細(xì)胞的破碎與分離包涵體課件

細(xì)胞的破碎與分離概述

很多生化產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)(胞內(nèi)產(chǎn)物)細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型成分的基礎(chǔ)。胞內(nèi)物分離概述

藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長(zhǎng)激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α--干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤back酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)一、細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類蛋白質(zhì)細(xì)胞破碎機(jī)理圖細(xì)胞破碎細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽性細(xì)菌的堅(jiān)固；酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。細(xì)胞破碎1.珠磨法（Beadmill）細(xì)胞破碎高壓勻漿器細(xì)胞破碎超聲破碎法（Ultrasonication在15-25kHz的頻率下操作。其原理可能與空化現(xiàn)象（cavitationphenomena）引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)?？昭ㄅ萦捎谑艿匠暡ǖ难杆?zèng)_擊而閉合，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。20Hz20000Hz正常人耳能聽到的聲音的頻率范圍超聲次聲細(xì)胞破碎撞擊破碎化學(xué)破碎方法

酸堿法表面活性劑有機(jī)溶劑化學(xué)破碎方法通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。

1.破碎率的測(cè)定直接測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離細(xì)胞碎片，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較，計(jì)算其破碎率。破碎率的測(cè)定破碎率的測(cè)定0.05%美藍(lán)染色結(jié)果外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長(zhǎng)激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)

在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定;

能避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集;

簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作;

能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)

以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白。

體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%

復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包涵體獲得

幾種常見的工藝路線(一)機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性包涵體獲得

幾種常見的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離獲得包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性1）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。包涵體的溶解包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性二硫鍵目的次級(jí)鍵變性劑去污劑還原劑鹽酸胍、尿素SDS、Triton100巰基乙醇、DTT包涵體的復(fù)性包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性游離巰基次級(jí)鍵重新折疊形成復(fù)性通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的