應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法專家講座

應用鼠疫菌全基因組芯片

研究

黃連抑菌機制方法應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第1頁國內外研究現實狀況：李書寶.中國鼠疫監(jiān)測現實狀況及疫情態(tài)勢分析俞東征.我國鼠疫形勢與鼠疫控制策略沈爾禮,張葦,高崇華,等.關于美國、秘魯鼠疫防治工作考查匯報[J].HoltRD,DobsonAP,BegonM,etal.Parasiteestablishmentinhostcommunities[J].EcologyLetters,,6(9):8372842.PowerAG,MitchellCE.Pathogenspilloverindiseaseepidemics[J].AmericanNaturalist,,164Suppl:S79288.應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第2頁目標:建立一個應用鼠疫耶爾森菌全基因組芯片研究黃連對鼠疫耶爾森菌抑制作用分子機制方法。方法:應用液體稀釋法測定黃連對鼠疫耶爾森菌最小抑菌濃度(MIC)；鼠疫耶爾森菌全基因組芯片包含4005條鼠疫耶爾森菌基因。基因芯片表示譜試驗中黃連作用鼠疫耶爾森菌濃度為10×MIC，作用時間為30min；提取并純化鼠疫耶爾森菌總RNA；逆轉錄合成cDNA；Cy3、Cy5染料標識后，與鼠疫耶爾森菌全基因組芯片雜交；經過芯片掃描儀取得表示譜分析結果。應用SAM軟件處理結果，應用SAM軟件處理結果。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第3頁結論：應用鼠疫耶爾森菌全基因組DNA芯片能夠進行黃連抑制鼠疫耶爾森菌分子作用機制研究應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第4頁立項依據：鼠疫耶爾森菌(以下簡稱鼠疫菌)能夠引發(fā)烈性傳染病一鼠疫鼠疫，菌對常規(guī)抗生素敏感，鏈霉素、氯霉素及四環(huán)素是鼠疫菌治療首選藥品?？股赜行褂煤芎玫乜刂屏耸笠甙l(fā)生、流行以及蔓延。鏈霉素耐藥株出現使得鼠疫菌治療藥品研究變得尤為迫切。不停探索新治療藥品是擺在每一位鼠疫防治工作者面前光榮使命。前期研究結果表明，在傳統(tǒng)中藥中黃連對鼠疫菌有較強抑菌作用。為了繼續(xù)深入探討黃連抑制鼠疫菌作用機制，探索黃連應用于鼠疫預防與治療可能性，經過應用鼠疫菌全基因組芯片建立研究黃連抑制鼠疫菌分子機制方法。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第5頁哈爾濱1910年特大鼠疫應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第6頁應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第7頁1、材料與方法1、1試驗材料鼠疫菌201菌株為布氏田鼠疫源地菌株，該菌株對人體無感染性，對小鼠含有高度毒力；分離自錫林郭勒高原布氏田鼠鼠疫疫源地(軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所提供)。鼠疫菌全基因組基因芯片；由軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所提供；掃描儀；為ScanArray4100(AxonInstruments，Inc)

處理軟件；為GenePixPro4．1(AxonInstruments，Inc。)黃連提取物：購自西安中鑫生物技術有限企業(yè)。

應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第8頁1．

2黃連作用鼠疫菌最小抑菌濃度(MIC)測定黃連作用于鼠疫菌MIC測定采取液體稀釋法進行。準備系列含有1mlTMH液體培養(yǎng)基試管，將黃連配制成對應濃度后加入含有培養(yǎng)基試管中，以2倍比稀釋法逐管稀釋黃連，最終各管黃連濃度分別為0．1、0．05、0．025、0．0125、0．00625g／ml,在每個試管中加入1．5X10^8CFU／ml細菌10ul,試驗設空白及重復對照,28℃培養(yǎng)24h后，分別轉種普通瓊脂平板培養(yǎng)基，觀察細菌在平板培養(yǎng)基生長現象，無細菌生長試管濃度為黃連作用鼠疫菌MIC。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第9頁1．3鼠疫菌基因芯片表示譜試驗1．3．1試驗分組選擇黃連作用鼠疫菌組作為試驗組，等量生理鹽水相同條件作為對照組，進行基因芯片表示譜試驗。黃連作用鼠疫菌作用濃度為10×MIC。作用時間為30min。試驗分組應用系列重復設置，包含2個生物重復，以及2個技術重復。對不一樣分組采取不一樣熒光素交換標識。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第10頁1．3．2鼠疫菌RNA提取應用細菌RNA保護劑(QiagenInc)分別對試驗組與對照組細菌進行保護，確保細菌mRNA停留在進行保護時刻。分別應用MasterPureTMRNA提取試劑盒(EpicentreInc)進行試驗組與對照組鼠疫菌總RNA提取，提取RNA后經過分光光度計與凝膠電泳判定提取RNA質與量。

應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第11頁1．3．3探針標識采取FindGDPs軟件針對芯片上全部基因(4005個)為靶標設計全基因組特異引物(GDPs)，同時應用N6隨機引物，將二者等量混適用于總RNA逆轉錄。將取得cDNA用QIAquickPCRPurificationKit(QiagenInc)試劑盒純化，氨基標識cDNA熒光素標識，應用Cy3與Cy5分別標識試驗組與對照組cDNA，標識完成后應用QIAquickPCR純化試劑盒(QiagenInc)進行純化。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第12頁1．3．4芯片雜交與掃描雜交探針分別置于95℃變性5min，然后馬上將探針加在芯片上，蓋玻片封片置于雜交爐內42℃雜交16h。然后依次以2×SSC+O．2％SDS溶液、0．1％SSC+0．2％SDS溶液及0．1％SSC溶液各洗滌2min，電吹風吹干。用ScanArray4100掃描儀掃描芯片。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第13頁1．3．5結果分析利用GenePixPro4．1軟件對掃描熒光信號進行處理，首先確定樣點信號和背景噪音，計算各個樣點扣除背景后熒光信號值。剔除雙通道熒光信號中值小于2倍背景值數據，再采取整體歸一法對雙色熒光數據進行歸一化處理。應用SAM軟件對取得數據進行分析。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第14頁

結果：2．1黃連作用鼠疫菌MIC檢測黃連作用于鼠疫菌最小抑菌濃度MIC為0．025ml，對鼠疫森菌有較強抑菌作用。2．2芯片雜交芯片雜交后，開啟激光共聚焦掃描儀Genepix4100A掃描程序，分別用波長635nm和532nm進行雙通道掃描，讀取熒光信號后將圖保留。數據經過SAM軟件分析，共取得黃連作用鼠疫菌差異基因360個，其中上調333個，下調27個。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第15頁討論因為中藥特殊性，細菌極少對中藥產生耐藥。而且中藥還含有起源廣泛，費用低廉等優(yōu)勢。所以，研究和開發(fā)抗菌中藥對處理耐藥菌株產生與抗生素短缺問題含有主要現實與社會意義。黃連是一味含有廣泛藥效作用傳統(tǒng)中藥，經常在臨床上被用于降熱鎮(zhèn)痛、抗腸道細菌感染。黃連抗菌譜廣，很多細菌對其敏感。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第16頁應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第17頁如肺炎雙球菌、白喉桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌；大腸桿菌、傷寒桿菌、霍亂弧菌、淋球菌等革蘭陰性菌；以及白色念珠菌、紅色毛癬菌等真菌。黃連分布地域較廣，栽培簡便，資源豐富。所以，對黃連進行深入研究，擴大其藥效作用，將有很大社會效益和廣泛開發(fā)前景?；蛐酒夹g發(fā)展為進行黃連分子藥理學分析提供了一個有力平臺?；蛐酒前榘殡S人類基因組計劃發(fā)展起來一項高通量篩選技術，含有大規(guī)模、高通量和高平行等特點，利用基因芯片能夠進行疾病相關基因篩選、新基因功效研究、藥品作用機制研究及藥品靶點篩選等。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第18頁經過對研究取得數據進行生物信息學分析，能夠對黃連抑制鼠疫菌分子機制進行闡述，從而有望說明黃連抑菌分子作用機理。應用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機制的方法第19頁參考文件吳整軍，中醫(yī)藥抗感染治療探討[J]．中華醫(yī)院感染學雜志，，14(11)；1296～1297．ShawKJ，MillerN，LiuX，eta1Comparisonofthechan·gesinglobalgeneexpressionofEscherichiacoliindu