狂犬病實驗室檢測技術

一、實驗室操作前的要求及準備二、實驗室檢測方法目前一頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點1實驗室操作前的要求及準備（一）實驗室條件及生物安全操作要求（二）檢測標本的要求（三）實驗前準備目前二頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點2（一）實驗室條件及生物安全操作要求1、暴露前免疫工作人員需要暴露前免疫意外暴露于狂犬病毒時,必需立即報告部門負責人。2、P2實驗室

操作所有潛在狂犬病感染的材料均應在P2或P3實驗室內(nèi)進行(實驗室固定毒在P2，病人或動物分離的街毒在P3）。3、P3實驗室

對動物標本進行狂犬病毒分離時，必須在P3以上條件的專業(yè)實驗室中進行。

沒有P3實驗室，嚴禁從事狂犬病毒分離工作。目前三頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點34、個人防護實驗前要穿戴好防護服、眼鏡、手套，作好技術上的準備。5、防止氣溶膠擴散由于空氣傳播狂犬病毒已經(jīng)得到證實，因此高速混懸或離心操作應在密閉狀態(tài)下進行。6、實驗后消毒處理實驗后要作好善后消毒處理,狂犬病毒對脂溶劑（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制劑和四銨化合物敏感，操作完畢對操作臺、實驗材料等要用相應的消毒劑或高壓蒸汽進行消毒處理。目前四頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點41、采集時間

（1）應盡量采集較新鮮的標本。（2）采集時無菌操作，避免標本污染2、標本保存（1）盡量低溫保存（2）存放于無菌離心管中并進行編號。

3、標本類型（1）唾液、腦脊液、眼角膜、咬傷處皮膚組織、腦組織、血清等。（2）唾液、腦脊液、眼角膜、咬傷處皮膚組織、腦組織等均可用于病原學檢測，其中以腦組織中的陽性率最高；血清和腦脊液可用于抗體的檢測。（二）檢測標本的要求目前五頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點5（三）實驗前準備1、實驗室及儀器的準備（略）2、各種試劑及材料的準備（略）目前六頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點6實驗室檢測方法（一）DFA法（二）巢式PCR法（三）其它檢測方法（四）狂犬病診斷標準（WS281-2008）中的檢測方法（五）美國CDC狂犬病實驗室操作手冊中的檢測方法目前七頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點7（一）DFA法（直接熒光抗體法）

——檢測狂犬病毒抗原

免疫熒光技術Ab優(yōu)點Ag(尤其是不產(chǎn)生細胞病變的病毒安全快速簡便敏感性和特異性較高目前八頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點8熒光抗體的染色方法可分為兩類：直接法—熒光抗體直接與標本內(nèi)的抗原反應,優(yōu)點簡便、快捷、有效減少非特異性染色,只適用于檢測細胞內(nèi)的抗原；間接法

—熒光抗體作為第二抗體，與直接結合胞內(nèi)抗原的第一抗體反應,既可檢測胞內(nèi)抗原，也可以檢測體液中的特異抗體相對直接法操作步驟增多

DFA原理：

抗體蛋白分子

++抗原→形成抗原抗體復合物→通過熒光顯微鏡→檢測抗原

熒光素目前九頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點9操作：1、材料和儀器2、操作步驟i.印片：

用酒精浸泡載玻片30分鐘后取出、吹干，分別取不同部位的腦組織剖面,均勻的涂印在載玻片上；

ii.固定：

吹干后，取冷丙酮（4℃）室溫固定7～10分鐘；取出吹干，進行步驟3，或置于－70℃冰箱保存；

iii.加熒光抗體：

將稀釋好的熒光抗體滴加在固定好的抗原片上（如果從冰箱中取出，則待霧氣散掉后再進行此步驟。）；

目前十頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點10iv.孵育：

將抗原片放在濕盒中，37℃溫育30分鐘；v.洗片：

取出后，用緩流沖洗抗原片3～5秒，再用PBS振洗2遍，蒸餾水振洗1遍，每次2分鐘，吹干；

vi.封片鏡檢：

用90％甘油（PBS）封片，加蓋玻片，熒光顯微鏡觀察。

攪拌器及染色缸

目前十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點11結果判斷：

仔細觀察每個視野的熒光強度，并結合不同視野的熒光分布，作出熒光強度的等級判斷：陰性、可疑、＋~＋＋＋＋－：無熒光；＋/－：極弱的可疑熒光；無熒光“－”

目前十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點12＋：熒光較弱，但清晰可見；目前十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點13＋＋：熒光明亮，且多個視野均有分布；目前十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點14＋＋＋～＋＋＋＋：熒光閃亮，可見尼基氏小體清晰，且范圍廣泛；熒光強度“＋＋＋”熒光強度“＋＋＋＋”目前十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點15目前十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點16（二）巢式PCR方法——檢測狂犬病毒核酸

傳統(tǒng)的PCR檢測模式一般需要三個步驟：制備模板：對待測標本進行核酸（DNA或RNA）提取擴增過程：采用PCR或RT-PCR技術對核酸進行變性、退火、延伸擴增；檢測過程：通過電泳等方法對PCR產(chǎn)物進行檢測。

SampleExtractRNAorDNAPCRElectrophoresisphotograph目前十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點17巢式PCR（nested－PCR）：巢式PCR的原理：

是設計兩對引物，其中一對引物在另一對引物擴增產(chǎn)物的片段上，通過二次PCR反應對某個基因進行檢測。通常第一次采用能擴增較大片段的引物，經(jīng)過循環(huán)擴增后，將第一次擴增的產(chǎn)物作為模板進行第二次擴增。

優(yōu)點：

特異性、靈敏度均比常規(guī)PCR好。缺點：

比常規(guī)PCR易污染。目前十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點18巢式PCR方法的操作：

1、RNA提?。篢rizol法

（1）以下步驟在P2生物安全柜中進行

取不同位置的少量腦組織（50-100mg）＋1000μlTrizol先加200μl（研磨均勻）然后加滿至1000μl[液體（唾液、尿液等）取250μl＋750μlTrizolLS]↓-70℃過夜或顛倒Epp管30～40次以便充分混勻內(nèi)容物，室溫放置5分鐘（此步完可-70℃保存1個月）

目前十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點19（2）以下步驟可在普通實驗室進行

-70℃取出，室溫融化→加200μl氯仿，快速顛倒Epp管數(shù)次（30秒），使其呈淡粉紅色↓室溫放置3min↓4℃離心，12000rpm，15min（其間標記新的離心管，每管中加600μl異丙醇）↓取離心后水相600μl，加入新的離心管中，輕柔混勻↓室溫放置10min（－20℃放置30分鐘效果更佳）↓4℃離心，12000rpm，10min↓

目前二十頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點20緩緩倒掉上清，用槍頭輕輕吸去殘存液體，可見少量沉淀↓加1ml75％乙醇（DEPCH2O新鮮配制）洗滌沉淀↓4℃離心12000rpm，10min↓緩緩倒掉上清，用槍頭輕輕吸去殘存液體，室溫干燥數(shù)分鐘（加入75％乙醇至－70℃可長期貯存1～2年）↓腦組織的沉淀溶于70ulDEPCH2O中(2個EPP管分裝)[液體（唾液、尿液等）的沉淀溶于35ulDEPCH2O中]↓直接進行逆轉(zhuǎn)錄或－70℃貯存

目前二十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點21注意事項：

1.操作時一定戴口罩手套，保證離心管槍頭無RNA酶2.一次提取核酸，樣本數(shù)不要太多（10個左右）3.加入氯仿后到加入異丙醇之前的操作應盡量快速且作用時間準確，否則容易降低提取效率4.異丙醇和乙醇作用時間略長不影響結果5.加入異丙醇后所有的混均操作要輕柔，加液體時貼壁緩流，以免破壞到所提核酸6.盡量縮短RNA在空氣及室溫的暴露時間，水溶的RNA一定要低溫保存7.標本及時放回-20℃或-70℃

目前二十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點222、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA1）pd(N)6稀釋至0.2ug/ul2）水浴預熱至65℃（其間標記反應管）3）33ulRNA液65℃水浴10min（其間準備冰盒或碎冰）4）冰浴2min，瞬時離心。5）將液體轉(zhuǎn)移至試劑盒反應管中32ul，先不要混勻。6）再向反應管中加入1ulpd(N)60.2ug/ul或特異引物各0.5ul，使總體積達到33ul，室溫1min，混勻，瞬時離心。7）37℃水浴，60min8）-20℃或-70℃保存cDNA目前二十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點233、巢式PCR：目前二十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點24目前二十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點25瓊脂糖凝膠電泳

1．電泳槽中注入緩沖液TAE2．將做好的瓊脂膠放入電泳槽（加樣孔在負極方向）3．Marker加5ul，樣品加10ul5．電壓：100V6．時間：30min

照相：凝膠成像儀/紫外透射儀目前二十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點26（三）其它檢測方法1、ELISA——檢測抗原：包被抗體：用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋的抗狂犬病毒核衣殼IgG包被96孔酶標板，4℃過夜；

封閉：用含0.3％牛血清白蛋白和5%蔗糖的pH9.6碳酸鹽緩沖液封閉30分鐘；加待檢標本：將采集到的標本研磨，用pH7.4PBS制成30％的懸液，離心取上清加入酶標板孔內(nèi)，同時設陰性、陽性對照，200μl/孔，37℃孵育1小時；洗板：洗板四次；加酶標抗體：后加入純化的酶標記抗狂犬病毒抗體200μl/孔，37℃l小時；洗板：同上；加底物：加入酶反應底物，室溫作用30分鐘；終止反應：加2MH2SO4終止反應；觀察結果：肉眼觀察或酶標儀測定結果。目前二十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點272、熒光灶抑制試驗——檢測中和抗體

中和抗體：

為疫苗免疫力程度的評判指標中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保護快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）：為WHO推薦的檢測方法

制備細胞懸液(1×10cells/ml的BSR細胞懸液)

↓

稀釋血清和病毒(待測血清、對照血清、標準血清、病毒固定毒CVS株）

↓

中和血清和病毒(0.1ml血清和標準病毒稀釋液0.1m1，37℃中和1.5小時)

↓

檢測剩余病毒(每孔加入50μl制備好的細胞懸液，37℃、5%C02過夜培養(yǎng))

↓

固定(棄掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，丙酮固定)

↓

熒光抗體檢測(干燥后，加熒光素標記的抗狂犬病毒抗體，37℃30分鐘)

↓

觀察結果(PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察結果)

↓

計算中和抗體滴度(實驗組中能使熒光灶抑制≥50％的血清最高稀釋倍數(shù)，即為被檢血清的中和抗體滴度)

步驟目前二十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點283、病毒分離A.細胞培養(yǎng)法——分離病毒研磨標本→

制成懸液（用PBS或MEM，30％）→

離心（4℃2000r/min離心20m）→

取上清接種細胞（鼠神經(jīng)瘤細胞、Vero細胞或BHK21細胞）→

吸附（2h）→

加維持液→

孵育(37℃、5％C02、4～5天)→

鑒定B.乳小白鼠接種法——分離病毒研磨標本

→

制成懸液→

離心→取上清接種乳鼠腦內(nèi)（1～2日齡）→飼養(yǎng)→觀察發(fā)病情況(未發(fā)病的鼠保留至21天后作DFA檢測)目前二十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點294、ELISA——檢測狂犬病毒抗體ELISA方法測定的是總抗體，不代表具有保護性的中和抗體水平其結果僅供參考。5、染色鏡檢——檢測內(nèi)基氏小體目前三十頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點30（四）狂犬病診斷標準（WS281-2008）中的檢測方法1、DFA法——檢測狂犬病毒抗原

意義：陽性結果，表明有狂犬病毒感染，有確診意義。2、ELISA——檢測狂犬病毒抗原

意義：檢測到狂犬病毒抗原陽性有診斷意義。3、細胞培養(yǎng)方法——分離狂犬病毒

意義：陽性結果表明有狂犬病毒感染，有確診意義。目前三十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點314、RT-PCR——檢測狂犬病毒核酸原理：狂犬病毒為負鏈RNA病毒，PCR前需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶作用，合成一條cDNA鏈（RT）,再進行PCR。檢測步驟：

1）病毒RNA的提取2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3）PCR擴增4）電泳意義：陽性結果表明有狂犬病毒感染，有確診意義。目前三十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點325、狂犬病特異性抗體檢測狂犬病特異性抗體：

在自然感染情況下，狂犬病毒→通過帶有病毒的動物唾液→進入機體傷口→在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流）→故不能形成病毒血癥。

在感染后，狂犬病毒或其抗原→不能與機體免疫系統(tǒng)廣泛接觸→故機體無免疫應答反應（針對狂犬病毒）。

晚期，狂犬病→破壞血腦屏障→大量病毒抗原→進入血流→刺激機體→產(chǎn)生大量特異性抗體。

因此，通常在發(fā)病早期血清中查不到抗體或抗體滴度很低，只在臨床疾病的晚期出現(xiàn)。目前三十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點33A.快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）——測定中和抗體意義：中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保護B.ELISA——檢測狂犬病毒抗體意義：

1）接種過狂犬病疫苗的患者抗體滴度大于0.5IU/ml，表明已獲得一定的保護。2）未接種過疫苗的患者的抗體滴度大于1IU/ml，且近期有4倍增高，可考慮狂犬病。

3）部分狂犬病患者在臨死前抗體滴度也可能異常增高。目前三十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十五點34（五）美國CDC狂犬病實驗室操作手冊中的檢測方法

1、DFA——檢測狂犬病毒抗原

當以下情況發(fā)生時，需要重復（證實性）檢測: