綜合化學實驗天然產(chǎn)物提取

綜合化學實驗天然產(chǎn)物提取第1頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日1天然產(chǎn)物的提取方法2天然產(chǎn)物的分離純化方法3天然產(chǎn)物的化學成分鑒定及結(jié)構(gòu)表征本章基本內(nèi)容第2頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日天然產(chǎn)物有效成分的提取、分離、鑒定及結(jié)構(gòu)表征是研究天然產(chǎn)物中有效成分時必不可少的內(nèi)容。研究天然產(chǎn)物的有效成分時，首先要將其中的有效成分提取出來，但多數(shù)是得到多種成分的混合物，因此要經(jīng)過一系列的分離，只有在得到單一組分（單體）后，才可以進行成分的結(jié)構(gòu)分析和表征。提取與分離方法都有多種，可根據(jù)自己具有的條件來選擇，而結(jié)構(gòu)表征則較為復雜，所用儀器設(shè)備往往很特殊和昂貴。本課程僅介紹常用方法。第3頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日1天然產(chǎn)物的提取方法天然產(chǎn)物中有效成分的提取方法很多，而且大多方法簡單易做。常用的主要有如下五大類：┌壓榨法

├溶劑提取法提取方法類型┼水蒸氣蒸餾法

├升華法

└超臨界流體萃取法

第4頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日通過壓榨的方法提取有效成分，是一種單純的物理操作過程。優(yōu)點：方法簡單、操作方便、不破壞有效成分的性質(zhì)。缺點：提取得到混合物，雜質(zhì)多、成分復雜，提取不完全，得率低；此法用于新鮮原料中成分的提取。如：從新鮮桔皮中榨取香精油、大豆榨油等。日常的榨油、甘蔗榨汁、果蔬榨汁等也是。2.1.1壓榨法簡易壓榨設(shè)備第5頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日1.2溶劑提取法天然物中有效成分提取最常用的方法（一）溶劑提取法原理——“相似相溶”

選用什么樣的溶劑？取決于被提取成分的化學結(jié)構(gòu)、溶解性及溶劑的性質(zhì)。

但應注意：乙醇、甲醇雖然屬于親水性溶劑，可與水混溶，但很多親脂性成分可溶于乙醇、甲醇，所以乙醇或甲醇提取液中既有水溶性成分，也有很多脂溶性成分乙醇或甲醇中可加入水配成不同濃度的乙醇或甲醇，根據(jù)提取成分的情況可選用適當濃度的醇進行提取。第6頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日常用溶劑的分類可分為三類1.強極性溶劑（水及酸水或堿水等）適合提取無機鹽、可溶性糖、多酚類、氨基酸、水溶性蛋白質(zhì)、有機酸鹽、生物堿鹽、苷類等。2.弱極性溶劑（親水性有機溶劑）如甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、丙酮(Me2CO)適合提取極性小的成分，但滲透性差，易燃、易揮發(fā)，常有毒性；樣品中水分多則提取效果差。第7頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日3.非極性溶劑（親脂性有機溶劑）如乙醚（Et2O）、氯仿（CHCl3）、乙酸乙酯（EtOAc）、苯、石油醚、環(huán)己烷等適合提?。撼鞍踪|(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉與部分多糖外，大多可溶；部分脂溶成分亦可溶。通過調(diào)節(jié)乙醇濃度、加酸、加堿可改變分離效果。常見溶劑極性的強弱順序：石油醚＞苯＞乙醚＞氯仿＞乙酸乙酯＞丙酮＞乙醇＞甲醇＞水＞酸水或堿水8常用溶劑的分類第8頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日影響提取效率的因素影響提取效率的因素溶劑類型原料的粉碎度提取時間提取溫度提取次數(shù)固液比設(shè)備條件第9頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日溶劑提取法的操作方式通常是用極性不同的溶劑對原料分別進行多次提?。ㄒ话?～3次）具體做法一般為：先用非極性溶劑提取，再用弱極性溶劑提取，最后用強極性溶劑提取。常用操作方式浸漬滲漉煎煮回流提取連續(xù)回流提取第10頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日1.浸漬：操作方法：將處理（挑選、清洗、粉碎等）過的原料，用適當?shù)娜軇┰诔鼗蚣訜幔ㄒ话銥?0～80℃）的條件下浸泡以溶出其中成分。適用情況：適用于較易提取的、有效成分遇熱易破壞以及含多量淀粉、樹膠、果膠、粘液質(zhì)的天然物的提取。特點：浸出率較差，特別是用水為溶劑，其提取液易于發(fā)霉變質(zhì)，須注意加入適當?shù)姆栏瘎?。?1頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日2.滲漉：操作方法：向原料粗粉中不斷添加溶劑，使其滲過原料，從滲漉筒下端出口流出浸出液的一種浸出方法。

當溶劑滲進原料溶出成分比重加大而向下移動時，上層的溶液或稀浸出液便置換其位置，造成良好的濃度差，使擴散能較好地進行，特點：浸出效率較高，浸出液較澄清。溶劑消耗量大、費時長。第12頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日3.煎煮：操作方法：將天然物原料粗粉加水加熱煮沸，使其成分提取出來的方法。特點：此法簡便，原料中大部分成分可被不同程度地提出，但含揮發(fā)性成分及有效成分遇熱易破壞的原料不宜用此法，對含有多糖類原料，煎煮后，溶液比較粘稠，過濾比較困難。4.回流提?。翰僮鞣椒ǎ河靡讚]發(fā)的有機溶劑加熱回流提取。特點：溶劑消耗較少，浸出效率較高。但受熱易破壞的成分不宜用此法，且溶劑消耗量仍大，操作較麻煩。

第13頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日5.連續(xù)回流提?。簽榱藦浹a回流提取法中需要溶劑量較大、操作較麻煩的不足，可采用連續(xù)回流提取法。實驗室常用脂肪提取器或稱索氏提取器。特點：節(jié)約溶劑，提取率高；但提取液受熱時間長，受熱易分解的成分不宜用此法。第14頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日溶劑提取法中的輔助提取新技術(shù)1.微波提取法微波：頻率為3×108~3×1013Hz(波長1m~1mm)的電磁波。原理：有效成分在微波電磁場中快速轉(zhuǎn)向及定向排列，從而產(chǎn)生撕裂、相互磨擦導致發(fā)熱，保證能量快速傳遞與充分利用，實現(xiàn)組分的快速釋放、溶出。特點：可透過絕緣體，不能進入導體，能被介質(zhì)吸收，且與介質(zhì)極性相關(guān)。密閉式微波萃取/合成系統(tǒng)

工業(yè)生產(chǎn)用微波提取罐第15頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日要求：材料有一定含水量，組分對熱穩(wěn)定且有一定極性。優(yōu)點：選擇性高、重現(xiàn)性好、溶劑消耗少、回收率高、污染小、時間短。提取條件：溶劑(對微波透明)、功率、提取時間。應用：揮發(fā)油、苷、多糖、萜類、生物堿、黃酮、單寧、甾體、有機酸。實例：薄荷油提取。剪碎的新鮮薄荷葉放入盛有正已烷的玻璃杯中，微波提取20秒，薄荷油即釋放到正已烷中。與乙醇提取法相比，產(chǎn)品中不含葉綠素和薄荷酮。與水蒸氣蒸餾2小時及索氏提取6小時效果相當。第16頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日2.超聲提取法原理：超聲波為彈性機械振動波，能產(chǎn)生強烈振動，有高速強烈的空化效應（大量超聲波作用于提取介質(zhì)，振動處于稀釋狀態(tài)時，介質(zhì)被撕裂成許多小空穴，因其瞬時閉合會產(chǎn)生高達幾千大氣壓的瞬時高壓）、攪拌作用，破壞材料細胞，溶劑滲入細胞中加速有效成分的溶解。特點：提取時間短，不需加熱。適于小規(guī)模實驗。3.酶法提取植物樣品中用纖維素酶破壞細胞壁，加速成分的溶出。實驗室用小型超聲儀工業(yè)生產(chǎn)用超聲儀第17頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日4.常溫超高壓技術(shù)

高壓生物化學研究證明：壓力達到一定值，蛋白質(zhì)、多糖（淀粉、纖維素）等有機大分子會發(fā)生變性，但生物堿、低聚糖、甾、萜、維生素等小分子物質(zhì)則不發(fā)生任何變化。超高壓提取就是利用了超高壓對生物材料的這種作用而實現(xiàn)有效成分提取的。植物細胞壁上有很多微孔，因此我們可以把植物細胞壁看作是由許多微孔組成的薄膜。當植物細胞處于溶劑中時，溶劑將通過這些微孔進入細胞內(nèi)部。常溫超高壓提取技術(shù)可以使用多種溶劑，包括水、不同濃度的醇和其它有機溶劑，可以從不同的天然產(chǎn)物中提取不同性質(zhì)的有效成分（如生物堿、黃酮、皂苷、多糖、揮發(fā)油）。18第18頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日1.3水蒸氣蒸餾法此類成分的沸點多在100℃以上，但在100℃左右應有一定的蒸氣壓。天然物中的揮發(fā)油、某些小分子生物堿（如麻黃堿、煙堿、檳榔堿）以及某些小分子的酚性物質(zhì)（如牡丹酚）等的提取可采用水蒸氣蒸餾。19只適用于具有揮發(fā)性能隨水蒸氣蒸出而不被破壞與水不發(fā)生反應難溶或不溶于水等成分的提取第19頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日20共水蒸餾裝置第20頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日1.4升華法某些固體物質(zhì)（如水楊酸、苯甲酸、樟腦等）受熱后，在低于其熔點的溫度下，不經(jīng)過熔化就可直接轉(zhuǎn)化為蒸氣，蒸氣遇冷后又凝結(jié)為固體稱為升華。天然物中有一些成分具有升華性，能利用升華的方法直接從中藥中提取出來。如從樟木中升華的樟腦，在《本草綱目》中已有詳細記載，為世界上最早應用升華法制取藥材有效成分的記述。21第21頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日又如茶葉中的咖啡因具有升華性，可將茶葉放在大小適宜的燒杯中，上面用圓底燒瓶盛水冷卻，然后加熱，到一定溫度（178℃），咖啡因可凝結(jié)于燒瓶底部，成白色針狀結(jié)晶。天然物中的成分一般很少可升華。22常壓升華裝置圖第22頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日

1、將茶葉與95%乙醇回流2h；2、濾出茶葉，濃縮提取液至適當體積；3、濃縮液與生石灰粉混合，攪成漿狀，用蒸發(fā)皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸發(fā)皿上蓋一張刺孔向上的濾紙，再在濾紙上罩一個大小適合且頸部塞有棉花的漏斗；5、用酒精燈隔石棉網(wǎng)加熱，適當控制溫度，白色咖啡因在濾紙上結(jié)晶。實驗室提取咖啡因步驟：第23頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日

第24頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日近年來發(fā)展起來的一種新提取方法。是利用流體在超臨界下具有的氣液雙重性質(zhì)，使物質(zhì)的溶解性發(fā)生劇變，從而對成分進行提取。改變提取的溫度、壓力或加入夾帶劑，可實現(xiàn)不同極性組分的分離。此法有很多優(yōu)點，也有局限性，需要特殊的設(shè)備。25美國SFT-150型超臨界萃取儀1.5超臨界流體提取(SFE)法第25頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日

操作流程：控制T、p，得SF浸提，固液分離梯度減壓不同性質(zhì)組分分離第26頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日

CO2

鋼瓶

冷溫槽

高壓泵恒溫箱

控溫面板

接受瓶

流量計

CO2

原料

玻璃珠

脫脂棉

萃取柱

超臨界CO2

萃取實驗裝置示意圖第27頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日超臨界流體萃取有以下突出的優(yōu)點：(1)可以在接近室溫(35-40℃)及CO2氣體籠罩下進行提取，有效地防止了熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散。因此，在萃取物中保持著藥用植物的全部成分，而且能把高沸點，低揮發(fā)度、易熱解的物質(zhì)在其沸點溫度以下萃取出來；(2)使用SFE是最干凈的提取方法，由于全過程不用有機溶劑，因此萃取物中絕無殘留溶媒，同時也防止了提取過程對人體的毒害和對環(huán)境的污染，是100%的純天然；第28頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日(3)萃取和分離合二為一，當飽含溶解物的CO2-SCF流經(jīng)分離器時，由于壓力下降使得CO2與萃取物迅速成為兩相（氣液分離）而立即分開，不僅萃取效率高而且能耗較少，節(jié)約成本；(4)CO2是一種不活潑的氣體，萃取過程不發(fā)生化學反應，且屬于不燃性氣體，無味、無臭、無毒，故安全性好；(5)CO2價格便宜，純度高，容易取得，且在生產(chǎn)過程中循環(huán)使用，從而降低成本；(6)通過改變溫度或壓力可達到萃取目的。壓力固定，改變溫度可將物質(zhì)分離；反之溫度固定，降低壓力也可使萃取物分離。第29頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日2天然產(chǎn)物的分離純化方法有時，天然物提取液經(jīng)濃縮（或不濃縮）后，較長時間放置，就可析出沉淀，再經(jīng)重結(jié)晶可得單體成分，但這是個別現(xiàn)象，如從槐米中提取蘆丁。如果要得到更多的成分，或者要系統(tǒng)地研究一種天然物中的化學成分，則需經(jīng)過比較復雜的過程，一般是經(jīng)過初步分離純化，得到某一類型的總成分（混合物），或者得到極性相近的一類混合物，再經(jīng)過進一步分離得到單體成分。分離方法有很多種。第30頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日31分離純化方法類型系統(tǒng)溶劑分離法兩相溶劑萃取法沉淀法鹽析法分餾法結(jié)晶法色譜法（可同時進行鑒定）其他新技術(shù)第31頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日系統(tǒng)溶劑分離法原理：相似相溶。也用于提??！較常用的做法是將天然物的乙醇或甲醇提取液適當濃縮后，與某種擔體（也叫固定相，如硅藻土、硅膠等）混合均勻，干燥后，用極性不同的溶劑，按極性由小到大分別提取。然后再選擇適當方法進行分離。也可以將天然物粗粉直接用極性不同的溶劑分別提取，得各個部分。按溶劑的極性梯度變化或pH梯度變化操作。有效成分及較適用的提取溶劑見下表。第32頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日有效成分及其較適用的提取溶劑成分的極性成分的類型提取溶劑強親脂性（極性?。]發(fā)油、脂肪油、蠟、脂溶性色素、甾醇類、某些苷元石油醚、己烷親脂性苷元、生物堿、樹脂、醛、酮、醇、醌、有機酸、某些苷類乙醚、氯仿中等極性小中大某些苷類（如強心苷等）某些苷類（如黃酮苷等）某些苷類（如皂苷、蒽醌苷等）氯仿：乙醇（2:1）

乙酸乙酯

正丁醇親水性極性很大的苷、糖類、氨基酸、某些生物堿鹽丙酮、乙醇、甲醇強親水性蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、糖類、氨基酸、無機鹽類水33第33頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日兩相溶劑萃取法原理：相似相溶。為液-液兩相！萃取法是利用混合物中各成分在互不混溶的溶劑中分配系數(shù)不同而分離的方法。可將被分離物溶于水中，用與水不混溶的有機溶劑進行萃取，也可將被分離物溶在與水不混溶的有機溶劑中，用適當pH的水液進行萃取，達到分離的目的。又有多種具體操作方法。第34頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日(一)簡單萃取法常采用的方法是將水提取液適當濃縮，或?qū)⒁掖迹状迹┨崛∫哼m當濃縮，回收醇后，加入適量水，用極性不同的與水不混溶的有機溶劑，極性由小到大，分別進行萃取，分別回收溶劑得到極性不同的萃取物。如選用石油醚（或己烷）、氯仿（或乙醚）、乙酸乙酯、正丁醇，分別進行萃取，在某些情況下也可只選1～2種溶劑進行萃取。分離堿性成分（生物堿）或酸性成分，可調(diào)節(jié)溶液的pH值后再進行萃取是常用的方法。操作簡單，一般用分液漏斗即可進行！但效率低。35第35頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日36萃取分液

倒轉(zhuǎn)分液漏斗分液漏斗架振蕩第36頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日(二)連續(xù)萃取法為克服使用分液漏斗多次萃取的操作麻煩，可采用連續(xù)萃取器。這一儀器利用兩溶劑的比重不同，自然分層和分散相液滴穿過連續(xù)相溶劑時發(fā)生傳質(zhì)。選擇連續(xù)萃取法時，需視所用溶劑的比重大于或小于被提取的水溶液比重的情況，而采用不同式樣的儀器。37輕溶劑上行重溶劑下行第37頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日(三)pH梯度萃取法用pH不同的溶劑依一定pH變化次序（升高或降低）對提取物進行萃取。此法是分離生物堿類成分、酸性及酚性成分的一種常用方法。是利用被分離成分的堿性或酸性不同而采用的方法（詳見生物堿、黃酮、蒽醌類成分的分離）。38(四）液滴逆流分配法（液滴逆流色譜法）此法需特殊的儀器，多用于極性較大的成分的分離，關(guān)鍵是選擇好固定相和流動相。液滴逆流分配法的操作流程如下圖：第38頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日39液滴逆流分配法流程示意圖：第39頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日（五）高速逆流色譜法（HSCCC)20世紀80年代發(fā)展起來的現(xiàn)代分離制備技術(shù)。建立在一種特殊的流體動力學基礎(chǔ)上，利用螺旋管的高速行星式運動產(chǎn)生的不對稱離心力場，實現(xiàn)兩相溶劑體系的充分保留和有效混合及分配，從而實現(xiàn)物質(zhì)在兩相溶劑中的高效分離。是目前應用最廣的逆流色譜（CCC）技術(shù)。40國產(chǎn)第40頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日特點：1.操作簡單易行：無需對樣品進行復雜的處理，分離成分可在線檢測，可與靈敏度高的檢測技術(shù)聯(lián)用，方便、快捷、準確；2.應用范圍廣：兩相溶劑體系是任意的，通過調(diào)整兩相溶劑體系，可適用于各種化合物的分離；3.無需固體載體：不會出現(xiàn)吸附、污染、峰形拖尾及樣品損失；4.產(chǎn)品純度高：可分離得到純度高于90%的產(chǎn)品；5.適用于制備型分離：獲得大量產(chǎn)品。41第41頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日42外觀工作原理內(nèi)部結(jié)構(gòu)第42頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日43第43頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日44第44頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日影響因素：轉(zhuǎn)速、流動相流速、進樣體積等是影響分離效果的主要因素1.轉(zhuǎn)速越高，越易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象；2.流動相流速越大，固定相損失加重；3.進樣量太大，會使分離成分的峰間距變窄，峰形變寬。在選定了溶劑體系后，應對上述三個儀器參數(shù)進行試驗，以確定最佳分離條件（可采用正交試驗法）。常用的聯(lián)用檢測方法有：紫外-可見檢測、質(zhì)譜（MS）、電子電離質(zhì)譜、化學電離質(zhì)譜、快速原子轟擊質(zhì)譜、電噴霧質(zhì)譜等。45第45頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日沉淀法將被分離物溶于某種溶劑中，再加入另外一種溶劑或試劑，使某種或某些成分沉淀析出，而另一些成分則保留在溶液中經(jīng)過濾后達到分離的一種方法?？梢允闺s質(zhì)沉淀析出，也可使欲得成分沉淀析出。較常用的方法是將水提取液濃縮到一定程度后，加入濃乙醇使含醇量達到一定濃度，使一些成分析出沉淀，通常為50～80%，具體含醇量視欲得到的成分的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)而定。此法通常稱為“水煮醇沉法”。用此法可除去或得到多糖類等成分，如果膠提取時，從提取液中分離果膠即可用此法。46第46頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日（一）鉛鹽沉淀法鉛鹽法曾被應用于分離具有酸性和中性的成分，目前已較少用。具體操作方法:在中性醋酸鉛沉淀部分可得到含羧基及鄰二酚羥基的成分，如有機酸、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、某些黃酮等。堿式醋酸鉛沉淀部分得到只有一個酚羥基的成分以及中性皂苷等。經(jīng)堿或醋酸鉛沉淀后的水或醇液中有中性成分。因鉛對人有害，生產(chǎn)中最好不用此法。（二）特殊試劑沉淀法根據(jù)被分離成分結(jié)構(gòu)選用某些特殊試劑使某些成分沉淀，經(jīng)分解沉淀得欲得的成分。如水溶性生物堿的分離常用雷氏鹽(二氨基四硫代氰酸鉻銨、硫氰化鉻銨、利英鈉殼鹽)沉淀法。第47頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日鹽析法鹽析法是在天然物水提液中，加入無機鹽至一定濃度，或達飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中溶解度降低，從而與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用作鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。例如自黃藤中提取掌葉防己堿，自三顆針中提取小檗堿在生產(chǎn)上都是用氯化鈉或硫酸銨鹽析制備。有些成分如原白頭翁素、麻黃堿、苦參堿等水溶性較大，在提取時，亦往往先在水提取液中加入一定量的食鹽，再用有機溶劑提取。第48頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日分餾法對于能夠完全互溶的液體系統(tǒng)，可利用各成分沸點的不同而采用分餾法（有機實驗常用），天然物化學成分的研究工作中，揮發(fā)油及一些液體生物堿的分離即常用分餾法。例如毒芹總堿中的毒芹堿和羥基毒芹堿，前者沸點為166～167℃，后者為226℃，彼此相差較遠，即可利用其沸點的不同通過分餾法分離。若液體混合物沸點相差在100℃以上，只需將溶液重復蒸餾幾次即可達到分離的目的。如沸點相差在25℃以下，則需采用分餾。49簡單分餾裝置第49頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日結(jié)晶法結(jié)晶法是分離和精制固體成分的重要方法之一，是利用混合物中各成分在溶劑中的溶解度不同來達到分離的方法。具體操作：用合適的溶劑將混合物加熱溶解，制成近飽和熱溶液，趁熱濾去雜質(zhì)，溶液冷卻后，即析出大部分晶體，若純度仍不能滿足要求，則可用重結(jié)晶法（有機實驗中用過）進一步純化。所用的樣品必須是已經(jīng)用其他方法提得比較純的，如果粗提部分的純度很差，則很難得到結(jié)晶。有些成分的結(jié)晶若含有兩種以上的成分時，就可用分步結(jié)晶法使之分離。葛根總黃酮晶體第50頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日分步結(jié)晶法將提取物粗品溶于適當?shù)娜軇?，?jīng)一定處理后，使其先析出晶體Ⅰ，過濾后將濾液濃縮，再使其析出晶體Ⅱ，濾出后再濃縮濾液使其析出晶體Ⅲ，……。如此反復操作，可達到分離目的。但各步所得晶體的純度存在較大差距，每步?？色@得一種以上的晶體。結(jié)晶的純度可由化合物的晶形、色澤、熔點和熔距、薄層色譜或紙色譜等作初步鑒定。一個單體純化合物一般都有一定的熔點和較小的熔距，同時在薄層色譜或紙色譜中經(jīng)數(shù)種不同展開劑系統(tǒng)檢定，也為一個斑點者，一般可以認為是一個單體化合物。51第51頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日色譜法1.定義利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。色譜法起源于20世紀初，又稱色層法或?qū)游龇?，是分離和鑒定化合物的有效方法。歷史上曾經(jīng)先后有兩位化學家因為在色譜領(lǐng)域的突出貢獻而獲得諾貝爾化學獎，此外色譜分析方法還在12項獲得諾貝爾化學獎的研究工作中起到關(guān)鍵作用。第52頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日2.原理：相似相吸與相似相溶。3.操作特點：有兩個相—固定相和流動相。固定相多為固體(也稱為擔體、吸附劑），也可為液體；流動相可為液體或氣體。4.兩相基本形式：固-液（s-l)

固-氣（s-g)

液-液（l–l)

液-氣（l-g)注意：目前色譜法包含的范圍很廣，凡是有一個固定相和一個流動相的方法均可看作色譜法。因此，像高速逆流色譜法，雖然其兩相均為液相，但也可視為色譜法。53第53頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日5.操作類型：很多，常用的有：紙層析：柱層析：薄層層析：氣相色譜：高效液相色譜：6.在天然物分離中的應用（1）分離混合物在天然物提取物的有效部位中，往往含有結(jié)構(gòu)相似、理化性質(zhì)相似的幾種成分的混合物，用一般的化學方法很難分離，可用色譜法將它們分開。54硅膠薄層板柱色譜天麻TLC圖譜第54頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日（2）精制化合物在提取、分離得到有效成分時，往往含有少量結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)，不易除去，也可利用色譜法除去雜質(zhì)得到純品。（3）鑒定化合物在一定條件下，純的化合物在薄層色譜或紙色譜中都有一定的Rf值，在氣相色譜和高效液相色譜中有一定的保留時間，所以利用色譜法可以鑒定化合物的純度或利用標準品的對照來初步確定兩種性質(zhì)相似的化合物是否為同一物質(zhì)。55薄層板在不同的層析缸中展開的方式第55頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日7.色譜條件的選擇由于天然物有效成分類型不同，性質(zhì)各異，所以選擇色譜條件是不同的。一般生物堿的分離可用硅膠或氧化鋁柱色譜，對于極性較高的生物堿可用分配色譜，而對季銨型水溶性生物堿也可用分配色譜或離子交換色譜。苷類的色譜分離往往決定于苷元的性質(zhì)，如皂苷、強心苷，一般可用分配色譜或硅膠吸附色譜。揮發(fā)油、甾體、萜類包括萜類內(nèi)酯，往往首選氧化鋁及硅膠色譜。56第56頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日黃酮類化合物、鞣質(zhì)等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附色譜。有機酸、氨基酸一般可選用離子交換色譜，有時也用分配色譜。有些氨基酸也可用活性炭吸附色譜。對于大分子化合物，如多肽、蛋白質(zhì)、多糖，常用凝膠色譜。總的來說，對非極性成分往往考慮用氧化鋁或硅膠吸附色譜；若極性較大則采用分配色譜或弱吸附劑吸附色譜；對酸性、堿性、兩性成分可采用離子交換色譜，有時也可用吸附色譜及分配色譜等。57第57頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日八、其他分離新技術(shù)（一）大孔樹脂吸附大孔吸附樹脂是一種高聚物吸附劑，根據(jù)其孔徑、比表面積及構(gòu)成類型分為許多型號。20世紀60年代開發(fā)出的一類新型高分子分離材料20世紀70年代末我國有學者開始用來進行天然產(chǎn)物有效成分的分離純化研究。原理：利用大孔吸附樹脂的吸附性和分子篩相結(jié)合。從天然產(chǎn)物提取液中有選擇的吸附其中的有效成分，去除雜質(zhì)。特別是非極性吸附樹脂，在吸附提取液中的有效成分時，主要是物理結(jié)構(gòu)（如比表面積、孔徑等）在起吸附作用?；境绦颍禾烊划a(chǎn)物提取液→大孔樹脂吸附有效成分→乙醇溶液梯度洗脫→回收溶劑→提取液浸膏→干燥→半成品。大孔吸附樹脂工藝對于富集天然產(chǎn)物中的黃酮類、生物堿類、苷類等有效成分是卓有成效的。58第58頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日59全自動大孔樹脂吸附機組吸附流程示意圖實驗用色譜柱第59頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日（二）膜分離技術(shù)膜分離技術(shù)（MembraneSeparationTechnique，MST，簡稱膜技術(shù)）是一項新興的高效分離技術(shù)，已被國際公認為是20世紀末到21世紀中期最有發(fā)展前途的一項重大高新生產(chǎn)技術(shù)。利用天然或人工合成的具有選擇透過性的薄膜，以外界能量或化學位差為推動力，對雙組分或多組分體系進行分離、分級、提純或富集的技術(shù)。包括超濾、微濾、納濾和反滲透等。采用膜分離技術(shù)進行濃縮，濾除提取液中水分和小分子雜質(zhì)，可達到節(jié)省能耗、提高純度的效果。60第60頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日（三）分子印跡技術(shù)分子印跡技術(shù)（MolecularImprintingTechno-logy，MIT，也叫分子膜板技術(shù)）是20世紀末出現(xiàn)的一種高選擇性分離技術(shù)。該技術(shù)選用能與印跡分子產(chǎn)生特定相互作用的功能性單體，在印跡分子周圍與交聯(lián)劑進行聚合，形成三維交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡，然后，通過合適的溶劑除去印跡分子，在聚合物網(wǎng)絡中形成空間和化學功能與印跡分子互補的空穴。整個聚合過程可分為三步：印跡、聚合、去除印跡分子。有研究證實了MIT用于直接分離、提取中草藥中具有特定藥效化合物的可行性。61第61頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日（四）分子蒸餾技術(shù)分子蒸餾是在極高的真空度下，依靠混合物分子運動平均自由程的差異，使液體在遠低于沸點的溫度下迅速得到分離。在高真空度下，液體分子只需很小的能量就能克服液體內(nèi)部引力，離開液面而蒸發(fā)。分子蒸餾技術(shù)出現(xiàn)于20世紀30年代，目前在許多國家工業(yè)上得到了規(guī)?；瘧?。在揮發(fā)油的分離純化中，分子蒸餾技術(shù)與超臨界流體萃取合用，既能發(fā)揮超臨界提油率高和充分保留揮發(fā)油有效成分的特點，又可達到分子蒸餾很好地對有效成分的純化分離的效果。62第62頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日63分子蒸餾工業(yè)設(shè)備分子蒸餾流程第63頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日

3天然產(chǎn)物的化學成分鑒定及結(jié)構(gòu)表征

鑒定天然產(chǎn)物所需做的工作：1、元素分析：由哪些元素組成，各占多少。2、物理常數(shù)：熔、沸點3、比旋光度4、分子量測定：凝膠過濾法、光散射法、粘度測定法、MS等方法5、結(jié)構(gòu)測定法：紅外光譜、核磁共振（13C譜、1H譜和二維譜）第64頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日化學成分特別是有效成分的鑒定（檢測）與結(jié)構(gòu)表征是天然物成分研究的重要步驟。如果不能鑒定結(jié)構(gòu)，說明研究天然物化學成分沒有結(jié)果，也就談不上更進一步的研究，如藥物代謝動力學研究、構(gòu)效關(guān)系研究、結(jié)構(gòu)修飾與改造研究等。65紅外分光光度計顯微熔點儀第65頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日3.1化學成分鑒定的一般方法在提取和分離時，必須知道原料或提取混合物中是否含有目的成分及其含量的多少！常用的檢測鑒定方法主要有：紫外-可見光譜掃描法（單體）薄板層析法（對照）氣相或液相色譜法（對照）高速逆流色譜法（對照）紅外（對照）等也可采用一些特有反應，如生物堿試劑、顯色反應等。66UV-2450型紫外可見分光光度計第66頁，共79頁，2023年，2月20日，星期日3.2化學成分的鑒定程序?qū)σ粋€化合物，一般按下列步驟進行鑒定：純度的確定（熔、沸點，色譜）物理常數(shù)的測定（折射、旋光）化學式測定化合物功能團和分子骨架的推定化學結(jié)構(gòu)的確定

1.純度的確定1）觀察外形、顏色是否單一純正，晶形是否一致。2）色譜分析：薄層色譜結(jié)果為單一斑點，應注意點樣量不可太小，展開劑不可只選一種。有時可用氣相