大鯢卵變化情況

摘要對中國大鯢(Andriasdavidianus)胚胎發(fā)育過程的外部形態(tài)及器官發(fā)育特點進行了詳細地描述，為中國大鯢胚胎發(fā)育制定出完整的分期標準.中國大鯢胚胎發(fā)育過程依據(jù)形態(tài)學和組織學特征可以劃分為6個階段：卵裂階段、囊胚階段、原腸胚階段、神經(jīng)胚階段、器官形成階段、孵化階段，共20個時期.從整體上來看，中國大鯢的胚胎發(fā)育特征與東方蠑螈(Cynopsorientalis)、黑斑蛙(R.nigromaculata)大體相似，主要的差異表現(xiàn)在早期卵裂方式以及消化系統(tǒng)的發(fā)育方面.形態(tài)學及組織學觀察表明，中國大鯢卵裂并非盤狀卵裂類型.同時，中國大鯢胚胎發(fā)育過程中前三次卵裂均為經(jīng)裂，胚胎消化系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育遲緩，無平衡器或口吸盤等，這些均為中國大鯢胚胎發(fā)育的顯著特點。兩棲類是脊椎動物由水生到陸生的過渡類型，兩棲動物胚胎學研究對探索脊椎動物進化及比較胚胎學具有重要意義.目前，兩棲類胚胎學的研究主要集中于無尾目及有尾目蠑螈科，蔡堡［1］為東方蠑螈胚胎發(fā)育建立了分期系統(tǒng)，繪制了翔實的外形及器官發(fā)育圖譜.有尾目隱鰓鯢科系進化過程中殘留的古生物類［2］,現(xiàn)僅存3種：北美大鯢、日本大鯢和中國大鯢(Andriasdavidianus).北美大鯢和日本大鯢未見有胚胎發(fā)育相關(guān)的研究報道，有關(guān)中國大鯢胚胎學研究［3-5］僅局限于對外形的初步觀察，胚胎發(fā)育時期的劃分不清晰，同時缺乏組織器官發(fā)生發(fā)育的研究.近年來作者所在研究室在成功開展中國大鯢人工繁殖基礎(chǔ)上，對中國大鯢胚胎發(fā)育進行了連續(xù)、系統(tǒng)的形態(tài)以及組織學觀察，在中國大鯢早期卵裂及器官的發(fā)生發(fā)育方面獲得了新的認識，為研究隱鰓鯢科其他物種及兩棲類系統(tǒng)進化奠定了基礎(chǔ).材料與方法1實驗材料中國大鯢人工催產(chǎn)及孵化是在本研究室大鯢人工繁育基地進行的.已達性成熟親本通過人工催產(chǎn)、人工授精獲得受精卵.受精卵在地下室孵化池中流水孵化(水溫(20±1)°C,溶解氧(5±1)mg/L,pH值7.4-7.6),每日平均光照大約1h，照度為4lx.2研究方法外形觀察的方法為：受精后2多細胞期，每2小時觀察記錄一次；囊胚期2尾芽期，約每8小時觀察記錄一次；鰓板期2孵化出膜，約12h觀察記錄一次.胚胎發(fā)育時期的確定基本上以同批胚胎1/2達到該時期為準，2003-2005年期間共觀察統(tǒng)計了1100余枚胚胎.組織學研究采用所拍照記錄的胚胎，具體方法為：卵裂階段每個時期取2枚胚胎；囊胚和原腸胚各取3枚胚胎；神經(jīng)胚各時期分別取2枚胚胎；器官形成階段每日取1—2枚胚胎.共取得大鯢胚胎56枚，早期胚胎采用Smith’s液固定，常規(guī)酒精2叔丁醇脫水，前肢芽期后的胚胎采用Bouin’s液固定，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，切片(厚度6—10〃m)，常規(guī)HE染色.形態(tài)觀察及照像采用NikonSMZ800體視鏡攝像系統(tǒng)，OlympusXTL2II型照相機體視顯微照相系統(tǒng)和SonyR1數(shù)碼相機;顯微切片觀察及照像采用NikonE600顯微圖像采集系統(tǒng).分期系統(tǒng)的建立依據(jù)中國大鯢胚胎發(fā)育各階段獲得的外形記錄及圖片，結(jié)合組織學切片結(jié)果，分析其外形變化及主要器官發(fā)生發(fā)育變化特征，并劃分具體發(fā)育時期.分期標準參考東方蠑螈［1］和黑斑蛙［6］的分期方法.實驗結(jié)果中國大鯢胚胎發(fā)育可分為6個階段，共20個發(fā)育時期(見表1).1卵裂階段中國大鯢卵子大多直徑為5-8mm,不含色素，卵黃含量非常豐富，卵子呈卵黃色，動物極附近顏色稍淺.卵子外裹有膠膜，入水后膠膜吸水膨脹，卵周隙明顯擴大.受精后20h左右，動物極出現(xiàn)一條分裂溝，第一次卵裂開始.第一次卵裂為經(jīng)裂（圖1（a）），分裂溝在動物極端較深，隨著分裂進行，分裂溝緩慢地向下延伸并越來越淺，越過赤道面后消失在植物半球，第一次分裂完成大約需要4-8h.第二條分裂溝在第一條分裂溝出現(xiàn)大約2h后出現(xiàn)，第二次分裂亦為經(jīng)裂，與第一次分裂面垂直（圖1（b））.第三次卵裂仍為經(jīng)裂，并且有兩個相互垂直的經(jīng)裂面.前三次分裂在動物極端呈現(xiàn)“米”字形（圖1（c）），隨后的第四次分裂為緯裂，分裂面靠近動物極頂端，并且分裂在各個卵裂球不是同時進行的，分裂速度出現(xiàn)明顯差異，細胞的排列也不規(guī)則.在最初的幾次分裂中，動物半球每隔2-4h就會產(chǎn)生一條分裂溝，之后胚胎的分裂速度逐漸加快，分裂溝在動物半球越來越多，在植物半球只能依稀看見數(shù)條淺分裂溝.圖1中國大鯢胚胎發(fā)育外形圖（a）二細胞期；（b）四細胞期；（c）八細胞期，箭頭示分裂溝；（d）多細胞期；（e）囊胚早期；（f）囊胚晚期；（g）原腸早期頂面觀；（h）原腸早期側(cè)面觀（固定后的胚胎）；（i）原腸晚期腹面觀；（j）神經(jīng)板期，NP示神經(jīng)板；（k）神經(jīng)褶期，箭頭示神經(jīng)褶；（l）正在愈合的神經(jīng)胚尾端，長箭頭示胚孔，短箭頭示神經(jīng)管；（m）神經(jīng)管期，箭頭示體節(jié)，短箭頭示神經(jīng)管；（n）尾芽期，箭頭示突出的尾芽；（。）鰓板期，箭頭示隆起的鰓板，短箭頭示心臟位置；（p）前肢芽早期，箭頭示鰓芽，短箭頭示前肢芽；（q）前肢芽晚期；（r），（s）鰓血循環(huán)期，黑箭頭示外鰓，白箭頭示下頜；（t）尾血循環(huán)期，白箭頭示尾血管，黑箭頭示腹部色素；（u）后肢芽期，箭頭示后肢芽，短箭頭示羽狀外鰓圖2中國大鯢胚胎發(fā)育組織顯微圖（a）囊胚期橫切切片，BC示囊胚腔，箭頭示囊胚腔頂壁細胞，紅色區(qū)域放大為（b）圖；（b）囊胚植物半球放大，箭頭示細胞核；（c）原腸胚早期切片，BC示囊胚腔，箭頭示背唇，背唇左側(cè)的空腔是由于卵黃脫落造成的假象，并非原腸腔，紅色區(qū)域放大為（d）圖；（d）原腸胚背唇，箭頭示細胞核;（e）原腸胚晚期縱切切片，箭頭示背唇；（f）神經(jīng)板期橫切，箭頭示神經(jīng)板；（g）神經(jīng)板細胞放大,短箭頭示細胞核，箭頭示卵黃顆粒；（h）神經(jīng)褶期橫切切片；（i）神經(jīng)褶部位放大圖，N示細胞核,箭頭示卵黃顆粒；（j）神經(jīng)管期頭部縱切切片，箭頭示眼泡，F(xiàn)B示前腦，HB示后腦；（k）神經(jīng)管期胸部橫切切片，箭頭示體節(jié)，短箭頭示實心的脊索，NT示神經(jīng)管，P示咽；（l）神經(jīng)管期腹部橫切切片，箭頭示脊索，I示腸；（m）尾芽期胸部橫切切片，H示心臟原基；（n）鰓板期頭部橫切切片，箭頭示鰓板，短箭頭示脊索；（。）鰓板期胸部橫切切片，箭頭示心房心室胚胎發(fā)育進入原腸期.在接下來的幾天里，背唇由短的淺溝逐漸拉長成為大圓弧，原腸腔擴大囊胚腔消失（圖2（e）），胚軸逐漸轉(zhuǎn)動.圓弧形的胚孔最后合并為環(huán)狀（圖1（i）），中間充塞著大的卵黃栓，受精后10d左右卵黃栓轉(zhuǎn)至尾部慢慢縮小，并在神經(jīng)管閉合時消失.2囊胚階段從第三天開始胚胎發(fā)育進入囊胚期.囊胚期胚體呈球狀（圖1（e），（f）），在近動物極端出現(xiàn)一個大的空腔，此即囊胚腔（圖2（a）），在植物半球可見較多呈龜裂狀分裂溝.囊胚腔頂端的細胞界限不清晰，但可見細胞核，卵黃顆粒也較細密，卵黃含量較少；囊胚腔底端植物半球細胞大，可見細胞核（圖2（b）），周圍卵黃密布.2.3原腸胚階段從第六天開始，胚胎赤道面稍下方出現(xiàn)一道淺的橫溝，溝的上方為背唇(圖1(g),(h);圖2)，胚胎發(fā)育進入原腸期。在接下來的幾天里，背唇由短的淺溝逐漸拉長成為大圓弧，原腸腔擴大囊胚腔消失(圖2(e))，胚軸逐漸轉(zhuǎn)動，圓弧形的胚孔最后合并為環(huán)狀(圖1(i))，中間充塞著大的卵黃栓，受精后10d左右卵黃栓轉(zhuǎn)至尾部慢慢縮小，并在神經(jīng)管閉合時消失。2.4神經(jīng)胚階段神經(jīng)板期：胚胎背部出現(xiàn)前端寬大、后端細長的勺狀神經(jīng)板(圖1(j)；圖2(f)),神經(jīng)板及其周圍的組織依然含有豐富的卵黃(圖2(g)).神經(jīng)褶期：神經(jīng)板邊緣高舉出現(xiàn)神經(jīng)褶(圖1(k);圖2(h)).在神經(jīng)褶期的稍晚階段出現(xiàn)體節(jié)，大約6-8對.神經(jīng)褶細胞中充斥著大量卵黃(圖2(i)).神經(jīng)褶沿胚胎背中部匯聚中間下陷，彼此黏附、融合形成中空的神經(jīng)管.神經(jīng)管期：神經(jīng)管閉合(圖1(m)),胚胎在膠膜內(nèi)開始側(cè)臥.神經(jīng)管頭部膨大離開卵面突出，并出現(xiàn)凸凹不平的隆起；體節(jié)大約10-12對，體節(jié)下方出現(xiàn)腎原基.神經(jīng)管頭部可見視泡、前腦和后腦(圖2(j));稍后部位可見咽、咽囊、脊索和腎管(圖2(k));胚胎后端的腸呈現(xiàn)細長條狀(圖(l)).2.5器官形成階段尾芽期：胚胎頭部顯著膨大，肉眼可分辨出眼泡，并且由于腦的發(fā)育，整個神經(jīng)管伸長較快，因此產(chǎn)生彎曲，腦部向下彎曲約成90°角，成為腦曲，尾部形成尾芽并離開卵面突出(圖1(n));心臟原基出現(xiàn)(圖2(m)).鰓板期：眼泡突出，周圍凹陷；鰓板原基隆起逐漸分化為鰓弓(圖1(。);圖2(n));胸腔更加膨大，心臟分化為心房和心室(圖2(o));體節(jié)24對；體表尤其是背部區(qū)域出現(xiàn)色素斑點；尾芽末端細圓.前肢芽期：前肢芽出現(xiàn)原基；鰓板部位分化出3對短小的外鰓芽(圖1(p)，(q);圖3(c)，，(f));胸腔透明化，心臟淺色并開始跳動，每分鐘25次左右；胚體可以緩慢扭動.視杯、晶狀體、嗅窩出現(xiàn)(圖3(a));聽囊、中腦、菱腦、腦神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)，甲狀腺出現(xiàn)，脊索開始空泡化,肝臟出現(xiàn)(圖3(b),(c),(e)).3對外鰓芽增長并長出分枝；體色素增多；心律30-40;同時富含卵黃的腹部細胞分裂加快，可見眾多細胞核(圖3(g)).鰓血循環(huán)期：心臟2外鰓的循環(huán)開始，心率40-50;頭部及外鰓發(fā)達(圖1(s);圖3(h),(i))每根外鰓芽上分出3-5對分枝，可以觀察到透明的毛細血管中有紅細胞流動；腹部出現(xiàn)網(wǎng)狀血管分布；眼出現(xiàn)少許色素，頭部、背部的色素成片分布(圖1(r),(s)).鰓血循環(huán)晚期時,心率50-55;每根鰓芽分枝5-8對；眼色素連成環(huán)狀，腹部色素增多；前肢芽呈現(xiàn)尖細狀；下頜及胃出現(xiàn)(圖3(j)).尾血循環(huán)期：可見明顯尾部血液循環(huán)；下頜裂延長，可以活動；腦壁增厚，晶狀體變透明，體色素在腹部廣泛分布(圖1(t);圖3(k),(l)).此階段的幼苗肌肉、骨骼發(fā)達，運動頻繁,常提前脫膜.該時期脫膜的幼鯢存活率較高，而在此時期之前出膜的幼苗大部分死亡.2.6孵化期(后肢芽期)受精后歷經(jīng)31d,每根外鰓上有6-8對鰓絲分枝，呈羽狀，心率每分鐘約55次；頭背部色素、血管密布，呈現(xiàn)黑紅色；腹部卵黃細胞區(qū)有一半?yún)^(qū)域出現(xiàn)色素；后肢芽出現(xiàn)并伸長，皮膚腺(圖(m))、肛門出現(xiàn)(圖1(u);圖3(n),(o));前肢芽增長增粗亦出現(xiàn)色素，出膜前后分為兩趾；眼黑亮；背鰭寬大，尾鰭狹長.胚胎膠膜松散并膨脹，幼鯢不斷扭動，頭部突破膠囊最后完全脫膜.剛出膜的幼苗長約3.5cm,背部黑褐色，腹部細胞仍然含有豐富卵黃，外鰓發(fā)達每側(cè)長約1cm,無平衡棒，無口吸盤.靜止時平臥或側(cè)臥于水底，依靠尾部擺動可以平游.孵化出膜后大約一個月，中國大鯢幼苗前后肢的伸長、分趾逐漸完成，腹部卵黃也會消耗殆盡.隨著生長發(fā)育，肺也逐漸發(fā)育，外鰓在出膜后大約8個月開始萎縮，最終完全消失而由肺成為唯一的呼吸器官大約需要1-2年的時間.圖3中國大鯢胚胎發(fā)育組織顯微圖（a）前肢芽期頭部縱切切片，RB示菱腦，箭頭示嗅窩，短箭頭示視杯及晶狀體；（b）前肢芽頭部橫切切片，AV示聽囊，短箭頭示腦神經(jīng)，可見空泡化的脊索；（c）前肢芽胸部橫切切片，TG示甲狀腺，P示咽，BB示鰓芽；（d）前肢芽胸部橫切切片，箭頭示心臟，短箭頭示鰓芽，I示腸；（e）前肢芽腹部橫切切片，L示肝；（f）前肢芽腹部橫切切片，箭頭示神經(jīng)嵴，短箭頭示腎管，F(xiàn)L示前肢芽；（g）前肢芽期腹部富含卵黃組織切片，箭頭示細胞核，短箭頭示卵黃顆粒；（h）鰓血循環(huán)期頭部縱切切片；（i）鰓血循環(huán)期胸部橫切切片，箭頭示鰓芽及鰓絲，短箭頭示腦神經(jīng)；（j）鰓血循環(huán)期腹部橫切切片，ST示胃；（k）尾血循環(huán)期頭部橫切切片，箭頭示透明的晶狀體，OP示嗅窩，RB示發(fā)達的菱腦；（l）尾血循環(huán)期腹部橫切切片，L示肝臟；（m）后肢期橫切切片，箭頭示背部皮膚腺；（n）后肢芽期后肢芽處橫切切片，箭頭示后肢芽；（o）后肢芽期肛門處橫切切片，箭頭示肛門3討論1關(guān)于中國大鯢的卵裂方式之前有報道認為：中國大鯢卵子受精后形成白色帽狀胚盤，分裂僅限于胚盤，屬于典型的盤狀卵裂[3-5].作者近三年對大鯢早期胚胎的觀察發(fā)現(xiàn)：中國大鯢卵子受精后，并未見明顯的胚盤樣隆起.受精卵分裂時，分裂溝自動物極端向下延伸至植物半球.在囊胚期的植物半球上可觀察到一些淺龜裂狀的分裂溝，這一現(xiàn)象曾有過報道[4,5].中國大鯢胚胎沒有出現(xiàn)卵黃囊結(jié)構(gòu)，囊胚腔頂壁細胞中含有大量的卵黃，囊胚腔下方植物半球中可見許多細胞核.同時，在神經(jīng)胚、尾芽期、鰓板期和前肢芽期胚胎的外胚層來源細胞中均存在有豐富的卵黃顆粒.盤狀卵裂類型的分裂溝局限于胚盤，卵黃不參與胞質(zhì)的分割[7].觀察結(jié)果表明，中國大鯢早期胚胎發(fā)育卵裂類型不是盤狀卵裂，而與黑斑蛙、東方蠑螈的不等全裂方式更為相似.在中國大鯢早期胚胎切片中，特別在那些卵黃很豐富的組織中，細胞界限不清晰，只能觀察到大量的細胞核.我們注意到，那些卵黃較少的外胚層組織比較容易分辨細胞界限，而隨著卵黃持續(xù)消耗，那些原本分界模糊的內(nèi)胚層來源的組織其細胞界限也逐漸清晰起來.然而中國大鯢早期胚胎細胞界限不清晰究竟是因為細胞質(zhì)中卵黃對細胞結(jié)構(gòu)觀察的影響，抑或是由于豐富卵黃對分裂面的阻遏作用，導致細胞質(zhì)的分裂滯后于核分裂，還需要進一步的深入研究.中國大鯢第一、二次卵裂均為經(jīng)裂，第三次卵裂仍為經(jīng)裂，第四次卵裂為不規(guī)則的緯裂.這與黑斑蛙與東方蠑螈前兩次卵裂是經(jīng)裂，第三次卵裂則為緯裂，第四次分裂是經(jīng)裂[1,6]存在著明顯差異.施氏鱘（AcipenserSchrenckii）是一種以不等全裂方式進行卵裂的硬骨魚類，施氏鱘前三次卵裂為經(jīng)裂，第四次為緯裂，劉洪柏等[8]認為施氏鱘的這種卵裂方式是介于魚類和兩棲類之間的一種過渡類型.中國大鯢與施氏鱘早期卵裂過程十分相似，表明中國大鯢在進化上可能與硬骨魚類存在有密切關(guān)系.在20。。水溫下，從受精卵發(fā)育至囊胚早期多數(shù)硬骨魚類僅3h[9],黑斑蛙約6h[10],東方蠑螈約24h[11],而中國大鯢則需要約70h.中國大鯢早期胚胎細胞分裂速度非常緩慢，從而導致整個胚胎發(fā)育持續(xù)時間長（約700h）.在中國大鯢人工繁育生產(chǎn)實踐中，控制孵化溫度、孵化密度，提高溶氧量，保持水體清潔和防止微生物侵染是提高中國大鯢孵化率的一個重要保證.2中國大鯢在器官發(fā)生發(fā)育上的特點中國大鯢在腦的分化，眼、嗅窩、聽囊、腎管和生殖嵴的發(fā)生發(fā)育過程上與東方蠑螈[1]基本相同（圖4）.在鰓板期二者都出現(xiàn)了心房心室，心臟搏動血液循環(huán)也都是在前肢芽早期開始的，但中國大鯢心臟原基的出現(xiàn)要稍稍晚于東方蠑螈.中國大鯢在消化系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育上與東方蠑螈存在有較大的差異：東方蠑螈在神經(jīng)管期、尾芽期和鰓板期分化出咽、肝臟和甲狀腺，并且形成了肛門；而中國大鯢在神經(jīng)管期有咽和腸的形成，在此之后的較長時間內(nèi)消化道沒有明顯發(fā)育變化，直到前肢芽期才形成肝臟和甲狀腺，孵化期出現(xiàn)肛門.中國大鯢胚胎消化系統(tǒng)發(fā)育緩慢的特點可能與其胚胎細胞含有豐富的卵黃密切相關(guān).孵化出膜中國大鯢幼苗的組織細胞中仍然含有大量卵黃,這些卵黃的存在為胚后發(fā)育提供營養(yǎng).大鯢幼苗細胞中的卵黃大約在孵化出膜后30d左右消耗殆盡，此時

消化系統(tǒng)也已基本發(fā)育完善，方可開始投喂餌料.剛孵化的大鯢幼苗雖然已經(jīng)開口、具有吞咽食物的能力，但若立即喂食，則會導致幼苗死亡.大多數(shù)兩棲動物胚胎孵化后在其頭部發(fā)生一類臨時性的器官：東方蠑螈為平衡器[1],無尾類為口吸盤.平衡器為棒狀突起.一般認為平衡器的存在可以幫助幼苗在水中保持平衡；口吸盤則通過分泌糖蛋白粘液，使蝌蚪粘附于水中的物體上[12].在中國大鯢幼苗中并未觀察到有平衡器或口吸盤的出現(xiàn).東方蠑螈