質(zhì)粒DNA的提取和酶切專家講座

質(zhì)粒DNA提取與酶切試驗(yàn)四袁潔.10質(zhì)粒DNA的提取和酶切第1頁(yè)今天試驗(yàn)分2個(gè)部分：質(zhì)粒DNA提取質(zhì)粒酶切（電泳檢測(cè)下次進(jìn)行）質(zhì)粒DNA的提取和酶切第2頁(yè)一、試驗(yàn)原理質(zhì)?！|(zhì)粒是存在于細(xì)菌體內(nèi)一類獨(dú)立于染色體自主復(fù)制遺傳成份，在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)超螺旋形式存在。質(zhì)粒DNA的提取和酶切第3頁(yè)質(zhì)粒

(plasmid)質(zhì)粒是存在于細(xì)菌體內(nèi)一類獨(dú)立于染色體自主復(fù)制遺傳成份，在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)超螺旋形式存在。

質(zhì)粒已成為當(dāng)前最慣用基因克隆載體分子。有一些質(zhì)粒能攜帶外源DNA，能夠作為目標(biāo)基因進(jìn)入受體細(xì)胞運(yùn)載工具。質(zhì)粒DNA的提取和酶切第4頁(yè)2.目標(biāo)基因和質(zhì)粒載體連接3.將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞4.選擇5.目標(biāo)基因表示1.目標(biāo)基因獲取DNA片段（目標(biāo)基因）與載體DNA分子相連接，形成重組DNA選出含有所需要重組體DNA分子受體細(xì)胞目標(biāo)基因在受體細(xì)胞中高效表示，合成產(chǎn)物（蛋白質(zhì))重組DNA技術(shù)普通過程質(zhì)粒DNA的提取和酶切第5頁(yè)基因克隆示意圖宿主基因組大腸桿菌+重組質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取和酶切第6頁(yè)質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)質(zhì)粒復(fù)制子拷貝數(shù)pBR322及其衍生質(zhì)粒pMB115～20pUC系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒突變pMB1500～700pACYC及其衍生質(zhì)粒p15A10～212pSC101及其衍生質(zhì)粒pSC101～5ColE1ColE115～20質(zhì)粒DNA的提取和酶切第7頁(yè)質(zhì)粒DNA普通特征

：①質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)共生型遺傳因子，有相對(duì)獨(dú)立性。②它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞一些表型③它是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等質(zhì)粒DNA的提取和酶切第8頁(yè)質(zhì)粒三種構(gòu)型：閉合環(huán)狀DNA開環(huán)DNA——假如兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，分子因旋轉(zhuǎn)而消除鏈張力。線狀DNA——假如兩條鏈均斷開，即為線狀DNA。質(zhì)粒DNA的提取和酶切第9頁(yè)質(zhì)粒DNA與宿主菌染色體DNA區(qū)分：宿主菌染色體DNA通常比質(zhì)粒DNA要大得多質(zhì)粒DNA的提取和酶切第10頁(yè)分離純化質(zhì)粒DNA

三個(gè)主要步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增（DNA擴(kuò)增與選擇）②細(xì)菌搜集與裂解搜集——高速離心方法③質(zhì)粒DNA純化

全部純化方法都是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀性質(zhì)。質(zhì)粒DNA的提取和酶切第11頁(yè)堿法抽提質(zhì)粒主要溶劑溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl組成.葡萄糖作用是增加溶液粘度,降低抽提過程中機(jī)械剪切作用,預(yù)防破壞質(zhì)粒.EDTA作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,預(yù)防DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子降解作用。Tris?Cl能使溶菌液維持溶菌作用最適PH范圍質(zhì)粒DNA的提取和酶切第12頁(yè)溶液Ⅱ：SDS、NaOHSDS作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性；NaOH作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液Ⅲ：KAc、HAc溶液Ⅲ能中和溶液Ⅱ堿性，使染色體DNA復(fù)性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。質(zhì)粒DNA的提取和酶切第13頁(yè)SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA原理：

在有EDTA、溶菌酶及SDS存在條件下，用堿處理細(xì)菌，能夠使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（染色體DNA、蛋白質(zhì)和RNA等）。

強(qiáng)堿環(huán)境能夠使細(xì)菌線性分子染色體DNA氫鍵斷裂，雙鏈解開變性，而質(zhì)粒DNA超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈并不完全分離質(zhì)粒DNA的提取和酶切第14頁(yè)再加入高濃度酸性鹽在有高鹽存在條件下：線性染色體DNA凝聚成不溶性沉淀物；變性蛋白質(zhì)與SDS和K+形成復(fù)合物也形成沉淀；小分子質(zhì)粒DNA卻呈天然構(gòu)型，能溶解在buffer中

經(jīng)過離心能夠把線粒體DNA、不穩(wěn)定大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起除去質(zhì)粒DNA的提取和酶切第15頁(yè)

假如要提升DNA純度，則能夠用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留蛋白質(zhì)。質(zhì)粒DNA的提取和酶切第16頁(yè)試驗(yàn)步驟：加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，1rpm×30s（可重復(fù)一次）

去上清（除凈），加入100μl溶液I，充分重懸

加入200μl溶液II，馬上、輕柔振蕩數(shù)次

加入150μl冰溶液III，震蕩10s，冰浴3~5min，1rpm×10min裂解細(xì)菌、釋放質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA的提取和酶切第17頁(yè)轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積飽和酚（約450μl）振蕩混勻，離心1rpm×10min轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積氯仿：異戊醇（共約450μl）振蕩混勻，離心1rpm×5min除去雜質(zhì)、純化質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA的提取和酶切第18頁(yè)轉(zhuǎn)移上清到新EP管

加入2倍體積乙醇（約800μl）混勻，冰浴15min離心1rpm×15min棄上清，

100μl70%乙醇洗沉淀，1rpm×2min

棄上清，靜置干燥，0.1×TE20μl溶解DNA酶切判定（10μl）保留（10μl）除去雜質(zhì)、純化質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA的提取和酶切第19頁(yè)常見問題：提取DNA不純，含有其它雜質(zhì)（蛋白、多糖）變性不充分；關(guān)鍵過程反應(yīng)時(shí)間過短；離心時(shí)間或速度不夠。提取DNA成涂布狀：操作過程中用力過猛，動(dòng)作粗暴；操作系統(tǒng)有污染?；煊腥旧wDNA：變性過程不完全試劑配置有問題。質(zhì)粒DNA的提取和酶切第20頁(yè)第二部分：酶切判定（雙酶切）質(zhì)粒DNA的提取和酶切第21頁(yè)反應(yīng)體系（20ml）試劑或樣品用量（ml）BamHI1HindIII1Buffer2H2O6pUC119-U610共10ml，配好多份之后再分裝質(zhì)粒DNA的提取和酶切第22頁(yè)酶切反應(yīng)試驗(yàn)操作酶切反應(yīng)液包含BamHI,HindIII,Buffer,H2O（已由準(zhǔn)備試驗(yàn)老師配好）每人一份，每份10μl將酶切底物（質(zhì)粒）與反應(yīng)液混合充分混勻，瞬時(shí)離心37?C，孵育1-3小時(shí)電泳檢測(cè)（下次進(jìn)行）質(zhì)粒DNA的提取和酶切第23頁(yè)基因工程誕生技術(shù)突破限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes）1970年H.O.Smith等分離出第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶。WernerArber理論預(yù)見限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片斷HamiltonO.Smith得到第一個(gè)限制酶1978年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)質(zhì)粒DNA的提取和酶切第24頁(yè)限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈核酸內(nèi)切酶起源：原核生物功效：自我保護(hù)——細(xì)菌限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）質(zhì)粒DNA的提取和酶切第25頁(yè)pUC119圖譜質(zhì)粒DNA的提取和酶切第26頁(yè)重組質(zhì)粒BamHIHindIII雙酶切電泳檢測(cè)5'-G

GATCC-3‘3‘-CCTACG-5'BamHI5'-AAGCTT-3'3'-TTCGAA-5'

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