綜合性實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的小量制備和電泳鑒定

綜合性實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的小量制備和電泳鑒定第1頁/共29頁質(zhì)粒plasmid質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的環(huán)形雙鏈DNA分子，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主的進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)?；蚬こ讨心康幕虻倪\(yùn)載工具。質(zhì)粒載體第2頁/共29頁大小可從1kb到200kb篩選標(biāo)記多克隆位點(diǎn)酶切位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)第3頁/共29頁質(zhì)粒的特性：能獨(dú)立自主進(jìn)行復(fù)制。

細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子，能垂直遺傳。

能賦予宿主細(xì)胞一些表型。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。第4頁/共29頁質(zhì)粒的應(yīng)用質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。第5頁/共29頁大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。第6頁/共29頁Visualizationoftopoisomers.Inthisexperiment,allDNAmoleculeshavethesamenumberofbasepairsbutexhibitsomerangeinthedegreeofsupercoiling.BecausesupercoiledDNAmoleculesaremorecompactthanrelaxedmolecules,theymigratemorerapidlyduringgelelectrophoresis.第7頁/共29頁瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。因此該凝膠適合于核酸與核蛋白、免疫復(fù)合物的分離、鑒定及純化。在臨床生化檢驗(yàn)中也常用于LDH、CK等同工酶的檢測。第8頁/共29頁■影響電泳遷移率的因素：FrictionCharge外加電流、電壓分子量分子形狀分子的等電點(diǎn)VoltageCATHODEANODE+--+第9頁/共29頁瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術(shù)

在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比；分子構(gòu)型也對(duì)遷移率有影響，如共價(jià)閉環(huán)DNA＞直線DNA＞開環(huán)雙鏈DNA。當(dāng)凝膠濃度太高時(shí)，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA（球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0，而同等大小的直線DNA（剛性棒狀）可以按長軸方向前移，相對(duì)遷移率大于0。

第10頁/共29頁差速離心DIFFERENTIALCENTRIFUGATION離心:利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開

。第11頁/共29頁二．實(shí)驗(yàn)原理第12頁/共29頁質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒提取有多種方法，但都包含三個(gè)基本步驟：1.培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增2.收集裂解細(xì)菌3.分離純化質(zhì)粒DNA去除蛋白質(zhì)去除RNA去除基因組DNA苯酚-氯仿抽提法Rnase消化法？？？第13頁/共29頁質(zhì)粒DNA和基因組DNA的區(qū)別大小不同變性與復(fù)性有差異質(zhì)粒DNA較小，通常只有基因組DNA分子量的百分之一?；蚪MDNA容易斷裂線性化。第14頁/共29頁

從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的有：

依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)選擇。堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。分離質(zhì)粒DNA和基因組DNA的方法堿變性法煮沸法羥基磷灰石層析法等第15頁/共29頁堿裂解法提取質(zhì)粒的原理應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法。

基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。第16頁/共29頁原理：1.強(qiáng)堿NaOH和SDS裂解細(xì)菌，細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA和基因組DNA在強(qiáng)堿條件下發(fā)生變性。2.怎樣去除基因組DNA？

當(dāng)加入酸性物質(zhì)進(jìn)行中和時(shí)，質(zhì)粒DNA很快復(fù)性，而染色體DNA則和變性蛋白質(zhì)等纏繞在一起，難以復(fù)性，并形成沉淀，經(jīng)過離心隨細(xì)胞碎片一起去除。3.怎樣去除蛋白質(zhì)？

留有質(zhì)粒DNA的上清，經(jīng)酚/氯仿去除蛋白質(zhì)后，用乙醇沉淀DNA，即得到質(zhì)粒DNA。第17頁/共29頁三、試劑與儀器Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒：Resuspensionbuffer,Lysisbuffer,Neutralizationbuffer,washbuffer,Elutionbuffer,RNasesolution,Spincolumns.瓊脂糖凝膠電泳：電泳儀，電泳槽，紫外燈瓊脂糖，50XTAE電泳緩沖液，6X點(diǎn)樣緩沖液，DNAMarker，溴化乙啶（熒光染料，結(jié)合DNA并在紫外線下顯示）第18頁/共29頁四、操作步驟第19頁/共29頁第20頁/共29頁ResuspensionBuffer細(xì)胞懸浮液LysisBuffer堿裂解液NeutralizationBuffer中和液Spincolumn吸附柱WashBuffer漂洗液ElutionBuffer洗脫緩沖液第21頁/共29頁2.質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳1)用膠帶將洗凈、干燥的配膠板的邊緣封住，形成一個(gè)膠模并水平放置，放入電泳梳。第22頁/共29頁2)按水平板的長×寬×0.5cm膠厚，量取1×TAE，并按0.8％的濃度稱取瓊脂糖（agarose），在微波爐或電爐上加熱至全熔（清澈透明）。第23頁/共29頁第24頁/共29頁3)等凝膠溫度降至大約50－60℃以下時(shí)，加入1mg/L溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5μg/mL；搖勻并輕快地倒入水平板中，除掉氣泡。4)凝固后，將梳子輕輕拔出。5)去掉膠帶，將水平板放入加有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，并且使電泳緩沖液高出凝膠約1mm。第25頁/共29頁6)上樣Buffer和DNA混勻后點(diǎn)樣，記錄點(diǎn)樣次序。7)在水平板兩邊的點(diǎn)樣孔中分別加入marker即分子量標(biāo)記。8)蓋好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)?shù)?/p>