蛋白誘導(dǎo)-LJ課件

實(shí)驗(yàn)四基因的誘導(dǎo)表達(dá)與融合蛋白的純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆栈蛘T導(dǎo)表達(dá)的原理與方法掌握蛋白質(zhì)純化的基本原理鞏固蛋白質(zhì)電泳的基本方法基因工程的下游技術(shù)基因的誘導(dǎo)表達(dá)和重組蛋白的純化二、表達(dá)瓶頸1、蛋白翻譯后折疊、修飾；2、蛋白翻譯后易降解、形成包涵體；3、蛋白分離純化、復(fù)性；4、基因表達(dá)調(diào)控。三、表達(dá)方式融合蛋白

1、基因融合：將兩個(gè)或多個(gè)開(kāi)放閱讀框架按一定順序連接在一起，表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)雜和蛋白，靶蛋白連接在運(yùn)載蛋白（識(shí)別標(biāo)簽）的氨基端或羧基端。2、應(yīng)用潛力：

簡(jiǎn)化靶蛋白的標(biāo)記與分離；靶蛋白與信號(hào)肽連接，將靶蛋白分泌到特定細(xì)胞區(qū)；保護(hù)靶蛋白免受宿主蛋白酶降解；改善靶蛋白溶解性，防止形成包含體。識(shí)別標(biāo)簽

β-半乳糖苷酶（lac-Z）谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）多聚組氨酸（poly-his）人工7肽FLAG人工標(biāo)簽選擇表達(dá)載體常用的關(guān)鍵元件：?jiǎn)?dòng)子和調(diào)節(jié)序列（表達(dá)強(qiáng)弱、細(xì)胞或組織特異性、表達(dá)調(diào)節(jié)等，如本實(shí)驗(yàn)的乳糖操縱子。）融合基因（純化、標(biāo)簽，或增強(qiáng)蛋白可溶性等。如GST融合蛋白用GST柱親和層析;多聚His標(biāo)簽－6×His，便于鎳柱親和層析純化。）分泌信號(hào)篩選標(biāo)記其它純化條件寬松由于螯合作用不受變性劑等因素的影響，故可在SDS或尿素等存在的條件下進(jìn)行純化，這對(duì)一些溶解度不佳的重組蛋白的純化尤其有利。五、實(shí)驗(yàn)流程：

細(xì)菌

親和層析IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白重組蛋白融合蛋白乳糖操縱子的特性SDS初步分析六、實(shí)驗(yàn)原理

重組蛋白的表達(dá)方式與純化方式是由表達(dá)載體決定的。在原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)載體均攜帶一個(gè)條件表達(dá)的啟動(dòng)子，由這一啟動(dòng)子控制外源基因的表達(dá)。在未經(jīng)誘導(dǎo)的情況下，外源基因不表達(dá)，這就防止了外源基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌正常生長(zhǎng)的干擾。在細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)再加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)基因表達(dá)，可最大限度提高重組蛋白的產(chǎn)量。重組蛋白的表達(dá)與誘導(dǎo)劑加入的時(shí)間和濃度相關(guān)。表達(dá)產(chǎn)物:GST-目的蛋白Thestructureoflacoperon調(diào)節(jié)序列結(jié)構(gòu)基因I阻遏因子Repressorandnegativeregulation異丙基硫代半乳糖苷異半乳糖本實(shí)驗(yàn)采用的pGEX4T-1表達(dá)載體，外源基因與GST形成GST-融合蛋白。由于GST能特異性結(jié)合谷胱甘肽，因此在純化時(shí)可利用偶聯(lián)谷胱甘肽的瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和層析，純化過(guò)程簡(jiǎn)便且產(chǎn)物純度高。八、影響外源蛋白表達(dá)的主要因素細(xì)胞生長(zhǎng)速率細(xì)胞生長(zhǎng)溫度（20-37℃

）誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間①首先進(jìn)行小規(guī)模預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件②大規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)行提取、純化目的蛋白序號(hào)加入的100mMIPTG的體積（ul）IPTG終濃度（mM）誘導(dǎo)時(shí)間（小時(shí)）1（空質(zhì)粒）--42（112）--43（空質(zhì)粒）250.544（112）50.145（112）250.546（112）501.047（112）1002.048（112）2505.044.每管菌液3000rpm離心5分鐘，收集沉淀，棄上清。5.每管各加入200μl的上樣緩沖液，振蕩煮沸變性5分鐘備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)。

PAGE原理

PAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi)，前者電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)；后者電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。

1.濃縮效應(yīng)(1)凝膠孔徑的不連續(xù)性(2)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

(3)電位梯度的不連續(xù)性2.分子篩效應(yīng)3.電荷效應(yīng)3．配制5%濃縮膠5ml：

30%Acr/Bis0.625ml1mol/LTrispH6.80.63mlH2O3.6ml10%SDS0.05ml10%過(guò)硫酸銨0.05mlTEMED0.005ml4．電泳(1)上樣20ul

(2)電泳濃縮膠段：80V/cm

分離膠段：120V/cm5．考馬斯亮藍(lán)染色：將電泳膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫放置