第一課外源基因在大腸桿菌中的表達原理及微量移液器的使用演示文稿

第一課外源基因在大腸桿菌中的表達原理及微量移液器的使用演示文稿目前一頁\總數(shù)二十五頁\編于五點（優(yōu)選）第一課外源基因在大腸桿菌中的表達原理及微量移液器的使用目前二頁\總數(shù)二十五頁\編于五點第一部分外源基因在大腸桿菌中的表達原理研究者經(jīng)常需要獲得大量的蛋白質以滿足各類研究的需要。比如：1，用作抗原來刺激抗體的產(chǎn)生：可以是蛋白質或其部分片斷。2，用于生化和細胞生物學研究：這種情況下保持蛋白質原有的功能（如高比活性酶、結合蛋白或生長因子）就顯得十分重要。3，用于結構研究：要求得到的蛋白質有天然的結構。因為幾乎不可能知道一種尚未知道其結構的蛋白質經(jīng)變性后是否被精確地重折疊，蛋白質必須以可溶性形式產(chǎn)生。目前三頁\總數(shù)二十五頁\編于五點獲得目的蛋白的方法：從天然產(chǎn)物中純化利用基因工程方法表達基因工程蛋白質表達的概念：是指為了獲取大量的目標蛋白而進行的有目的的蛋白質合成。方法是將編碼所需蛋白質的基因插入質粒或其他載體，然后再將載體導入活細胞。利用宿主細胞的蛋白質生產(chǎn)體系產(chǎn)生目的蛋白。目前四頁\總數(shù)二十五頁\編于五點

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"WernerArberDanielNathansHamiltonO.Smith

SwitzerlandBiozentrumderUniversit?t

JohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicine

Baltimore,USAJohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicine

Baltimore,USA1929-1928-19991931-目前五頁\總數(shù)二十五頁\編于五點抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)啟始復制子（ori,Originofreplication)；多克隆位點(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；質粒的結構：目前六頁\總數(shù)二十五頁\編于五點目前七頁\總數(shù)二十五頁\編于五點目前八頁\總數(shù)二十五頁\編于五點重組DNA轉化細菌過程示意圖目前九頁\總數(shù)二十五頁\編于五點目前十頁\總數(shù)二十五頁\編于五點各種表達系統(tǒng)

原核表達系統(tǒng)：指大腸桿菌表達系統(tǒng)。真核細胞系統(tǒng)包括：哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、植物細胞等表達體系。各種表達體系各有優(yōu)缺點。舉例說明如下：原核表達系統(tǒng)大腸桿菌表達載體：包括噬菌體載體和質粒載體，通過感染或轉化大腸桿菌產(chǎn)生目的蛋白。原核細胞系統(tǒng)主要是利用大腸桿菌細胞生產(chǎn)目的蛋白。優(yōu)點：該系統(tǒng)操作簡便、周期短、收益大、及表達產(chǎn)物穩(wěn)定。局限：表達基因的相對分子質量有限，且不能對表達產(chǎn)物進行一些翻譯后加工、修飾。目前十一頁\總數(shù)二十五頁\編于五點各種表達系統(tǒng)桿狀病毒表達系統(tǒng)將外源基因插入昆蟲桿狀病毒，通過重組病毒感染昆蟲細胞而產(chǎn)生目的蛋白。優(yōu)點：表達效率高，昆蟲細胞對蛋白質表達后修飾加工的方式與哺乳動物細胞接近。缺點：操作比較繁瑣。目前十二頁\總數(shù)二十五頁\編于五點各種表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)利用病毒、質粒建立重組有外源基因的表達載體，通過感染或轉染進入宿主細胞表達目的蛋白。優(yōu)勢：能夠指導蛋白質的正確折疊，提供復雜的糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達產(chǎn)物在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然的哺乳動物蛋白質分子。缺點：表達效率通常不高。目前十三頁\總數(shù)二十五頁\編于五點利用大腸桿菌進行外源基因表達的過程構建表達載體在大腸桿菌里表達外源基因一般是始于將基因插入表達載體（通常為質粒）。表達載體應具有的幾種元件是：選擇標志的編碼序列，它可提供篩選以確定載體是否進入了宿主細胞。轉錄調控序列：可調控的強啟動子（如lac,tr或tac啟動子），經(jīng)誘導后可產(chǎn)生大量的目的基因mRNA；轉錄終止子。翻譯調控序列：一個位置合適的核糖體結合位點（和起始密碼子ATG之間有合適的距離）。一個由多個限制性內(nèi)切酶位點構成的克隆位點，便于將外源基因以正確的方向插入載體中。目前十四頁\總數(shù)二十五頁\編于五點利用大腸桿菌進行外源基因表達的過程構建表達載體（質粒）制備感受態(tài)大腸桿菌將質粒DNA轉化感受態(tài)大腸桿菌提取質粒DNA質粒DNA定量目前十五頁\總數(shù)二十五頁\編于五點利用大腸桿菌進行外源基因表達的過程構建表達載體擴增目的基因PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。RT-PCR方法：從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。純化PCR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物定量目前十六頁\總數(shù)二十五頁\編于五點利用大腸桿菌進行外源基因表達的過程構建表達載體將表達質粒DNA用限制性內(nèi)切酶（與目的基因PCR引物相同的酶切位點）進行酶切回收質粒DNA酶切產(chǎn)物（載體大片段）質粒DNA酶切產(chǎn)物定量PCR產(chǎn)物酶切回收PCR產(chǎn)物的酶切片段PCR產(chǎn)物的酶切片段定量利用連接酶連接質粒DNA酶切產(chǎn)物及外源基因酶切片段目前十七頁\總數(shù)二十五頁\編于五點利用大腸桿菌進行外源基因表達的過程重組表達載體的鑒定將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌抽提重組質粒并定量通過酶切初步鑒定重組質粒測序驗證重組質粒（檢查目的基因插入方向、序列及閱讀框架的正確性）目前十八頁\總數(shù)二十五頁\編于五點利用大腸桿菌進行外源基因表達的過程重組蛋白的誘導表達制備宿主菌的感受態(tài)細胞重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞培養(yǎng)帶有重組表達載體的大腸桿菌誘導重組蛋白質表達目前十九頁\總數(shù)二十五頁\編于五點利用大腸桿菌進行外源基因表達的過程鑒定目的基因表達產(chǎn)物抗體鑒定生物活性鑒定序列測定目前二十頁\總數(shù)二十五頁\編于五點第二部分微量移液器的使用一個完整的移液過程包括：容量設定安裝移液頭預洗移液頭吸液排液卸去移液頭每一個步驟都要遵循操作規(guī)范。目前二十一頁\總數(shù)二十五頁\編于五點容量設定從大值調整到小值時，剛好即可。從小值調整到大值時，需要調超過三分之一圈后再返回，這是因為計數(shù)器里面有一定的空隙，需要彌補。不要將按鈕旋出量程，這將導致移液器損壞。吸液頭安裝正確的安裝方法是：把白套筒頂端插入吸液頭，在輕輕用力下壓的同時，把移液器按逆時針方向旋轉180度。切記用力不能過猛，更不能采取剁吸液頭的方法來進行安裝，那樣做會對移液器造成不必要的損傷。目前二十二頁\總數(shù)二十五頁\編于五點預洗吸液頭安裝了新的吸液頭或增大了容量值以后，應把需要轉移的液體吸取、排放兩到三次。這樣做是為了讓吸液頭內(nèi)壁形成一道同質液膜，確保移液工作的精度和準度，使移液過程具有重現(xiàn)性。其次，在吸取有機溶劑或高揮發(fā)液體時，揮發(fā)性氣體會在白套筒室內(nèi)形成負壓，從而產(chǎn)生漏液的情況，這時就需要我們預洗四到六次，讓白套筒室內(nèi)的氣體達到飽和，負壓就會自動消失。目前二十三頁\總數(shù)二十五頁\編于五點吸液先將移液器排放按鈕按至第一停點，再將吸液頭垂直浸入液面。盡量避免吸液頭浸入液面過深，以免液壓對吸液的