi)擴增結(jié)果正常結(jié)果仍低進行擴增儀孔溫度校準(zhǔn)后再檢測Taq酶或逆轉(zhuǎn)錄酶失活48精選ppt陽性質(zhì)控樣本測定結(jié)果偏低或為陰性結(jié)果偏低陰性臨床標(biāo)本中無強陽避免假陰性的措施純化核酸標(biāo)本重復(fù)雙份測定稀釋標(biāo)本使用“內(nèi)質(zhì)控”（InternalControl,IC)49精選ppt避免假陰性的措施純化核酸49精選ppt陰性質(zhì)控樣本的常見失控原因

擴增產(chǎn)物的“污染”臨床標(biāo)本的核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉“污染”50精選ppt陰性質(zhì)控樣本的常見失控原因擴增產(chǎn)物的“污染”50精選ppt陰性質(zhì)控樣本測定為陽性臨床標(biāo)本亦全為陽性臨床標(biāo)本中有陽性也有陰性擴增產(chǎn)物“污染”試劑“污染”同時檢測的標(biāo)本情況擴增產(chǎn)物輕度“污染”標(biāo)本間交叉“污染”3~5空管室內(nèi)靜置5~8份水樣本檢測試劑直接擴增檢測驗證驗證5~8份水樣本檢測暫停日常檢驗，實驗室清潔、通風(fēng)更換試劑措施有陽性，則確認(rèn)有實驗室“污染”無陽性，說明為標(biāo)本交叉“污染”改善操作措施51精選ppt陰性質(zhì)控樣本測定為陽性臨床標(biāo)本亦全為陽性臨床標(biāo)本中有陽性也有避免PCR檢驗假陽性結(jié)果的措施嚴(yán)格的實驗室分區(qū)使用帶“濾芯”的吸頭設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時處理）使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑臨床“假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌、淋球菌等經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測。52精選ppt避免PCR檢驗假陽性結(jié)果的措施嚴(yán)格的實驗室分區(qū)52精選pptIQC的局限性IQC可能測不出的誤差

測定前

測定中

測定后

樣本鑒定不對樣本吸取不對結(jié)果記錄錯誤

樣本貯存中變質(zhì)試劑加入不對此類誤差的發(fā)生率在不同的實驗室有所不同，一般要求小于

0.1%，且應(yīng)均衡地分布于測定前、測定中和測定后的不同階段。

53精選pptIQC的局限性IQC可能測不出的誤差53精選ppt謝謝！54精選ppt謝謝！54精選ppt此課件下載可自行編輯修改，供參考！感謝您的支持，我們努力做得更好！此課件下載可自行編輯修改，供參考！臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控方法衛(wèi)生部臨床檢驗中心李金明56精選ppt臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控方法衛(wèi)生部臨床檢驗中心李金明1存在的問題概念不清不知道具體怎么做不會寫室內(nèi)質(zhì)控的SOP不知道如何選擇室內(nèi)質(zhì)控物不會分析室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果57精選ppt存在的問題概念不清2精選ppt室內(nèi)質(zhì)控SOP存在的問題責(zé)任人不清。質(zhì)控物的來源及濃度不清或不全，并且通常沒有說明陰性質(zhì)控物的來源。有些是自制，但制備方法不規(guī)范，沒有任何的質(zhì)量檢驗，定量結(jié)果沒有溯源性。沒有明確所選用的質(zhì)控方法。對前20次的測定的室內(nèi)質(zhì)控沒有解決方法。沒有明確的失控判斷標(biāo)準(zhǔn)，只是做了一些失控的含糊敘述。并且一般都沒有陰性失控的判斷方法。沒有失控后的分析及處理措施。58精選ppt室內(nèi)質(zhì)控SOP存在的問題責(zé)任人不清。3精選ppt室內(nèi)質(zhì)量控制（InternalQualityControl,IQC)的概念由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作。可概括為:(1)執(zhí)行者：實驗室技術(shù)人員；(2)目的：監(jiān)測實驗室測定的重復(fù)性；(3)功能：決定了當(dāng)批測定的有效性，報告可否發(fā)出。是對實驗室測定的即時性評價。

59精選ppt室內(nèi)質(zhì)量控制（InternalQualityContro室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的基本內(nèi)容主要包括三個方面：（1）測定前的質(zhì)量控制；（2）統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制；（3）質(zhì)量控制的評價。60精選ppt室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的基本內(nèi)容主要包括三個方面：5精選pp測定前的質(zhì)量控制實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理理想的試劑和操作方法人員培訓(xùn)

61精選ppt測定前的質(zhì)量控制實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理6精選ppt實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理實驗室空間及工作流程的設(shè)計實驗室環(huán)境條件的控制：溫濕度控制設(shè)備、穩(wěn)壓或不間斷電源62精選ppt實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理實驗室空間及工作流程的設(shè)計7精選p理想的PCR實驗室設(shè)計A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)63精選ppt理想的PCR實驗室設(shè)計A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)理想的PCR實驗室設(shè)計B64精選ppt產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間臨床PCR實驗室設(shè)計的一般原則各區(qū)獨立注意風(fēng)向因地制宜方便工作“十六字口訣”65精選ppt臨床PCR實驗室設(shè)計的一般原則各區(qū)獨立“十六字口訣”10精選產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗66精選ppt產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間臨床PCR實驗室質(zhì)量管理的特點

“無基因”概念實驗室要有嚴(yán)格的人員進入限制和程序使用合格的試劑和消耗品67精選ppt臨床PCR實驗室質(zhì)量管理的特點“無基因”概念12精選ppPCR實驗室“污染”的主要來源臨床標(biāo)本中存在的大量待測微生物科研中得到的質(zhì)粒克隆以前分析研究的特定微生物大量存在于實驗環(huán)境中的特定微生物以前擴增產(chǎn)物的殘留污染。這也是PCR實驗室最容易產(chǎn)生的將造成假陽性的“污染”。

68精選pptPCR實驗室“污染”的主要來源臨床標(biāo)本中存在的大量待測微生物PCR實驗室的重要防“污染”措施實驗室的嚴(yán)格分區(qū)及工作程序的嚴(yán)格遵守

化學(xué)方法：實驗臺面可使用10％的次氯酸鈉（漂白劑）清洗；有些物品比如放置擴增反應(yīng)管的盤必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時，在轉(zhuǎn)回之前，應(yīng)將其置于2％~10％的次氯酸鈉溶液中過夜，并充分沖洗。紫外照射：實驗臺面、儀器設(shè)備、實驗室空間UNG69精選pptPCR實驗室的重要防“污染”措施實驗室的嚴(yán)格分區(qū)及工作程序的儀器設(shè)備及管理PCR儀、離心機、加樣器、恒溫設(shè)備等應(yīng)建立技術(shù)檔案，并定期維護;PCR儀、加樣器、恒溫設(shè)備應(yīng)定期進行校準(zhǔn)70精選ppt儀器設(shè)備及管理15精選ppt理想的試劑:試劑的質(zhì)檢核酸提取或標(biāo)本處理方法的抗干擾能力（能否有效地去掉PCR抑制物）測定下限(Detectionlimit)（定性測定）測定準(zhǔn)確性和線性范圍批內(nèi)變異和批間變異試劑批間的一致性有否污染其他：外包裝、試劑的完整性、有效期、說明書等71精選ppt理想的試劑:試劑的質(zhì)檢核酸提取或標(biāo)本處理方法的抗干擾能力（能理想的操作方法按照試劑盒說明書操作即可嗎?操作中影響測定結(jié)果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)寫出具有可操作性的SOP72精選ppt理想的操作方法17精選ppt人員培訓(xùn)培訓(xùn)所涉及的范圍:儀器設(shè)備使用、維護和校準(zhǔn)；試劑、方法原理；質(zhì)量管理體系；相關(guān)法律法規(guī)、相關(guān)領(lǐng)域的新技術(shù)、新理念和新進展；實驗操作技能等。如何培訓(xùn)：講座、討論、自學(xué)和參加培訓(xùn)班等。培訓(xùn)的評估：書面考試、實驗考核、討論心得、論文、綜述等。73精選ppt人員培訓(xùn)培訓(xùn)所涉及的范圍:儀器設(shè)備使用、維護和校準(zhǔn)；試劑、方統(tǒng)計質(zhì)控方法質(zhì)控物濃度的選擇每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置質(zhì)控規(guī)則Levey-Jennings質(zhì)控圖方法“即刻法”質(zhì)控方法“假陽性”的統(tǒng)計質(zhì)控方法74精選ppt統(tǒng)計質(zhì)控方法質(zhì)控物濃度的選擇19精選ppt質(zhì)控物濃度的選擇定量測定：測定線性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度定性測定：接近方法測定下限的濃度陰性質(zhì)控物75精選ppt質(zhì)控物濃度的選擇定量測定：測定線性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置標(biāo)本數(shù)量如小于30，弱陽性和陰性質(zhì)控各1份，標(biāo)本數(shù)量增加，質(zhì)控物數(shù)量相應(yīng)按比例增加均勻分散于臨床標(biāo)本中，與臨床標(biāo)本一同處理（核酸提?。U增時的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。但在擴增儀中的位置，不應(yīng)永久性的固定的在一個孔，而應(yīng)在每次擴增檢測時，進行相應(yīng)的順延，以使在一定的時間內(nèi)，可以盡可能的監(jiān)測每一個孔的擴增有效性。76精選ppt每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置標(biāo)本數(shù)量如小于30，弱陽性和陰性質(zhì)控樣本的種類陰性原血清樣本實驗過程中帶入的空管僅含擴增反應(yīng)混合液的管77精選ppt陰性質(zhì)控樣本的種類陰性原血清樣本22精選ppt陰性原血清樣本的功能監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的“污染”由實驗操作所致的標(biāo)本間的交叉污染。具體地說，如強陽性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染、強陽性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫孵育時蓋子崩開等擴增反應(yīng)試劑的污染。

78精選ppt陰性原血清樣本的功能監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的“污染”23精核酸提取過程中帶入的空管監(jiān)測核酸提取過程中的實驗室“污染”的存在（在整個實驗過程中，開口放置于核酸提取的操作臺面區(qū)域內(nèi)，最后以水為基質(zhì)，進行擴增）79精選ppt核酸提取過程中帶入的空管監(jiān)測核酸提取過程中的實驗室“污染”的僅含擴增反應(yīng)混合液的管監(jiān)測試劑的“污染”80精選ppt僅含擴增反應(yīng)混合液的管監(jiān)測試劑的“污染”25精選ppt質(zhì)控規(guī)則的表達方式及定義

質(zhì)控規(guī)則的表達方式質(zhì)控規(guī)則的功能常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義

81精選ppt質(zhì)控規(guī)則的表達方式及定義質(zhì)控規(guī)則的表達方式26精選ppt質(zhì)控規(guī)則的表達方式通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控測定中超出質(zhì)量控制限的測定值的個數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值±1～3SD來表示。當(dāng)質(zhì)控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值±3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測定值中，如果有一個測定值超出均值±3s范圍，即可將該批測定判為失控。82精選ppt質(zhì)控規(guī)則的表達方式通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控質(zhì)控規(guī)則的功能

簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控。83精選ppt質(zhì)控規(guī)則的功能簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控。2常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義

符號

定義12S一個質(zhì)控測定值超出±2s控制限。13S一個質(zhì)控測定值超出±3s控制限。22S兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或－2s控制限。R4S同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的差值超出4s控制限。41S四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或－1s控制限。7T七個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變化。10X十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（）的同一側(cè)。84精選ppt常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義符號Levey-Jennings質(zhì)控圖方法也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質(zhì)量控制。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。85精選pptLevey-Jennings質(zhì)控圖方法也稱Shewhart質(zhì)質(zhì)控圖86精選ppt質(zhì)控圖31精選ppt87精選ppt32精選pptLevey-Jennings質(zhì)控圖

基本的統(tǒng)計學(xué)含義穩(wěn)定條件下，在20個IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個。如以±3s為失控限，假失控的概率為0.3%。88精選pptLevey-Jennings質(zhì)控圖

基本的統(tǒng)計學(xué)含義穩(wěn)定條件“即刻法”質(zhì)控方法“即刻法”質(zhì)控方法的實質(zhì)是一種統(tǒng)計學(xué)方法，即Grubs異常值取舍法；只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。89精選ppt“即刻法”質(zhì)控方法“即刻法”質(zhì)控方法的實質(zhì)是一種統(tǒng)計學(xué)方法，“假陽性”的統(tǒng)計學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法基于日常檢驗的陽性率比值(呈正態(tài)分布)直接概率計算方法（不呈正態(tài)分布）90精選ppt“假陽性”的統(tǒng)計學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法基于日常檢驗的陽性率比值(呈正基于日常檢驗的陽性率比值半Levey-Jennings質(zhì)控圖法91精選ppt基于日常檢驗的陽性率比值半Levey-Jennings質(zhì)控圖質(zhì)控規(guī)則當(dāng)陰性質(zhì)控樣本為陽性時,不管陽性率測定比值為何，均為失控，所有陽性標(biāo)本須重新測定，并增加一倍陰性質(zhì)控樣本。如果陰性質(zhì)控樣本為陰性，某次測定陽性比值超出+3SD,則為失控,為1+3S規(guī)則。本次結(jié)果陰性結(jié)果根據(jù)陽性質(zhì)控樣本的情況,決定是否可以發(fā)出,所有陽性樣本結(jié)果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽性率增高的原因，并在增加一倍陰性質(zhì)控樣本的情況下重新檢測。92精選ppt質(zhì)控規(guī)則當(dāng)陰性質(zhì)控樣本為陽性時,不管陽性率測定比值為何，均為可能的幾種失控表現(xiàn)

曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由于某一天操作上的失誤導(dǎo)致實驗室被污染如標(biāo)本泄漏，產(chǎn)物泄漏，試劑被污染等向上的趨勢性變化：可能存在累積性的產(chǎn)物污染，實驗室擴增產(chǎn)物逐漸累積，從而使病人結(jié)果的陽性率逐漸增高。此時實驗室需要進行徹底清潔。93精選ppt可能的幾種失控表現(xiàn)曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由直接概率計算法按統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。當(dāng)一個小概率事件發(fā)生時，則可能有誤差存在，有必要對其發(fā)生的原因進行分析。對每天的日常病人結(jié)果中陽性率出現(xiàn)的概率進行計算，如果這種結(jié)果出現(xiàn)的概率小于5%時，則可判為失控。94精選ppt直接概率計算法按統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為根據(jù)二項式分布的概率計算在一個實驗室中某檢測項目結(jié)果的陽性率為p,計算在n個血液樣本中有k個陽性結(jié)果的概率。根據(jù)二項式分布的概率計算公式如下：P(X=k)=n!/[k!(n-k)!]pk(1-p)n-k(1)其中n為當(dāng)次實驗檢測標(biāo)本數(shù)，k為陽性個數(shù)，p為陽性率。P(X=k)5%為失控。此時，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。95精選ppt根據(jù)二項式分布的概率計算在一個實驗室中某檢測項目結(jié)果的陽性率根據(jù)二項式分布的概率計算如果一個實驗室檢測HBVDNA，平常病人結(jié)果的陽性率為10%，即p=0.1,在某一次檢測25個樣本出現(xiàn)6個陽性結(jié)果，19個陰性結(jié)果，則檢測過程中是存在污染的可能性可通過下述方法計算。即計算在25個樣本中出現(xiàn)6個或6個以上陽性結(jié)果的概率，此時的概率為1-（獲得0個或1個或2個或3個或4個或多5個陽性結(jié)果的概率）即：1-[P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)]=1-[(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15]=0.0334則在這個實驗室一次檢測25個標(biāo)本獲得6個或6個以上陽性結(jié)果的概率為3.34%，小于5%，屬于小概率事件，即發(fā)生的可能性很小，可能有污染所致假陽性結(jié)果的可能。96精選ppt根據(jù)二項式分布的概率計算如果一個實驗室檢測HBVDNA，平根據(jù)泊松分布的概率計算在血液篩查檢測中，許多實驗室或檢測項目如HCVRNA、CT、結(jié)核桿菌、淋球菌的陽性結(jié)果率均較低，這時雖然可以使用公式（1）計算概率，但如果標(biāo)本量很大，使用泊松分布來估計二項式分布是一種更為簡便的方法。。根據(jù)泊松分布，可使用下式計算概率：P(X=k)=(np)ke-np/k!(2)

P(X=k)5%為失控。此時，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。97精選ppt根據(jù)泊松分布的概率計算在血液篩查檢測中，許多實驗室或檢測項目根據(jù)泊松分布的概率計算一個實驗室中，某項目每次檢測結(jié)果的陽性率約為2%，則在100個樣本中出現(xiàn)8個陽性結(jié)果的概率。根據(jù)泊松分布，可使用公式（2）計算概率，此時n=100,p=0.02,k=8,np=2代入公式（2）計算得P(X=10)=28e-2/8!=0.0009。98精選ppt根據(jù)泊松分布的概率計算一個實驗室中，某項目每次檢測結(jié)果的陽性標(biāo)本間交叉污染的概率計算如果所有陽性結(jié)果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則可能存在標(biāo)本間的交叉污染，即陽性樣本污染了它鄰近的陰性樣本，這種情況的概率計算公式如下：P=(n-r+1)/[n!/r!(n-r)!]（3）其中n為當(dāng)次實驗檢測標(biāo)本數(shù)，r為連續(xù)出現(xiàn)陽性的個數(shù)。當(dāng)某次實際測定標(biāo)本連續(xù)陽性的概率大于所計算的概率，則判為失控。陰性標(biāo)本結(jié)果可以發(fā)出，陽性標(biāo)本要考慮標(biāo)本間交叉污染的問題。99精選ppt標(biāo)本間交叉污染的概率計算如果所有陽性結(jié)果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則標(biāo)本間交叉污染的概率計算如在一次檢測100個標(biāo)本的HBVDNA檢測中，所有兩個陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為：P=(100-2+1)/[100!/2!(100-2)!]=99/4950=0.02概率為2.0%。

因此，如在100個標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)兩個為陽性次數(shù)有3次，即概率為3.0%，則為失控。而在一次檢測100個標(biāo)本，所有三個陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為：P=(100-3+1)/[100!/3!(100