還原型谷胱甘肽專家講座

歡迎各位院系：任課老師：姓名：還原型谷胱甘肽專家講座第1頁還原型谷胱甘肽還原型谷胱甘肽專家講座第2頁菌株選育和發(fā)酵過程調(diào)控54還原型谷胱甘肽應(yīng)用及市場(chǎng)前景312還原型谷胱甘肽性質(zhì)與生理功效什么是還原型谷胱甘肽6還原型谷胱甘肽生產(chǎn)方法與工藝總結(jié)與展望主要內(nèi)容還原型谷胱甘肽專家講座第3頁1.走近谷胱甘肽.什么是谷胱甘肽？谷胱甘肽(glutathione)是一個(gè)含γ-酰胺鍵和巰基生物活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，其中半胱氨酸上巰基為其活性基團(tuán)。存在于幾乎身體每一個(gè)細(xì)胞之中。而且廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是生物體內(nèi)最主要非蛋白巰基化合物之一。還原型谷胱甘肽專家講座第4頁產(chǎn)谷胱甘肽微生物1921年Hopkins在酵母中首先發(fā)覺谷胱甘肽。隨即，谷胱甘肽化學(xué)結(jié)構(gòu)得到確定。日本等國家首先開始了發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽，因?yàn)椴煌８倪M(jìn)和提升發(fā)酵工藝，逐步在日本國內(nèi)實(shí)現(xiàn)了谷胱甘肽生產(chǎn)工業(yè)化，并使得微生物發(fā)酵法成為當(dāng)前最普遍使用生產(chǎn)方法。自然界中能較多在細(xì)胞內(nèi)累積谷胱甘肽微生物主要為酵母菌及革蘭陰性菌。產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌主要有：產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，面包酵母(Saccharomycescerevisiae)等。國內(nèi)外利用細(xì)菌生產(chǎn)谷胱甘肽報(bào)道比較少，代表為：藤黃八疊球菌(Sarcinalutea)，甲烷甲基單胞(Methylomonasmethanolvorens)，奇異變形桿菌(Proteusmirabiliss)。還原型谷胱甘肽專家講座第5頁谷胱甘肽分類

谷胱甘肽含有還原型(GSH)和氧化型(GSSG)，生物體內(nèi)大量存在并起主要作用是還原型谷胱甘肽（GSH），只有還原型谷胱甘肽才含有生理活性，而生物體內(nèi)氧化型谷胱甘肽需要還原后才能發(fā)揮其主要生理功效。所以我們?nèi)粘Ｋ腹入赘孰钠胀檫€原型谷胱甘肽。

還原型谷胱甘肽分子結(jié)構(gòu)還原型谷胱甘肽專家講座第6頁兩種谷胱甘肽之間關(guān)系，

氧化型谷胱甘肽還原型谷胱甘肽2分子GSH脫氫后以二硫鍵相連形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)在NADPH存在條件下，谷胱甘肽還原酶(GR)作用于GSSG還原生成GSH，反應(yīng)中NADPH起源于葡萄糖磷酸戊糖路徑；還原型谷胱甘肽專家講座第7頁2.還原型谷胱甘肽性質(zhì)與功效還原型谷胱甘肽理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征分子式：C10H17N3O6S分子量：307.32348熔點(diǎn)：為189～193°C，晶體呈無色透明細(xì)長粒狀，等電點(diǎn)為5.93。結(jié)構(gòu)特征：GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)過肽鍵形成，分子中有一特殊

γ一肽鍵，即由谷氨酸γ—COOH與半胱氨酸α一NH2縮合成肽鍵，它不一樣于蛋白質(zhì)分子中普通肽鍵。GSH為白色晶體，易溶于水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固體較為穩(wěn)定，而水溶液在空氣中則易被氧化。還原型谷胱甘肽專家講座第8頁GSH生物合成途經(jīng)及代謝調(diào)控合成路徑是在γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶催化合成。L—谷氨酸，L

—半胱氨酸在γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteinesynthetase，GSHⅠ）作用下合成γ—谷氨酸半胱氨酸(γ-glutamylcysteine，γ一ECG)，然后在谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase，GSHⅡ)作用下與甘氨酸反應(yīng)生成谷胱甘肽。還原型谷胱甘肽專家講座第9頁兩步反應(yīng)以下：

ATPATPL-Glu+L-CysL-γ-Glu-L-Cys+ADP+Pi（1）L-γ-Glu-L-Cys+GlyL-γ-Glu-L-Cys-Gly+ADP+Pi（2）還原型谷胱甘肽專家講座第10頁影響生物體內(nèi)GSH合成主要原因包含GSHⅠ與GSHⅡ活性和ATP供給。前者主要影響生物合成效率，后者決定了生產(chǎn)成本。在GSH生物合成過程中直接添加ATP經(jīng)濟(jì)上不適當(dāng)，所以在研究中需要引入有效ATP合成系統(tǒng)，與GSH合成系統(tǒng)耦合，提升效率降低成本。GSH在體內(nèi)生物合成在GSHⅠ作用下進(jìn)行，而且GSHⅠ受到谷胱甘肽產(chǎn)物反饋抑制，除此之外還受轉(zhuǎn)錄水平兩個(gè)調(diào)整子Yap1P和Skn7P控制。與之相反，GSHⅡ保守不受調(diào)控。還原型谷胱甘肽專家講座第11頁還原型谷胱甘肽生理功效GSH分子含有γ—谷氨?；突钚詭€基，是GSH許多主要生理功效結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。GSH在紅細(xì)胞中作為巰基緩沖劑存在，維持血紅蛋白和其它紅細(xì)胞蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基處于還原狀態(tài)。GSH還廣泛存在于其它正常細(xì)胞中，有很強(qiáng)親和力，能與各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝物結(jié)合，去除體內(nèi)氧自由基及其它自由基，含有保護(hù)肝細(xì)胞膜、促進(jìn)肝酶活性．抗氧化、解毒等作用，是人體細(xì)胞內(nèi)主要代謝調(diào)整物質(zhì)。GSH還在蛋白質(zhì)和DNA合成、物質(zhì)運(yùn)輸，酶活性、新陳代謝及細(xì)胞保護(hù)等生物學(xué)功效中起著直接或間接作用。它還是許多酶反應(yīng)輔基，可作為抗氧化劑保護(hù)生物分子蛋白巰基，去除體內(nèi)過多自由基，參加體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，含有解毒、預(yù)防糖尿病、癌癥及消除疲勞等作用。還原型谷胱甘肽專家講座第12頁還原型谷胱甘肽藥理作用還原型谷胱甘肽（GSH）激活各種酶【如巰基(-SH)酶等】，從而促進(jìn)糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝，并能影響細(xì)胞代謝過程；它可經(jīng)過巰基與體內(nèi)自由基結(jié)合，能夠轉(zhuǎn)化成輕易代謝酸類物質(zhì)從而加速自由基排泄，有利于減輕化療、放療毒副作用，對(duì)化療、放療療效無顯著影響，如保護(hù)腎小管免受順鉑損害主要機(jī)制為腎小管細(xì)胞內(nèi)含谷胱肽解毒時(shí)所需r-谷酰氨轉(zhuǎn)肽酶，而癌細(xì)胞卻無此酶，故在不影響GSH細(xì)胞毒效應(yīng)同時(shí)保護(hù)了正常組織但器官。且對(duì)放射性腸炎治療效果較顯著；對(duì)于貧血、中毒或組織炎癥造成全身或局部低氧血癥患者應(yīng)用，可減輕組織損傷，促進(jìn)修復(fù)。經(jīng)過轉(zhuǎn)甲基及轉(zhuǎn)丙氨基反應(yīng)，GSH還能保護(hù)肝臟合成、解毒、滅活激素等功效，并促進(jìn)膽酸代謝，有利于消化道吸收脂肪及脂溶性維生素（A、D、E、K）。還原型谷胱甘肽專家講座第13頁3.還原型谷胱甘肽應(yīng)用及市場(chǎng)前景三食品中應(yīng)用一臨床醫(yī)藥中應(yīng)用四化裝品中應(yīng)用.二在抗輻射上應(yīng)用

谷胱甘肽含有廣譜解毒作用，不但可用于藥品，更可作為功效性食品基料，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功效性食品廣泛應(yīng)用。GSH應(yīng)用還原型谷胱甘肽專家講座第14頁還原型谷胱甘肽在臨床藥品上應(yīng)用

當(dāng)前，已人工研制開發(fā)出了谷胱甘肽藥品，廣泛應(yīng)用于臨床，除利用其巰基以螯合重金屬、氟化物、芥子氣等毒素中毒外，還用在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白內(nèi)障和視網(wǎng)膜疾病等，作為治療或輔助治療藥品。近年來，西方科學(xué)家，尤其是日本學(xué)者發(fā)覺谷胱甘肽含有抑制艾滋病毒功效。最新研究還表明，GSH能夠糾正乙酰膽堿、膽堿酯酶不平衡，起到抗過敏作用，還可預(yù)防皮膚老化及色素從容，降低黑色素形成，改進(jìn)皮膚抗氧化能力并使皮膚產(chǎn)生光澤。還原型谷胱甘肽專家講座第15頁還原型谷胱甘肽在抗輻射上應(yīng)用輻射對(duì)生物體危害較大，長久接收射線輻照，輕易引發(fā)頭昏乏力、記憶力減退，心悸失眠多夢(mèng)，毛發(fā)脫落，皮膚干燥，骨關(guān)節(jié)酸痛，晶狀體混濁、肝臟腫大、齒齦出血、咳嗽等。還原型谷胱甘肽是一個(gè)內(nèi)源性放射防護(hù)物質(zhì)，含量高，其放射敏感性差；含量低，其放射敏感性強(qiáng)。原因是因?yàn)檫€原型谷胱甘肽本身是一個(gè)射線保護(hù)劑，它可使射線經(jīng)過直接作用和間接作用在生物體內(nèi)產(chǎn)生高活性各種自由基，經(jīng)過還原型谷胱甘肽作用后而淬滅。還原型谷胱甘肽專家講座第16頁還原型谷胱甘肽在食品中應(yīng)用GSH廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，如加入酸奶和嬰兒食品起類似維生素C穩(wěn)定作用；預(yù)防水果罐頭水果褐變；在面制品中起還原和強(qiáng)化氨基酸作用；縮短面包混揉時(shí)間；GSH在與谷氨酸鈉、核酸系呈味物質(zhì)或其混合物共存時(shí)含有肉類風(fēng)味；GSH可抑制肉食類、魚類和海鮮類食品核酸分解，延長保鮮期以及提升奶酪質(zhì)量，預(yù)防酪蛋白褐變。還原型谷胱甘肽專家講座第17頁還原型谷胱甘肽在化裝品中應(yīng)用絕大多數(shù)化裝品中含有鉛，在使用過程會(huì)刺激皮膚以及從容在皮膚上引發(fā)黑斑；當(dāng)機(jī)體衰老時(shí)，體內(nèi)各式各樣自由基生成增多，自由基作為人體垃圾，是人體內(nèi)主要內(nèi)毒素之一。因?yàn)镚SH能夠去除自由基、能夠螯合重金屬等內(nèi)外毒素，預(yù)防皮膚色素從容，預(yù)防新黑色素形成并降低其氧化，因而GSH適合用于延緩衰老而含有佳效。另外GSH化學(xué)本質(zhì)是小分子肽，所以它外用是輕易透過細(xì)胞膜而被皮膚吸收，它作為化裝品外用是很顯效。同時(shí)，GSH作為小分子肽，它內(nèi)服無須被消化即可吸收，所以GSH口服愈加有效。所以GSH不論內(nèi)用還是外作都含有良好養(yǎng)顏、美容、回春之效。還原型谷胱甘肽專家講座第18頁還原型谷胱甘肽市場(chǎng)前景1.國產(chǎn)谷胱甘肽占主導(dǎo)地位

還原型谷胱甘肽（GSH）于1995年由日本協(xié)和發(fā)酵株式會(huì)社與日本山之內(nèi)株式會(huì)社研制成功并上市。1999年，重慶藥友制藥粉針制劑在國內(nèi)獲批生產(chǎn)，隨即，昆明積大制藥、山東綠葉制藥還原型谷胱甘肽注射劑先后上市。至年5月，國內(nèi)已經(jīng)有26張生產(chǎn)批文，全部為制劑，谷胱甘肽進(jìn)口注冊(cè)批文共有12張，。

當(dāng)前，市場(chǎng)上還原型谷胱甘肽價(jià)格在4000/kg上下，國內(nèi)谷胱甘肽原料藥即使仍在研制開發(fā)中，據(jù)悉已經(jīng)有突破性進(jìn)展。谷胱甘肽原料大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)一直是國家大力扶持項(xiàng)目。還原型谷胱甘肽專家講座第19頁

年，國內(nèi)22個(gè)城市樣本醫(yī)院銷售注射用谷胱甘肽用藥市場(chǎng)已達(dá)3．31億元，增加率達(dá)12．05%（見圖）。在這一市場(chǎng)中，國產(chǎn)還原型谷胱甘肽粉針劑占據(jù)了主導(dǎo)地位，其中重慶藥友制藥阿拓莫蘭，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)谷胱甘肽粉針劑，山東綠葉制藥綠汀諾、昆明積大制藥松泰斯，四家占據(jù)了83%市場(chǎng)份額。而進(jìn)口品牌則分羹另外17%市場(chǎng)。從年樣本醫(yī)院統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，銷售額超出千萬元有12個(gè)城市（或地域）。用藥量最大是上海，其次是北京、珠三角（除廣州）、廣州和杭州，前5個(gè)城市（或地域）占這一品種總體市場(chǎng)半壁江山，達(dá)51.39%。用藥金額不足千萬元另外10個(gè)區(qū)域累計(jì)占據(jù)了13.35%。還原型谷胱甘肽專家講座第20頁-年注射用谷胱甘肽市場(chǎng)銷售額及增加率還原型谷胱甘肽專家講座第21頁2.用藥領(lǐng)域不停拓展

臨床顯示，谷胱甘肽在減輕腦組織缺血-再灌注損傷方面顯示出一定作用，可用于改進(jìn)急性腦中風(fēng)患者輔助治療，對(duì)心臟含有保護(hù)作用。與此同時(shí)，谷胱甘肽也是一個(gè)療效很好滴眼液，所以也為人工淚液、眼藥水等藥品提供了遼闊市場(chǎng)。同時(shí)，谷胱甘肽本藥活性成份為還原型谷胱甘肽，它在細(xì)胞內(nèi)參加氧化還原過程，起著SH酶賦活、輔酶作用，能預(yù)防紫外線誘發(fā)白內(nèi)障，抑制角膜潰瘍，并控制進(jìn)行性白內(nèi)障發(fā)展及視網(wǎng)膜病變。據(jù)某研究機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，年我國眼科用藥銷售額為61.65億元，比上年同期增加了10%。銷售藥品仍以抗感染、抗干眼病、抗青光眼等為主。另外，谷胱甘肽作為生物活性強(qiáng)化劑，在食物添加劑領(lǐng)域使用也日益受到人們重視，國外已開發(fā)了相關(guān)功效性食品。還原型谷胱甘肽專家講座第22頁總而言之，谷胱甘肽是一個(gè)頗有市場(chǎng)前景品種，不但在抗肝炎病毒藥、肝病輔助用藥及眼科用藥領(lǐng)域發(fā)揮了很好作用，而且醫(yī)學(xué)界已開始研究其在心血管及循環(huán)系統(tǒng)中應(yīng)用。伴隨肽類物質(zhì)研究不停深入，肽類物質(zhì)含有神奇功效不停被發(fā)覺，谷胱甘肽將成為值得關(guān)注主要品種。還原型谷胱甘肽專家講座第23頁酶轉(zhuǎn)化法發(fā)酵法化學(xué)合成法溶劑萃取法Vision01Vision03Vision02Vision044.還原型谷胱甘肽生產(chǎn)方法與工藝還原型谷胱甘肽專家講座第24頁化學(xué)合成法與萃取法提取GSH伴隨多肽合成技術(shù)日趨成熟，現(xiàn)已能用化學(xué)合成法合成GSH，不過化學(xué)合成法生產(chǎn)GSH操作過程復(fù)雜、耗時(shí)且得到GSH是左旋體和右旋體混合物，分離十分困難，造成產(chǎn)品純度不高，且生物效價(jià)極難保持一致，所以難以推廣。萃取法主要是從高含量谷胱甘肽動(dòng)植物組織中提取所采取一個(gè)方法,它是發(fā)酵法生產(chǎn)流程中下游過程基礎(chǔ)。能夠從鼠血、鼠肝和雞血、酵母、麥芽中提取GSH,但以酵母作原料居多。萃取法生產(chǎn)GSH所使用溶劑能夠是水、有機(jī)酸溶液和稀醇等。但因?yàn)樵喜灰兹〉们褿SH含量極低，所以該法實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。還原型谷胱甘肽專家講座第25頁微生物發(fā)酵法生產(chǎn)還原型谷胱甘肽發(fā)酵細(xì)胞破碎分離提取得到GSH微生物細(xì)胞內(nèi)含有GSH，且發(fā)酵周期短、操作簡(jiǎn)單、成本低，發(fā)酵法就是采取廉價(jià)糖類原料，利用微生物體內(nèi)物質(zhì)代謝路徑來進(jìn)行GSH生物合成方法?；竟に囈韵拢浩胀ㄇ闆r下，微生物細(xì)胞中GSH含量不高（僅為干重0.5%~1%)，

過高含量GSH輕易破壞體內(nèi)業(yè)已平衡氧化還原環(huán)境。發(fā)酵法產(chǎn)GSH關(guān)鍵問題在于怎樣提升細(xì)胞密度以及細(xì)胞內(nèi)GSH含量，二者有機(jī)結(jié)合將有利于GSH產(chǎn)量大幅度提升。還原型谷胱甘肽專家講座第26頁菌株選育采取常規(guī)誘變育種選育高產(chǎn)菌株利用遺傳工程技術(shù)構(gòu)建含有GSH合成酶活性基因工程菌細(xì)胞密度提升可經(jīng)過對(duì)發(fā)酵過程優(yōu)化控制（包含高密度培養(yǎng)）取得，而胞內(nèi)GSH含量提升通常是由菌種選育來實(shí)現(xiàn)，主要有兩種方法方法一方法二因?yàn)榘l(fā)酵法所使用細(xì)菌或酵母輕易培養(yǎng)，加之生產(chǎn)方法及工藝不停改進(jìn)和完善，所以采取微生物發(fā)酵法已成為當(dāng)前GSH工業(yè)化生產(chǎn)最普遍方法。還原型谷胱甘肽專家講座第27頁⑴常規(guī)誘變育種到當(dāng)前為止,針對(duì)GSH生產(chǎn)酵母菌株而進(jìn)行物理或化學(xué)處理方法大致有紫外線、X射線、γ射線以及亞硝基胍等,而培養(yǎng)基中特定篩選物質(zhì)(篩子)主要包含蛋氨酸、L-乙硫氨酸、DL-乙硫氨酸、1,2,4三氮唑、氰化鈉、亞硫酸鹽、酰胺和靛酚等。經(jīng)過一系列對(duì)菌株改良及選育工作,取得了很多GSH高產(chǎn)菌株。還原型谷胱甘肽專家講座第28頁還原型谷胱甘肽專家講座第29頁⑵構(gòu)建工程菌構(gòu)建含有GSH合成酶活性基因工程菌兩種方法2.酵母基因重GSH在細(xì)胞內(nèi)特殊生理功效使其對(duì)本身合成產(chǎn)生反饋抑制，用誘變伎倆和構(gòu)建基因工程菌株來減弱或消除這種反饋抑制非常主要。近年頗受重視是將編碼GSH合成酶系基因克隆到大腸桿菌或酵母中。1.E．coli基因重組還原型谷胱甘肽專家講座第30頁E.Coli基因重組方法E．coli菌種細(xì)胞中GSH含量雖較酵母少，但它遺傳背景清楚、簡(jiǎn)單，基因操作方便，菌體繁殖較快。為了消除GSH對(duì)GSH合成酶Ⅰ(GSH-Ⅰ）反饋抑制，Murata從E．coli中篩選了1株GSH-Ⅰ脫敏突變株，從中克隆了GSH-Ⅰ基因(gshⅠ)并在E．coliBRC912表示，使此株GSH合成活性大為提升，產(chǎn)量達(dá)4．81pmol／g(濕細(xì)胞)。GSH-Ⅰ活性提升后，GSH-Ⅱ就成了合成GSH限速酶。沈立新等構(gòu)建了含有g(shù)shⅠ和GSH-Ⅱ基因(gshⅡ)重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)入E．coli細(xì)胞，分步進(jìn)行γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽合成，合成率達(dá)3．78g／L，比同時(shí)轉(zhuǎn)入合成率高42．1％，既處理GSH-Ⅰ和GSH一Ⅱ在同一菌株中克隆表示相互影響矛盾，又處理了GSH對(duì)GH-Ⅰ反饋抑制，降低了ADP對(duì)第二步反應(yīng)抑制程度。還原型谷胱甘肽專家講座第31頁②酵母基因重組方法酵母糖酵解產(chǎn)生ATP是GSH合成過程中不可少能量供體。利用基因工程伎倆增加酵母中GSH合成酶系活性是提升GSH合成率另一有效路徑。Tazuka等將E．coliB中g(shù)shⅠ基因片段與S．cerevisiae981個(gè)開啟子融合，融合GSH-Ⅰ在酵母中表示，結(jié)果GSH-Ⅰ活性和GSH含量分別提升了100多倍和3倍多。Christine將帶有g(shù)shⅠ、gshⅡ各1個(gè)拷貝質(zhì)粒PINEⅢ轉(zhuǎn)化入啤酒酵母，GSH產(chǎn)量到達(dá)細(xì)胞總干重1．8％，大大高于對(duì)照菌株。另外，經(jīng)過優(yōu)化菌株培養(yǎng)表示條件也可提升GSH產(chǎn)量。有研究經(jīng)過反饋控制乙醇濃度流加葡萄糖，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵后期添加3種氨基酸配比和濃度進(jìn)行釀酒酵母T65補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)GSH，產(chǎn)量到達(dá)2．19g／L。還原型谷胱甘肽專家講座第32頁

衛(wèi)功元等研究了溫度、pH、溶氧和補(bǔ)料流加速度對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)GSH影響，發(fā)覺較高溫度對(duì)細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，較低溫度則更有利于提升GSH產(chǎn)量，pH5.5時(shí)對(duì)細(xì)胞生長和GSH合成均最正確，恒溶氧控制發(fā)酵可顯著提升細(xì)胞干重和GSH產(chǎn)量，當(dāng)恒溶氧濃度35％時(shí)，二者提升幅度可分別到達(dá)22％和30％，指數(shù)流加是較理想補(bǔ)料方式。經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)，GSH產(chǎn)量達(dá)857．2mg／L。除ECoti和酵母外，傅瑞燕等構(gòu)建了重組乳酸乳球菌生產(chǎn)GSH，用乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)4h后，胞內(nèi)GSH含量到達(dá)358nmol／mg蛋白質(zhì)。還原型谷胱甘肽專家講座第33頁培養(yǎng)基成份

碳源：

碳源作為滿足微生物生長需要最基本營養(yǎng)要素，糖類物質(zhì)成為研究重點(diǎn)。酵母菌能很好利用蔗糖、葡萄糖，也可利用木糖，但基本不利用乳糖。衛(wèi)功元等對(duì)葡萄糖、蔗糖、乙酸、乙醇、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉等物質(zhì)進(jìn)行考查，結(jié)果顯示蔗糖比較適適用于促進(jìn)細(xì)胞生長，而葡萄糖更有利于促進(jìn)GSH合成，所以選擇葡萄糖作為碳源。還原型谷胱甘肽專家講座第34頁

氮源：氮源經(jīng)過對(duì)牛肉膏，蛋白胨等有機(jī)氮源及硫酸銨，尿素等無機(jī)氮源比較得出單一無機(jī)氮源存在條件下，細(xì)胞生長及谷胱甘肽合成均優(yōu)于有機(jī)氮源，尿素在8g／L時(shí)，谷胱甘肽產(chǎn)量(150mg／L)和胞內(nèi)谷胱甘肽含量(2．82％)到達(dá)最高，而硫酸銨濃度在10L時(shí)，細(xì)胞生長(7．0g／L)最理想。劉娟

等在確定蛋白胨對(duì)融合菌株生產(chǎn)谷胱甘肽影響基礎(chǔ)上研究了不一樣濃度無機(jī)氮源硫酸銨、氯化銨及尿素，發(fā)覺均無顯著影響。還原型谷胱甘肽專家講座第35頁前體：前體各種氨基酸均能促進(jìn)酵母生長，提供必要營養(yǎng)物質(zhì)，但卻并非均能促進(jìn)谷胱甘肽合成，所以學(xué)者研究在發(fā)酵過程加入適當(dāng)百分比3種前體氨基酸使之既能促進(jìn)酵母菌體生長又能促進(jìn)谷胱甘肽生物合成。Wen等利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究在S．cerevisiaeT65菌株培養(yǎng)基中添加最正確前體濃度為谷氨酸10mmol／L，甘氨酸18mmol／L，半胱氨酸3．35mmol／L，同時(shí)在培養(yǎng)過程中先加入2mmol／L半胱氨酸，再按最正確百分比加入前體，使得谷胱甘肽產(chǎn)量到達(dá)329．3mg／L。還原型谷胱甘肽專家講座第36頁發(fā)酵條件優(yōu)化環(huán)境條件也是發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽不容忽略主要原因,其中影響細(xì)胞GSH含量環(huán)境參數(shù)主要包含溫度、溶解氧、pH等。溫度直接影響代謝過程中各種酶活性,代謝反應(yīng)速率,菌體生長量。衛(wèi)功元等研究表明,較高溫度能夠降低底物對(duì)菌體生長抑制,有利于細(xì)胞生長,而低溫更有利于谷胱甘肽生物合成。童群義等在重組大腸桿菌培養(yǎng)過程中提出了溫度分階段培養(yǎng)策略,即前期控制37℃培養(yǎng)菌體,后期降低溫度增加酶生物合成。氧氣濃度對(duì)細(xì)胞生長和GSH合成有顯著影響,首先影響著微生物生長,另首先對(duì)用。衛(wèi)功元等研究了發(fā)酵罐中溶氧對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母對(duì)分批發(fā)酵生產(chǎn)GSH影響,當(dāng)葡萄糖濃度為30g/L,且通氣量控制在5L/min時(shí),攪拌轉(zhuǎn)速到達(dá)300r/min即可滿足細(xì)胞生長和谷胱甘肽合成對(duì)溶解氧需求。發(fā)酵液中pH對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)解離狀態(tài)、酶活性、代謝速率有著主要影響,所以pH也是制約GSH生產(chǎn)一個(gè)關(guān)鍵原因。衛(wèi)功元等研究了pH對(duì)谷胱甘肽發(fā)酵影響,結(jié)果表明,當(dāng)pH值控制在5.5時(shí)谷胱甘肽總產(chǎn)量最高。

溫度

溶解氧pH還原型谷胱甘肽專家講座第37頁發(fā)酵過程調(diào)控葡萄糖流加策略前體物質(zhì)添加

發(fā)酵過程調(diào)控分兩個(gè)方面還原型谷胱甘肽專家講座第38頁葡萄糖流加策略

GSH生成與發(fā)酵液中葡萄糖消耗親密相關(guān)。研究發(fā)覺,只有在葡萄糖幾乎耗盡、生長停頓時(shí),細(xì)胞內(nèi)才開始大量合成GSH;且因?yàn)镚SH是胞內(nèi)產(chǎn)物,所以在提升生產(chǎn)菌株胞內(nèi)合成GSH能力同時(shí),還需要在發(fā)酵過程中設(shè)法提升細(xì)胞數(shù),以提升GSH總產(chǎn)量。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),必須加大底物(如葡萄糖)質(zhì)量濃度。但過高葡萄糖濃度會(huì)產(chǎn)生葡萄糖

效應(yīng),抑制細(xì)胞生長而且目標(biāo)產(chǎn)物得率會(huì)大大下降,所以普通采取后期限量流加葡萄糖方法,以消除底物抑制,到達(dá)高密度細(xì)胞培養(yǎng)、延長GSH生產(chǎn)時(shí)間目標(biāo)。還原型谷胱甘肽專家講座第39頁1.恒速流加2.指數(shù)流加3.反饋控制流加當(dāng)前應(yīng)用最多葡萄糖流加策略有三個(gè)方面：還原型谷胱甘肽專家講座第40頁前體物質(zhì)添加

在前體氨基酸中,半胱氨酸為GSH合成關(guān)鍵氨基酸,它存在能顯著提升細(xì)胞內(nèi)GSH含量及GSH比生產(chǎn)速率,但妨礙細(xì)胞量增加。在發(fā)酵過程中半胱氨酸補(bǔ)加策略應(yīng)以盡可能降低對(duì)生長抑制為標(biāo)準(zhǔn)。普通有兩種補(bǔ)加方式:(1)連續(xù)流加，保持發(fā)酵液中半胱氨酸濃度恒定。(2)定時(shí)補(bǔ)充。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到比生長速率基本穩(wěn)定時(shí)，加入少許高濃度半

胱氨酸溶液。加入時(shí)間選擇在發(fā)酵第2階段剛開始時(shí)。

還原型谷胱甘肽專家講座第41頁酶工程法合成GSH用分離提取酶或游離細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，降低了細(xì)胞代謝副產(chǎn)物對(duì)分離提取影響，簡(jiǎn)化了下游工藝。早期研究中用去污劑和溶壁酶處理啤酒酵母增大細(xì)胞通透性，加入含有葡萄糖、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸等前體反應(yīng)液，GSH產(chǎn)量大大增高，達(dá)9.06g/L。也有些人將經(jīng)甲苯通透處理后重組E.coli與干酵母細(xì)胞一起加入反應(yīng)體系，GSH含量達(dá)5mg/mL。因?yàn)橛坞x酶難以重復(fù)使用，并影響產(chǎn)物分離提取，故用固定化酶催化合成GSH。將自溶后啤酒酵母分離出GSH合成酶，用聚丙烯酰胺凝膠包埋后加入反應(yīng)液，半胱氨酸轉(zhuǎn)化率為87％（游離酶為47％），且穩(wěn)定性提升。還原型谷胱甘肽專家講座第42頁用固定化細(xì)胞法含有特定優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)椋海?）GSH合成酶是雙酶體系，酶分離提取愈加繁瑣，用固定化細(xì)胞催化合成GSH防止了繁雜酶分離過程；（2）GSH合成過程需ATP作能量供體，實(shí)際生產(chǎn)過程中不可能直接加入ATP，而且ATP利用后生成ADP對(duì)GSH-Ⅰ及GSH-Ⅱ有抑制作用，所以，提供適當(dāng)ATP再生體系不論從經(jīng)濟(jì)角度還是從酶反應(yīng)角度均較為合理。ATP再生由酶系完成，固定化細(xì)胞能夠利用對(duì)應(yīng)菌株細(xì)胞內(nèi)ATP再生酶系和GSH合成酶系，經(jīng)過偶聯(lián)或與其它GSH合成酶活性較高菌株固定化細(xì)胞種間聯(lián)合成GSH，其優(yōu)勢(shì)是固定化酶法合成GSH無法比擬。還原型谷胱甘肽專家講座第43頁GSH不一樣合成方法比較與偶聯(lián)與固定化酵母生產(chǎn)GSH相比，含GSH合成酶系重組E.coli含有穩(wěn)定性好、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但須處理GSH合成過程中ATP再生問題。已經(jīng)有許多ATP再生方法和GSH酶反應(yīng)偶聯(lián)合成GSH。利用E.coli細(xì)胞乙酸激酶GSH合成酶系，以乙酰磷酸為磷酸供體將ADP等再生為ATP，合成GSH，偶聯(lián)效果很好。但乙酰磷酸成本較高且不穩(wěn)定，難以工業(yè)化生產(chǎn)。沈立新等用卡拉膠固定E.coli生產(chǎn)GSH，優(yōu)化條件下罐式反應(yīng)器GSH產(chǎn)量為0.84g/L，穩(wěn)定性很好；另外，與酵母生產(chǎn)ATP體系相偶聯(lián)共固定化體系在填充床中反應(yīng)，GSH合成量達(dá)1.24g/L，收率比直接加入ATP提升24.2%。童群義等將E.coli與啤酒酵母用PVA-卡拉膠混合載體固定生產(chǎn)GSH，比單一固定E.coli或單一固定