Section1中心法則面臨的挑戰(zhàn)

蛋白質(zhì)研究領域的發(fā)展特點發(fā)展飛速、學科交叉一、中心法則面臨的補充和挑戰(zhàn)二、新生肽鏈的成熟和周轉(zhuǎn)三、蛋白質(zhì)研究相關技術現(xiàn)在是1頁\一共有42頁\編輯于星期一Section1中心法則面臨的補充和挑戰(zhàn)現(xiàn)在是2頁\一共有42頁\編輯于星期一1958年Crick首次提出中心法則之后，始終在不斷的補充和完善。但是20世紀90年代后面臨著一些新的挑戰(zhàn)：1。生物體內(nèi)存在不以DNA為模板的肽鏈合成；2。蛋白質(zhì)的自剪接（蛋白質(zhì)內(nèi)含子問題）；3。蛋白質(zhì)折疊需要分子伴侶；4。表觀效應可以遺傳現(xiàn)在是3頁\一共有42頁\編輯于星期一1.生物體內(nèi)存在著不以DNA為模板的肽鏈合成生物體內(nèi)肽類可以通過兩種不同的途徑合成，一是以DNA為模板的核糖體途徑二是以多酶體系為模板的非核糖體合成方式。通過非核糖體途徑合成的肽類包括：谷胱甘肽；胞壁質(zhì)交聯(lián)肽；多種抗生素多肽（如短桿菌肽S、放線菌素、多粘菌素、分枝桿菌素、纈氨霉素、鵝膏蕈堿、鬼筆毒環(huán)肽等）現(xiàn)在是4頁\一共有42頁\編輯于星期一

不同合成途徑肽類的差別特征核糖體途徑非核糖體途徑大小大小不受限制2-50(一般4-10)氨基酸氨基酸組成常見氨基酸及其修飾物不同類型氨基酸和衍生物氨基酸構型幾乎均為L-型常有D-型非氨基酸組分被?；兔擊瘸蔀榘奉惗喾N類型的衍生化環(huán)狀結(jié)構很少見，有也是二硫鍵或硫脂酯鍵大部分為環(huán)狀，環(huán)肽和內(nèi)酯為主修飾情況羥化、脫氫、側(cè)鏈環(huán)化等甲基化、糖基化、羥化、交聯(lián)罕見結(jié)構尚未發(fā)現(xiàn)脂肽、聚酮類模板核酸多酶體系巰基模板機制生物合成核糖體合成非核糖體酶促反應合成分布各種動、植物，一些細菌主要為細菌、低等真菌現(xiàn)在是5頁\一共有42頁\編輯于星期一1.1合成短桿菌肽S的多酶體系：短桿菌肽S(GS)是由短桿菌BacillusBrevis產(chǎn)生的環(huán)十肽催化多酶體系結(jié)構：輕酶（lightenzyme,LE):100kDa，具消旋酶活性，使L-Phe活化、硫酯化后轉(zhuǎn)變?yōu)镈-Phe

重酶（heavyenzyme，HE)：280kDa，含4’-(p)-泛酰巰基乙胺蛋白[4’-(p)-pan，手臂]，具有轉(zhuǎn)硫醇和轉(zhuǎn)肽作用，可轉(zhuǎn)移并延長肽鏈；此外，對Pro、Val、Orn、Leu有特異活化位點，可將其等比例排列、活化和硫酯化現(xiàn)在是6頁\一共有42頁\編輯于星期一合成步驟:LE：將L-Phe活化并轉(zhuǎn)變?yōu)镈-Phe（N-端第1個氨基酸），反應消耗ATP，需要Mg2+；

HE：消耗ATP，Mg2+,將Pro、Val、Orn、Leu活化和硫酯化,（分別為第2、3、4、5號氨基酸）；將LE上的D-Phe轉(zhuǎn)移到HE的4’-(p)-pan蛋白上，起始肽鏈合成，并依次連接上其余4個硫脂化的氨基酸，形成5肽；形成的5肽被轉(zhuǎn)移到HE的第6位存放；重復上述操作，再合成一個同樣的5肽后，由4’-(p)-pan手臂將其轉(zhuǎn)到第6位上的第一個5肽上，并首尾相連合成環(huán)十肽。說明：GS合成不是DNA編碼，也沒有RNA作為模板，而是多酶體系自身為模板合成的，酶對底物氨基酸的特定吸附順序決定了肽的序列?，F(xiàn)在是7頁\一共有42頁\編輯于星期一Surfantin：由枯草桿菌合成的表面活性肽，是由7個aa和-羥基脂肪酸連接構成的環(huán)狀脂肽分子，具有抗菌和抗病毒能力，更是良好的表面活性劑。其合成多酶體系包括：A結(jié)構域：選擇底物氨基酸并將其腺苷?；纬蒩a-AMPT結(jié)構域：巰基化結(jié)構域，結(jié)合磷酸泛酰巰基乙胺手臂C結(jié)構域：縮合結(jié)構域，催化肽鍵形成，以及脂與肽的縮合E結(jié)構域：差向異構結(jié)構域M結(jié)構域：N-甲基化結(jié)構域其它結(jié)構域：?；?、糖基化、雜環(huán)化等修飾結(jié)構域1.2以非核糖體合成酶為模板合成Surfantin短肽因這些結(jié)構域的作用，產(chǎn)物中存在近300種稀有氨基酸基本模塊現(xiàn)在是8頁\一共有42頁\編輯于星期一非核糖體合成酶（NRPS）合成Surfactin短肽示意圖現(xiàn)在是9頁\一共有42頁\編輯于星期一1.3朊病毒蛋白質(zhì)的畸變朊病毒作為病原體，提取物可通過100nm孔徑的濾器，因此大小類屬于病毒范圍。朊病毒是不含核酸的蛋白侵染顆粒；其復制是在特定條件下（外來病源體；PrP基因突變等），PrPsc使正常PrPc蛋白分子畸變形成的，因此可以認為PrPsc蛋白具有“自我模板”功能；其它真核生物，如釀酒酵母的Sup35蛋白、Ure2蛋白以及鵝掌柄孢殼（Podosporaanserina）的Het-s蛋白等，都與朊病毒蛋白相似，具有類似的誘導其它蛋白轉(zhuǎn)變成自身狀態(tài)的模板功能?，F(xiàn)在是10頁\一共有42頁\編輯于星期一2.蛋白質(zhì)的自剪接（蛋白質(zhì)內(nèi)含子問題）1990年Hirata等首次發(fā)現(xiàn)酵母H+-ATPase亞基的蛋白質(zhì)具有非酶促的自剪接現(xiàn)象（proteinself-splicing），可將119kDa的前體剪接為69kDa的ATPase亞基，中間被切除的50kDa內(nèi)含肽具有核酸內(nèi)切酶功能。目前已在多種蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)含子，但主要都存在古細菌、真細菌和單細胞真核生物中。內(nèi)含肽（intein)：蛋白質(zhì)中通過非酶促的自剪接去除的肽段部分。外顯肽（extein)：蛋白質(zhì)自剪接后保留的部分。現(xiàn)在是11頁\一共有42頁\編輯于星期一2.1蛋白質(zhì)中的內(nèi)含肽：一般為300-550aa長度，少數(shù)較短，如gyrA的內(nèi)含肽只有198aa；內(nèi)含肽具有7或10個保守序列模塊;一般N-端經(jīng)常存在Cys、Ser和Tyr等帶羥基或巰基的aa;C-端含有絕對保守的Asn-His二肽序列。內(nèi)含肽隨后的外顯肽N-端，一般也是C、S、T（古細菌多為S和T，中等溫度生長的生物以C為主）現(xiàn)在是12頁\一共有42頁\編輯于星期一現(xiàn)在是13頁\一共有42頁\編輯于星期一2.2內(nèi)含肽切除示意：CSTHNC,S,T現(xiàn)在是14頁\一共有42頁\編輯于星期一2.3內(nèi)含肽去除的反應機制：現(xiàn)在是15頁\一共有42頁\編輯于星期一2.4Hedgehog（Hh）自我水解反應Hedgehog（Hh）是胚胎發(fā)育過程中的重要信息分子（

1980年從果蠅體內(nèi)分離的一種分節(jié)極性基因。其突變可使果蠅胚胎發(fā)育成毛團狀，酷似刺猬而得名），成熟蛋白C-端帶有膽固醇，并通過膽固醇維系在膜上。

Hh的N-端與一般內(nèi)含肽的切除機制相同，通過S-O轉(zhuǎn)酯形成硫脂；但C-端的連接由膽固醇代替，其羥基代替Cys的S原子與外顯肽C-端羰基C連接，形成膜牽系的Hh蛋白。該過程同樣是非酶催化的蛋白水解過程?，F(xiàn)在是16頁\一共有42頁\編輯于星期一2.5意義內(nèi)含子的存在，使得DNA決定的mRNA前體與成熟mRNA不再一致；蛋白內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)，則使mRNA模板與成熟蛋白的結(jié)構不一致結(jié)果，使一個基因的產(chǎn)物，出現(xiàn)了多樣化的結(jié)果，破除了以往認為真核生物“onegene，oneprotein”的觀點，改變了遺傳信息的共線性。是對中心法則，信息流向的重要補充和修正?，F(xiàn)在是17頁\一共有42頁\編輯于星期一3.蛋白質(zhì)折疊需要分子伴侶

一級結(jié)構決定高級結(jié)構，該原則只給出了蛋白質(zhì)折疊的熱力學可能性，折疊動力學的實現(xiàn)需要分子伴侶幫助。3.1分子伴侶種類：#可被分為熱激蛋白和環(huán)境脅迫蛋白兩大類，因為它們的表達被各種脅迫所誘導；#根據(jù)分子量大小和分布：分為Hsp100-40以及小Hsp等#根據(jù)與核糖體關系：核糖體結(jié)合（包括引發(fā)因子和新生鏈相關復合物（nascentchain-assiociatedcompkex,NAC））及非核糖體結(jié)合分子伴侶現(xiàn)在是18頁\一共有42頁\編輯于星期一現(xiàn)在是19頁\一共有42頁\編輯于星期一

其它分子伴侶(plasmin)引發(fā)因子（triggerfactor,TF）結(jié)合于核糖體大亞基隧道出口，維持新生肽鏈構象

結(jié)合于核糖體現(xiàn)在是20頁\一共有42頁\編輯于星期一非蛋白質(zhì)/肽類分子伴侶：目前實驗表明，除了常見的蛋白質(zhì)或肽類分子伴侶外，還有有一些非蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)也可以幫助蛋白質(zhì)折疊：例如：脂質(zhì)和糖類。有報道，磷脂酰乙醇胺可以幫助大腸桿菌外膜中的乳糖通透酶的組裝；磷脂、脂多糖，甚至磷脂和脂多糖的比例，都會影響到大腸桿菌外膜一組孔蛋白OmpA的組裝和生物發(fā)生。流感病毒紅細胞凝集素（HA）若失去N-糖鏈則不能正常折疊，也不能組裝成三聚體和分泌到胞外；運鐵蛋白受體（二聚體跨膜蛋白）每個亞基含3條糖鏈，Asn251突變被去糖基化后，則不能形成二聚體而影響受體功能。現(xiàn)在是21頁\一共有42頁\編輯于星期一3.2分子伴侶的功能3.2.1幫助新生肽鏈折疊：大腸桿菌中約有67%的蛋白質(zhì)可以在細胞質(zhì)中自發(fā)完成折疊，而其它蛋白質(zhì)則必須借助各種分子伴侶的幫助。如：GroES/GroEL(Hsp60/Hsp10)；DnaK/DnaJ（Hsp70/Hsp40)等。并且不同的分子伴侶性質(zhì)決定了蛋白質(zhì)不同的折疊命運?，F(xiàn)在是22頁\一共有42頁\編輯于星期一

不同分子伴侶的生化特性

決定了折疊肽鏈的命運現(xiàn)在是23頁\一共有42頁\編輯于星期一GroELGroESGroEL（HSP60）/GroES（Hsp10）現(xiàn)在是24頁\一共有42頁\編輯于星期一現(xiàn)在是25頁\一共有42頁\編輯于星期一3.2.2參與蛋白質(zhì)亞基組裝：葉綠體Rubisco、流感病毒紅細胞凝集素組裝等3.2.3參與蛋白質(zhì)折疊的質(zhì)量控制:

如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Bip/GRP78（Hsp70家族）、鈣連蛋白和鈣網(wǎng)蛋白等?，F(xiàn)在是26頁\一共有42頁\編輯于星期一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊和錯誤折疊蛋白堆積，可引起相關應答，稱為未折疊蛋白質(zhì)應答（unfoldingproteinresponse，UPR），或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應急（ERstress)。廣義地理解，UPR包括3個方面：(1)加速新生肽鏈折疊，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，如Bip（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)bindingprotein)、鈣連蛋白和鈣網(wǎng)蛋白等的協(xié)助。(2)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關降解途徑（ERAD）將未折疊或錯誤折疊的糖蛋白或其它蛋白從ER運出至胞質(zhì)并降解。(3)反饋調(diào)節(jié)新生肽鏈的合成（主要是翻譯）——主要議題3.2.4分子伴侶參與未折疊蛋白質(zhì)應答：現(xiàn)在是27頁\一共有42頁\編輯于星期一反饋調(diào)節(jié)新生肽鏈的合成的中心環(huán)節(jié)是ER中的分子伴侶Bip：

Bip在ER中濃度高達100mg/ml，平時相當數(shù)量Bip是與ER上的蛋白結(jié)合的，包括：依賴肌醇的蛋白激酶/RNase（IRE-1）、激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）和蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）等。當大量新生肽鏈進入ER，需要更多Bip參與幫助折疊時，Bip就與上述蛋白解離。解離后的IRE-1和PERK二聚化，ATF6也發(fā)生構象變化。由此產(chǎn)生一些信號，轉(zhuǎn)送到不同的細胞器，出現(xiàn)調(diào)節(jié)效應.現(xiàn)在是28頁\一共有42頁\編輯于星期一

ATF6進入高爾基體：經(jīng)加工成為細胞質(zhì)片段，后者進入細胞核，激活UPR有關基因。IRE-1二聚化：激活其蛋白激酶和RNase兩種活性，一方面激活相應的蛋白質(zhì)，另一方面對mRNA進行加工。PERK二聚化：其激酶活性因此被活化，可使得真核細胞起始因子2（eIF2）的亞基被磷酸化，影響40S起始三元復合物eIF2-GTP-tRNAMet的形成，降低肽鏈合成起始頻率，抑制新生肽鏈合成?，F(xiàn)在是29頁\一共有42頁\編輯于星期一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應急現(xiàn)在是30頁\一共有42頁\編輯于星期一

原核及真核生物質(zhì)量控制采用不同的方式現(xiàn)在是31頁\一共有42頁\編輯于星期一3.2.5分子伴侶兼有折疊酶活性：

PDI、PPI、TF（引發(fā)因子）具有PPI活性3.2.6分子伴侶參與信號轉(zhuǎn)導：

Hsp70和DnaJ介導固醇類激素的信號轉(zhuǎn)導。實質(zhì)是兩者與Hsp90等相互作用，幫助膽固醇激素受體折疊，或改變受體的構象?，F(xiàn)在是32頁\一共有42頁\編輯于星期一4.表觀效應可以遺傳根據(jù)中心法則，基因決定性狀，只有改變遺傳信息才可能有遺傳性狀的改變，但近年來迅速發(fā)展起來的表觀遺傳學(epigenetic）卻揭示：存在許多基因型未改變而改變了的表型，且這些表型可以遺傳——表觀遺傳。表觀遺傳變異(epigeneticvariation)是指,在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下,基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導致了表型的變化。它是不符合孟德爾遺傳規(guī)律的遺傳方式。表觀遺傳變異的研究內(nèi)容包括：基因沉默、DNA甲基化、核仁顯性、休眠轉(zhuǎn)座子激活、基因組印記等?，F(xiàn)在是33頁\一共有42頁\編輯于星期一4.1X染色體失活：

在哺乳動物中,雌雄性個體X染色體的數(shù)目不同,這類動物需要以一種方式來解決X染色體劑量的差異。在雌性哺乳動物中,兩條X染色體有一個是失活的,稱為X染色體的劑量補償(dosagecompensation)。X染色體失活的選擇和起始發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期,這個過程被X失活中心(X-inactivationcenter,Xic)所控制,是一種反義轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。這個失活中心存在著X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄基因Xist(X-inactive-specifictranscript),當失活的命令下達時,這個基因就會產(chǎn)生一個17kb不翻譯的RNA與X染色體結(jié)合,引發(fā)失活。X失活中心還有“記數(shù)”的功能,即保持每個二倍體中僅有一條X染色體有活性,其余全部失活。現(xiàn)在是34頁\一共有42頁\編輯于星期一X染色體的失活狀態(tài)需要表觀遺傳修飾如DNA甲基化來維持。這種失活可以通過有絲或減數(shù)分裂遺傳給后代。X染色體失活是表觀遺傳學研究的很好范例,它能幫助人們認識基因沉默是如何建立和通過遺傳而保持的。對于X染色體失活的研究還要特別關注于：哪些因素調(diào)控了Xic的功能、XistRNA造成沉默的機制和一些像BRCAl的蛋白質(zhì)在X染色體失活中的作用等問題。

現(xiàn)在是35頁\一共有42頁\編輯于星期一4.2DNA甲基化引起的表觀效應：甲基化是基因組DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。在脊椎動物中,CpG二核苷酸是DNA甲基化發(fā)生的主要位點。CpG常成簇存在,人們將基因組中富含CpG的一段DNA稱為CpG島(CpGisland),通常長度在1kb～2kb左右，常位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近。在DNA甲基化過程中,胞嘧啶突出于DNA雙螺旋并進入與胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合部位的裂隙中,該酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5′位,形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5MC)。現(xiàn)在是36頁\一共有42頁\編輯于星期一體內(nèi)甲基化狀態(tài)有三種:持續(xù)的低甲基化狀態(tài)：如持家基因；誘導的去甲基化狀態(tài)：如發(fā)育階段中的一些基因；高度甲基化狀態(tài)：如女性的一條縊縮的X染色體。DNA甲基化主要是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族(DNAmethyltransferase,Dnmt)來催化。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有維持甲基化酶（Dnmtl）和重新甲基化酶（如Dnmt3a和Dnmt3b,它們使去甲基化的CpG位點重新甲基化）兩種。在細胞分化的過程中,基因的甲基化狀態(tài)將遺傳給后代細胞。但在哺乳動物的生殖細胞發(fā)育時期和植入前胚胎期，其基因組范圍內(nèi)的甲基化模式通過大規(guī)模的去甲基化和接下來的再甲基化過程發(fā)生重編程，從而產(chǎn)生具有發(fā)育潛能的細胞?，F(xiàn)在是37頁\一共有42頁\編輯于星期一DNA甲基化影響到基因的表達,與腫瘤的發(fā)生密切相關。甲基化狀態(tài)的改變是致癌作用的一個關鍵因素,它包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化程度的異常升高,這將導致基因組的不穩(wěn)定(如染色體的不穩(wěn)定、可移動遺傳因子的激活、原癌基因的表達)。把癌基因組學與表觀遺傳學的研究結(jié)合起來,是癌癥研究的發(fā)展趨勢?，F(xiàn)在是38頁\一共有42頁\編輯于星期一人類的一些癌癥常出現(xiàn)整個基因組DNA的低甲基化，目前不能肯定這種表觀遺傳變化是腫瘤產(chǎn)生的誘因還是結(jié)果。研究者構建了攜帶低表達水平Dnmtl基因的小鼠，結(jié)果顯示，DNA低甲基化可能通過提高染色體的不穩(wěn)定性來促進腫瘤的形成；并且，通常使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑來治療人和小鼠的癌癥，其療效可能是由于這些抑制劑恢復了腫瘤抑制基因的活性。但是這種導致DNA低甲基化的治療方式，可能在防止