熒光法測(cè)定藥片中維生素B2含量課件

熒光分光光度法測(cè)定藥片中維生素B2的含量課程名稱：儀器分析實(shí)驗(yàn)教師：陳志兵熒光分光光度法測(cè)定藥片中維生素B2的含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)熒光分光光度法測(cè)定藥片中維生素B2的分析原理。掌握熒光分光光度計(jì)的操作技術(shù)和測(cè)定藥片中維生素B2的方法。掌握Origin繪圖軟件的使用方法實(shí)驗(yàn)原理熒光分析法

常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長(zhǎng)長(zhǎng)的光而產(chǎn)生熒光。

a.與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。b.選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)。c.所需試樣量少、操作方法簡(jiǎn)便。熒光分析法的特點(diǎn)激發(fā)光譜：固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng))，化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大。熒光光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線。固定發(fā)射光波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)光波長(zhǎng)掃描，找出最大激發(fā)光波長(zhǎng)，然后固定激發(fā)光波長(zhǎng)進(jìn)行熒光發(fā)射波長(zhǎng)掃描，找出最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)。激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射熒光波長(zhǎng)的選擇是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。熒光光譜發(fā)射光譜熒光分析儀器

熒光分析儀器與分光光度計(jì)比較主要差別有兩點(diǎn)：a.熒光分析儀器采用垂直測(cè)量方式，以消除透射光的影響；b.熒光分析儀器有兩個(gè)單色器，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其它雜散光干擾。a.光源：在熒光計(jì)中常用鹵鎢燈作光源；熒光分度計(jì)常采用高壓汞燈或氙弧燈做光源。b.單色器：熒光計(jì)的單色器是濾光片，只能用于定量分析；熒光分光光度計(jì)采用兩個(gè)光柵單色器，可獲得激發(fā)光譜和熒光光譜。c.檢測(cè)器：熒光計(jì)采用光電管作檢測(cè)器；熒光分光光度計(jì)采用光電倍增管作檢測(cè)器。儀器部件

維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定。藥液維生素B2含量的測(cè)定光黃素實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)預(yù)習(xí)熒光分光光度法測(cè)定維生素B2的分析原理。了解熒光光度計(jì)的操作步驟和測(cè)定維生素B2的方法。F-4500型熒光光度計(jì)（日本日立公司）10mL具賽試管10只，移液槍1只，100mL容量瓶2只5×10-5g·mL-1VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液（置陰暗處保存），冰乙酸（AR），藥用VB2試樣(5×10-4g·mL-1)儀器與試劑1.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測(cè)定：在10個(gè)干凈的10mL具賽試管中，分別吸取25、50、75，100、125、150、175、200uLVB2標(biāo)準(zhǔn)溶液，用石英亞沸水稀釋至刻度，搖勻。從稀到濃測(cè)量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)步驟2.未知試樣的測(cè)定:在兩支10mL具賽試管中，分別移取100uL試樣,用石英亞沸水稀釋至刻度，搖勻。用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列時(shí)相同的條件，測(cè)量其熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)步驟1.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。2.根據(jù)待測(cè)液的平均熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度，計(jì)算出試樣中VB2含量。數(shù)據(jù)處理1、

波長(zhǎng)掃描（Wavelength

Scan）

對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)或發(fā)射波長(zhǎng)的掃描。

點(diǎn)擊快捷欄“Method”,顯示出“AnalysisMethod”的五個(gè)命令，分別為General(常規(guī))、Instrument(儀器條件)、Monitor(模擬監(jiān)測(cè))、processing(處理方法)、Report(報(bào)告格式)，輸入相應(yīng)數(shù)據(jù)。附錄：儀器操作軟件有關(guān)說明1.1

GeneralMeasurement-----選擇Wavelength

1.2Instrument

Scan

mode------輸入掃描方式

Data

mode------輸入數(shù)據(jù)采集方式

EM

WL------輸入發(fā)射波長(zhǎng)

EX

Start

WL------輸入激發(fā)起始波長(zhǎng)

EX

End

WL------輸入激發(fā)終止波長(zhǎng)

EX

WL------輸入激發(fā)波長(zhǎng)

EM

Start

WL------輸入發(fā)射起始波長(zhǎng)

EM

End

WL------輸入發(fā)射終止波長(zhǎng)附錄：儀器操作軟件有關(guān)說明Scan

speed------掃描速度選擇

Delay------延遲時(shí)間

EX

Slit------激發(fā)單元狹縫

EM

Slit------發(fā)射單元狹縫

PMT

Voltage------光電管負(fù)高壓

Response------響應(yīng)速度

Corrected

spectra------光譜校正

Shutter

control------光閘控制

Replicates------重復(fù)次數(shù)

Cycle

time------循環(huán)周期附錄：儀器操作軟件有關(guān)說明2.3其它與波長(zhǎng)掃描相同，從略。

3、光度法（Photometry）

也稱工作曲線法，是定量測(cè)量方法。有六個(gè)子命令，分別為General、Quantitation、Instrument、Standards、Monitor、Report,輸入相應(yīng)測(cè)量條件后進(jìn)行測(cè)量。

3.1General

Measurement------選擇Photometry

附錄：儀器操作軟件有關(guān)說明3.2

Quantitation

Quantitationtype------選測(cè)量類型

Calibrationtype------校正曲線類型3.3

Instrument

3.4

standar