第三章生物信息的傳遞上轉(zhuǎn)錄

第三章生物信息的傳遞上轉(zhuǎn)錄第1頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

在遺傳學(xué)上，把遺傳信息的流動方向叫做信息流。信息流的方向可以用科學(xué)家克里克提出的“中心法則”來表示。從“中心法則”可以看出，遺傳信息的一般流動方向是：遺傳信息可以從DNA流向DNA，即完成DNA的自我復(fù)制過程，也可以從DNA流向RNA，進(jìn)而流向蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。1970年，巴爾的摩和梯明在致癌的RNA病毒中，發(fā)現(xiàn)一種酶，能以RNA為模板合成DNA。他們稱這種酶為依賴RNA的DNA多聚酶，現(xiàn)在一般稱為逆轉(zhuǎn)錄酶。這就是說，遺傳信息流也可以反過來，從RNA→DNA。這是一項(xiàng)重要的發(fā)現(xiàn)。巴爾的摩和梯明于1975年榮獲諾貝爾獎(jiǎng)。

第2頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一中心法則復(fù)制

轉(zhuǎn)錄

翻譯

DNARNA蛋白質(zhì)

mRNAtRNA

反轉(zhuǎn)錄

rRNA

轉(zhuǎn)錄、翻譯

RNA（病毒）蛋白質(zhì)（病毒）

復(fù)制第3頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●基本概念●轉(zhuǎn)錄起始：RNA聚合酶、啟動子●轉(zhuǎn)錄的基本過程●轉(zhuǎn)錄后加工●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)Contents第4頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一一、基本概念生物體以DNA為模板合成RNA的過程轉(zhuǎn)錄RNADNA

轉(zhuǎn)錄(transcription)生物體以DNA的一條鏈為模板，按照堿基配對原則，在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下合成一條與DNA鏈的一定區(qū)段互補(bǔ)的RNA鏈，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)錄。第5頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子RNA合成方向：5'3'第6頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。編碼鏈與模板鏈編碼鏈：與RNA序列相同的那條DNA鏈，又稱正(+)鏈(plusstrand)、有意義鏈(sensestrand)模板鏈：指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈稱，又稱負(fù)(-)鏈(minusstrand)、反意義鏈(antisensestrand)第7頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第8頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上轉(zhuǎn)錄方向5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄方向DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因。結(jié)構(gòu)基因：第9頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄單元（transcriptionunit）一段從啟動子開始至終止子結(jié)束的DNA序列。第10頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一比較轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制的異同

相同：模板，新鏈延伸方向，堿基的加入原則。相異：①引物②信息全保留與信息半保留。③底物、與T配對的堿基④模板的數(shù)量（一條與兩條）。⑤所需要的酶，及酶的外切活性的有無。

返回第11頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●基本概念●轉(zhuǎn)錄起始：RNA聚合酶、啟動子●轉(zhuǎn)錄的基本過程●轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●終止和抗終止●內(nèi)含子的剪接、編輯、再編碼及化學(xué)修飾●RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)Contents第12頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一二、參與轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵酶與元件（一）RNA聚合酶●原核生物RNA聚合酶（大腸桿菌為例）全酶=核心酶+σ因子（P71,表3-2）σ因子負(fù)責(zé)模板鏈的選擇與轉(zhuǎn)錄的起始。不僅能增加聚合酶對啟動子的親和力，還降低它對非專一位點(diǎn)的親和力有許多不同的σ因子，識別不同的啟動子.在大腸桿菌中一般情況下起作用的是---σ70核心酶參與轉(zhuǎn)錄的全過程，但不能精確起始P67第13頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一因子RNA聚合酶要負(fù)責(zé)所有基因的轉(zhuǎn)錄，也就是說要識別所有轉(zhuǎn)錄單位的啟動子。因此，因子在RNA聚合酶識別啟動子的過程中起關(guān)鍵作用。因子的二級結(jié)構(gòu)屬于螺旋，是通過識別啟動子上的某一序列來控制RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合的。第14頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一目前已發(fā)現(xiàn)了至少4種因子。第15頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一在細(xì)菌受到外界環(huán)境的急劇影響時(shí)，會改變所表達(dá)的基因，產(chǎn)生因子更替的現(xiàn)象。如環(huán)境溫度升高時(shí)，大腸桿菌會開啟rpoH基因的表達(dá)，其產(chǎn)物32能識別熱激基因的啟動子，而正常狀態(tài)下表達(dá)的基因會關(guān)閉或表達(dá)水平下降。芽孢菌生活周期過程中生活方式的改變也是通過因子的更替完成的。第16頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第17頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第18頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動子識別βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動子第19頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一亞基可能參與全酶的組裝及全酶識別啟動子。另外，亞基還參與RNA聚合酶與一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子間的作用。亞基具有與底物（NTP及新生的RNA鏈）結(jié)合的能力。利福霉素可以阻斷轉(zhuǎn)錄的起始，鏈霉溶菌素可抑制延伸反應(yīng)，二者均是通過與亞基的結(jié)合而發(fā)揮作用的。第20頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一’亞基可能與模板結(jié)合。肝素可與’亞基結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄，并且可以和’亞基競爭DNA的結(jié)合位點(diǎn)。肝素是一種抗凝劑，由二中多糖交替而成的多聚體，在體內(nèi)外都有抗凝作用。臨床上主要用于血栓栓塞、心肌梗死、心血管手術(shù)，血液透析等等。亞基和’亞基提供了RNA聚合酶的活性中心，其一級結(jié)構(gòu)與真核生物RNA聚合酶大亞基有同源性。亞基的功能是幫助全酶識別啟動子并與之結(jié)合。亞基也可被看作一種輔助因子，因此又可稱為因子（sigmafactor）。第21頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第22頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●真核生物RNA聚合酶酶位置轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對活性對α-鵝膏蕈（xùn）堿的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質(zhì)hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核質(zhì)tRNA約10%存在物種特異性真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶特征比較α-鵝膏蕈堿是致死鵝膏菌屬中最毒的成分，它是一種含有幾種特殊氨基酸的環(huán)八肽，作用于真核生物細(xì)胞時(shí)，能專一性的抑制真核生物的RNA多聚酶Ⅱ，hnRNA不均一核RNA第23頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一RNA聚合酶Ⅰ位于核仁，活性所占比例最大，負(fù)責(zé)rRNA（5.8S、18S和28S）的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶Ⅰ負(fù)責(zé)了大部分細(xì)胞RNA的轉(zhuǎn)錄。(S為沉降系數(shù)，是某種顆粒在超速離心時(shí)沉降速度的數(shù)值，此數(shù)值與顆粒的大小直接成比例)RNA聚合酶Ⅱ位于核質(zhì)，活性所占比例僅次于RNA聚合酶Ⅰ，主要負(fù)責(zé)核內(nèi)不均一RNA(heterogenousnuclearRNA,hnRNA/mRNA前體）的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶Ⅲ也位于核質(zhì)，活性所占比例最小，負(fù)責(zé)tRNA、5SRNA、Alu序列和其他小RNA的轉(zhuǎn)錄。第24頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一真核生物的RNA聚合酶的分子量都很大，由8至16個(gè)亞基組成。經(jīng)純化的RNA聚合酶具有以DNA為模板合成RNA的能力，但不能正確地選擇啟動子。目前尚不能完成RNA聚合酶的體外重建，無法確定哪些亞基是活性所必需的。第25頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時(shí)進(jìn)行外切酶活性無5’3’，3’5’校對合成能力無有修復(fù)能力無有第26頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄復(fù)合物包括：RNA聚合酶、DNA、新生RNA的三元復(fù)合物。兩個(gè)途徑：（1）流產(chǎn)式復(fù)制；（2）組成延伸復(fù)合物。第27頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一（二）啟動子(promoter)啟動子定義：指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。第28頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●原核生物啟動子結(jié)構(gòu)Pribnow41-44bp原核基因轉(zhuǎn)錄起錄區(qū)的上游10堿基處（-10bp）的序列，在原核生物中，是一致序列如RNA聚合酶核心酶結(jié)合位點(diǎn)，其基本結(jié)構(gòu)是TATaATG。因普利布瑙首先報(bào)道，故名。

第29頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一大腸桿菌中部分啟動子第30頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識別的信號TATA區(qū)：酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)（富含AT堿基，利于雙鏈打開）第31頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一編碼鏈AACTGTATATTA模板鏈TTGACATATAAT3’5’DNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)Probnow盒子啟動子35

10

+1轉(zhuǎn)錄區(qū)5’3’RNA轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)與新生RNA鏈第一個(gè)核苷酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基。第32頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū)T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A10035區(qū)10區(qū)第33頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一原核啟動子區(qū)的經(jīng)典結(jié)構(gòu)－10區(qū)（Pribnow區(qū)）

保守序列：

TATAAT－35區(qū)（sextamabox）

保守區(qū)序列：

TTGACA第34頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一典型啟動子的結(jié)構(gòu)

-35-10轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp保守區(qū)第35頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一1sextamabox(-35區(qū))：RNA聚合酶識別位點(diǎn)，該序列提供了RNA聚合酶識別的信號。σ亞基識別-35序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板。這一序列的核苷酸結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了啟動子的強(qiáng)度。2Pribnowbox（-10區(qū)）：RNA聚合酶牢固結(jié)合位點(diǎn)，此處AT含量多，有助于DNA局部雙鏈解開。是使起始復(fù)合物由關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變成啟動狀態(tài)的特定序列此外，在啟動子上游部位還有一個(gè)代謝分解物基因激活蛋白（cataboliticgeneactivationprotein,CAP）結(jié)合位點(diǎn)。CAP是生物基因表達(dá)的一種正調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)它與cAMP形成復(fù)合物后，能改變構(gòu)象，提高對啟動子的親和力，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。原核啟動子保守區(qū)的功能第36頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

-10區(qū)序列對轉(zhuǎn)錄的效率影響:TATAAT→AATAAT，轉(zhuǎn)錄效率下降,稱為下降突變（downmutation）。TATGTT→TATATT，轉(zhuǎn)錄效率上升，為上升突變（upmutation）。以上突變?yōu)楹螘绊戅D(zhuǎn)錄效率？堿基的改變可能導(dǎo)致DNA雙鏈的雙螺旋發(fā)生改變，最終導(dǎo)致酶與DNA結(jié)合所需要的自由能增加或者降低，從而使轉(zhuǎn)錄的效率上升或者下降第37頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一SextamaBox與PribnowBox間距為17bp,有利于RNApol啟動l

SextamaBoxorPribnowBoxmut.17bp的間距較17bp的序列對轉(zhuǎn)錄更為重要2SextamaBoxandPribnowBoxmut.→轉(zhuǎn)錄率下降100X→轉(zhuǎn)錄率下降1000X第38頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一增強(qiáng)子及其功能：（1）遠(yuǎn)距離效益（2）無方向性（3）順式調(diào)節(jié)（4）增強(qiáng)效應(yīng)一般具有組織或細(xì)胞特異性（5）沒有物種和基因的特異性（6）有相位性（7）許多增強(qiáng)子還受外部信號的調(diào)控。第39頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●真核生物啟動子真核有三種不同的啟動子和有關(guān)的元件啟動子Ⅱ最為復(fù)雜，它和原核的啟動子有很多不同第40頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)核心啟動子（corepromoter）上游啟動子元件（upstreampromoterelement，UPE）真核生物有三種不同的啟動子，其中以第II類啟動子最為復(fù)雜，它由核心啟動子和上游啟動子元件兩個(gè)部分組成。與原核的啟動子有很多不同：（1）有多種元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）有的有遠(yuǎn)距離的調(diào)控元件存在，如增強(qiáng)子；（3）這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點(diǎn)的作用；（4）不直接和RNApol結(jié)合；（5）需多種轉(zhuǎn)錄因子介入。第41頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一1、核心啟動子●核心啟動子：指保證RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及起始位點(diǎn)上游的TATA盒。核心啟動子單獨(dú)起作用時(shí)，只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄

起始位點(diǎn)：

mRNA的第一個(gè)堿基傾向A

TATA框：

其一致序列是T85A97T93A85A63A83A50，

TATA框的作用：(1)選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始，故也稱為選擇子（selector）。(2)影響轉(zhuǎn)錄的速率。第42頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第43頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一2、上游啟動子元件●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等●作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。其中CAAT對轉(zhuǎn)錄起始頻率影響最大。CAAT：-70--80bpGGGCGG：-80--110bp第44頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

真核生物啟動子的基本結(jié)構(gòu)－75區(qū)－25區(qū)＋1CAATboxTATAbox(hognessbox)－80～－110區(qū)GCbox上游啟動子元件（UPE）核心啟動子（corepromoter）第45頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一除了啟動子外，還有許多序列與轉(zhuǎn)錄的起始有關(guān)，它們的存在，對真核生物的基因表達(dá)調(diào)節(jié)起著重要作用：如增強(qiáng)子（enhomcer）、減弱子（dehancer）、沉默子（sisencer）等第46頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一（三）轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物●原核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物第47頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄復(fù)合體TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的轉(zhuǎn)錄起始●真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物第48頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●基本概念●轉(zhuǎn)錄起始：RNA聚合酶、啟動子●轉(zhuǎn)錄的基本過程●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)●轉(zhuǎn)錄后加工Contents第49頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一三、轉(zhuǎn)錄的基本過程1、起始位點(diǎn)的識別：RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。第50頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一2、轉(zhuǎn)錄起始RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生第51頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一1.全酶與模板的DNA接觸，生成非專一的,不穩(wěn)定的復(fù)合物在模板上移動；2.起始識別：全酶與－35序列結(jié)合，產(chǎn)生封閉的酶-啟動子二元復(fù)合物（closedbinarycomplex）；3.全酶緊密地結(jié)合在-10序列處，模板DNA局部變性，形成開放的啟動子二元復(fù)合體（不可逆，快反應(yīng)）；4.酶移動到I，第一個(gè)NTP轉(zhuǎn)錄開始,（6-9個(gè)后）σ因子釋放,形成酶-啟動子-NTP三元復(fù)合體（ternarycomplex）。轉(zhuǎn)錄的起始第52頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一σα2ββ’5’5’原核生物轉(zhuǎn)錄起始過程第53頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

真核生物的轉(zhuǎn)錄起始真核生物RNA聚合酶不能直接識別基因的啟動子區(qū)，需要一些被稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的參與（P73,表3-5），才能形成轉(zhuǎn)錄起始。以RNA聚合酶II為例

第54頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄因子

能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactors,TF)。第55頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝啟動子TATA盒+TFⅡDTBP+D-A復(fù)合物(TFⅡD+TFⅡA)+TFⅡB+(RNA聚合酶+TFⅡF)復(fù)合物+TFⅡE

+TFⅡH（解旋酶、蛋白激酶）DNA解旋、RNA聚合酶C-端Ser磷酸化

從起始點(diǎn)向下游移動第56頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一TBP---TATAbindingproteinTAF---TBP-associatedfactors第57頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一3RNA鏈的延伸

延伸的過程中，RNA聚合酶沿著轉(zhuǎn)錄泡（DNA雙鏈解開而形成，約18堿基對）向前移動轉(zhuǎn)錄泡（transcriptionbubble）：在轉(zhuǎn)錄延長過程中，由局部打開的DNA雙鏈、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者結(jié)合在一起的復(fù)合體，為空泡狀結(jié)構(gòu)，又稱轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。第58頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一延伸過程中：1，以NTP為原料2，DNA雙鏈在RNA聚合酶的作用下快速解螺旋，隨后去螺旋3，除第一個(gè)堿基外，所以的核苷酸以共價(jià)鍵加合到RNA成長鏈的

3－OH末端，在去螺旋區(qū)形成RNA-DNA雜交鏈。在解螺旋后部，

DNA模板鏈又與原配對鏈重新形成雙螺旋，RNA以自由單鏈形式被擠出來4，RNA按5－3方向合成，沿模板鏈的3－5前進(jìn)5，RNA延長速度：30－50個(gè)核苷酸/秒/每分子酶

第59頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第60頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

電鏡下原核生物轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象：轉(zhuǎn)錄未完成，翻譯已開始進(jìn)行。第61頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一53DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶第62頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一4轉(zhuǎn)錄終止

幾個(gè)概念：終止子（terminator）：提供轉(zhuǎn)錄終止信號的一段DNA序列。終止子位于已轉(zhuǎn)錄的序列中，DNA的終止子可被RNA聚合酶本身或其輔助因子識別。終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識別終止子的蛋白質(zhì)輔助因子。有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使酶越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，稱為通讀，這類引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子（P92）。

第63頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一原核生物的兩種終止類型1不依賴于ρ(rho)因子的終止（強(qiáng)終止子）,也被稱為內(nèi)部終止子（intrinsicterminator）DNA模板上靠近終止處，有特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。2依賴于ρ(rho)因子的終止（弱終止子）,大多數(shù)已知的ρ-依賴型終止子是在噬菌體基因組中發(fā)現(xiàn)的,E.coli的ρ-依賴型終止子相對較少用T4噬菌體DNA在試管內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物比在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的要長。說明：①轉(zhuǎn)錄終止信號是可以跨越的；②細(xì)胞內(nèi)某些因素有執(zhí)行轉(zhuǎn)錄終止的功能。據(jù)此，69年,

J.Roberts發(fā)現(xiàn)了能控制轉(zhuǎn)錄終止的蛋白質(zhì)，定名為ρ因子第64頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一內(nèi)在終止子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(1)終止位點(diǎn)上游存在一個(gè)富含GC堿基的二重對稱區(qū)；(2)在終止位點(diǎn)前有一段由4-8個(gè)A組成的序列；

終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關(guān)，隨著發(fā)卡式結(jié)構(gòu)（至少6bp）和寡聚U序列(至少4個(gè)U)長度的增加，終止效率逐步提高。第65頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一發(fā)夾結(jié)構(gòu)與poly(U)回文序列的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致了發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成1不依賴于Rho的終止第66頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一特殊結(jié)構(gòu)終止轉(zhuǎn)錄的機(jī)制：發(fā)夾結(jié)構(gòu)改變RNA聚合酶構(gòu)象，使酶停止移動；DNA、RNA各自形成自身雙鏈?zhǔn)闺s交體不穩(wěn)定而分離；3′－端一連串U，UA配對最不穩(wěn)定，易從模板上脫落。第67頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第68頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一“Hairpin”WeakassociationA:UbasepairsareweakerthanG:C’s.第69頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一Stopsignalsexistattheendofthetranscript第70頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一Theterminatedmessage第71頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一2依賴于ρ因子的終止ρ因子：六個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)與β因子競爭結(jié)合RNA的3’末端ρ有ATP酶活性，但這種活性依賴于RNA，需要一個(gè)大于50個(gè)堿基的多聚核糖核酸的存在

第72頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一依賴于ρ因子的終止的特點(diǎn)：1轉(zhuǎn)錄的RNA也具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但發(fā)夾結(jié)構(gòu)后無poly(U)2形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)較疏松，莖環(huán)上不富含GC3終止需要ρ因子的參與第73頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

依賴因子的終止因子：六聚體蛋白、水解各種核苷三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。第74頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

RNAPol轉(zhuǎn)錄DNAρ因子附著到RNA

識別位點(diǎn)上

ρ因子跟在RNAPol

后沿RNA移動

RNAPol在終止位

點(diǎn)停下，并被ρ因子追上在轉(zhuǎn)錄泡中ρ因子使DNA-RNA雜種雙鏈解開轉(zhuǎn)錄終止,釋放出

RNAPol,ρ子和RNA返回第75頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一真核生物的轉(zhuǎn)錄終止真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的。真核生物mRNA帶有聚腺苷酸（polyA）尾巴的結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進(jìn)去的，因?yàn)樵谀０彐溕蠜]有相應(yīng)的聚胸苷酸（polydT）。

轉(zhuǎn)錄不是在polyA的位置上終止，而是超出數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在模板鏈讀碼框架的3′端之后，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當(dāng)多的CT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄越過修飾點(diǎn)后，mRNA在修飾點(diǎn)處被切斷，隨即加入polyA尾及5′-帽子結(jié)構(gòu)。余下的RNA雖繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，但很快被RNA酶降解。第76頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄的基本過程第77頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄的抑制（p83,表3-7）DNA模板功能抑制劑放線菌素DRNA聚合酶抑制劑利福霉素、利迪鏈霉素、α-鵝膏蕈堿

嘌呤和嘧啶類似物，抑制核酸前體合成。第78頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●基本概念●轉(zhuǎn)錄起始：RNA聚合酶、啟動子●轉(zhuǎn)錄的基本過程●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●轉(zhuǎn)錄后加工●RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)Contents第79頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一四、原核生物與真核生物mRNA的特征比較

1、原核生物mRNA的特征●半衰期短●多以多順反子的形式存在（原核）多順反子mRNA：編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。（真核）單順反子mRNA：只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。第80頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一結(jié)構(gòu)基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透過酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶ZYAOPDNA第81頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●5’

端無“帽子”結(jié)構(gòu)，3’

端沒有或只有較短的poly（A）結(jié)構(gòu)。SD序列：mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。第82頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一2、真核生物mRNA的特征●5’

端存在“帽子”結(jié)構(gòu)●多數(shù)mRNA

3’

端具有poly（A）尾巴（組蛋白除外）●以單順反子的形式存在“基因”的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。第83頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一原核生物和真核生物mRNA結(jié)構(gòu)的比較第84頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●基本概念●轉(zhuǎn)錄起始：RNA聚合酶、啟動子●轉(zhuǎn)錄的基本過程●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)●轉(zhuǎn)錄后加工Contents第85頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一五、RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)

相同點(diǎn)：1、都以DNA鏈作為模板2、合成的方向均為5’→3’

3、聚合反應(yīng)均是通過核苷酸之間形成的3’,5’-磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈延長。第86頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一不同點(diǎn)：復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩條鏈均復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對稱轉(zhuǎn)錄）原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代雙鏈DNA（半保留復(fù)制）mRNA，tRNA，rRNA配對A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物RNA引物無第87頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一●基本概念●轉(zhuǎn)錄起始：RNA聚合酶、啟動子●轉(zhuǎn)錄的基本過程●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)●轉(zhuǎn)錄后加工Contents第88頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一六、轉(zhuǎn)錄后加工第89頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄生成的RNA，稱為初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。無論在真核生物或原核生物中，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都經(jīng)過一定程度的修飾加工，才能表現(xiàn)其功能。第90頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄后的加工（posttranscriptionalmodification）：經(jīng)過一定程度的加工使初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變?yōu)槌墒斓霓D(zhuǎn)錄物（1）減少部分片段：如內(nèi)含子的剪接；（2）增加部分片段：5′加帽，3′加poly(A),通過編輯加入一些堿基；（3）對某些堿基進(jìn)行甲基化等修飾。第91頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一參與蛋白質(zhì)合成的tRNA和rRNA都不是最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(1)它們的5′端都是單磷酸，而原始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′應(yīng)是三磷酸；(2)成熟分子比初始轉(zhuǎn)錄物??；(3)tRNA含有特殊的堿基，這些堿基只有通過一些化學(xué)修飾才可以得到。

二真核生物tRNA和rRNA的加工第92頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一(1)tRNA的加工tRNA的加工分成3個(gè)階段(1)“斬頭”：形成5′末端；(2)“去尾”：形成3′-OH末端。缺CCA的tRNA要用tRNA核酸轉(zhuǎn)移酶加-CCA。

(3)修飾：通過甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等進(jìn)行修飾，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tU），D臂的2甲基鳥苷（2mG），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密碼子環(huán)上的2異戊腺苷（2ipA) 第93頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

(1)真核的前體分子tRNA是單順反子，但成簇排列，基因間有間隔區(qū)；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母約有400個(gè)tRNA基因；(3)5′端單磷酸核苷酸，表明已被加工過；(4)tRNA的前體分子中含有內(nèi)含子第94頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第95頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一tRNA的加工堿基修飾3’端5’端切除反密碼環(huán)的內(nèi)含子轉(zhuǎn)位---Tψ脫氨---AMPIMP還原---DHU甲基化---mAmGCCA-OHRNaseP切除多余的核苷酸RNaseP在前tRNA二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上第96頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一初級產(chǎn)物中有5’端的16個(gè)堿基和反密碼子后的14個(gè)堿基需要去除。甲基化還原核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)脫氨反應(yīng)3’端加上CCA-OH第97頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA前體RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA第98頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一RNAaseP、內(nèi)切酶第99頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶ATPADP第100頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一堿基修飾（2）還原反應(yīng)如：UDHU（3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：Uψ（4）脫氨反應(yīng)如：AI如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）第101頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

真核tRNA的加工和原核的區(qū)別(1)真核tRNA前體中無二聚體和多聚體；(2)增加了剪接內(nèi)含子的過程；(3)都要加CCA。第102頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一(1)原核生物rRNA的加工第103頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

rRNA的加工第104頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一rDNA內(nèi)含子基因間隔18s5.8s28s每個(gè)重復(fù)單位45s轉(zhuǎn)錄物3種rRNA前身剪接18srRNA5.8s/28srRNA

真核生物rRNA的加工第105頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一真核細(xì)胞中rRNA的加工途徑(1)切除5′端的前導(dǎo)序列；(2)從41S的中間產(chǎn)物中先切下18S的片段。(3)部分退火，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；(4)最后修正。第106頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第107頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一四膜蟲rRNA的結(jié)構(gòu)第108頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一四膜蟲rRNA內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪接方式5′-端核苷酸序列第109頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一5’端加帽3’端加尾RNA的剪接RNA的編輯mRNA的加工第110頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一5’端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。1、在5’端加帽

第111頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一m7Gppp鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶第112頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一5pppGp…5GpppGp…pppG

ppi鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶5

m7GpppGp…甲基轉(zhuǎn)移酶SAM帽子結(jié)構(gòu)的生成5ppGp…磷酸酶

Pi第113頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一帽子覆蓋了mRNA的5`端，它可在幾個(gè)位點(diǎn)被甲基化GAAGuanine-7-methyl-transferase2`-O-methyl-transferaseCap010~15%100%第114頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工5’和3’首尾的修飾剪接第115頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一5’加帽轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的第一個(gè)核苷酸pppG水解成5’-ppG或5’-pG與另一個(gè)三磷酸鳥苷生成三磷酸雙鳥苷第二個(gè)鳥嘌呤被甲基化加帽出現(xiàn)在hnRNA中，說明可能在細(xì)胞核中完成，并在剪接之前。第116頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一帽子結(jié)構(gòu)功能：①能被核糖體小亞基識別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合；②m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA5’末端，以保護(hù)mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。第117頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一真核生物mRNA中polyA的出現(xiàn)是不依賴于DNA模板的。加入polyA之前，先由核酸外切酶切去3’末端一些過剩的核苷酸，然后加入polyA。3’端修飾也是在細(xì)胞核中，在剪接之前進(jìn)行的。PolyA的有無與長短，是維持mRNA作為翻譯模板的活性，以及增加mRNA本身的穩(wěn)定性。2、3’端加尾第118頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一2、3’端加尾多聚腺苷酸尾巴AAUAAA：★準(zhǔn)確切割★加poly（A）第119頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一第120頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一多聚腺苷酸尾巴功能：提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。第121頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一3mRNA的剪接1.

hnRNA

和snRNA

核內(nèi)的初級mRNA稱為雜化核RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)snRNA(smallnuclearRNA)核內(nèi)的蛋白質(zhì)小分子核糖核酸蛋白體（并接體,splicesome）snRNA第122頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。斷裂基因(splitegene)CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)第123頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)外顯子在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。第124頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾第125頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA第126頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一真核細(xì)胞mRNA的剪接DNA模板與hnRNA是完全配對的，而成熟的mRNA與hnRNA或DNA雜交都只是部分配對。因此真核生物的基因有斷裂性。第127頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一內(nèi)含子的分類

根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內(nèi)含子分為4類。I：主要存在于線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也發(fā)現(xiàn)于線粒體、葉綠體，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNA；III：是常見的形成套索結(jié)構(gòu)后剪接，大多數(shù)mRNA基因有此類內(nèi)含子；IV：是tRNA基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的內(nèi)含子，剪接過程需酶及ATP。第128頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一核酶——具有催化功能的RNA酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)這一概念根深蒂固.但是美國科羅拉多大學(xué)的Cech等人的出色工作卻從根本上改變了人們的這一認(rèn)識.他們闡明了四膜蟲(Tetrahymena)35sRNA的拼接機(jī)制,并證明了L-19分子具有polyc聚合酶活性.從此人們開始認(rèn)識到某些RNA也具有酶的功能.這些能夠催化RNA剪接的由RNA組成的酶被稱作“核酶”(ribozyme).從廣義上講,核糖體也是一種核酶.正是由于發(fā)現(xiàn)了核酶,Cech與Altman分享了1989年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).如今,人們對核酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的研究已經(jīng)比較深人,在應(yīng)用方面也取得了很大的進(jìn)展，如可以通過人工合成核酶的槌頭結(jié)構(gòu)破壞HIV病毒.

第129頁，共148頁，2023年，2月20日，星期一

核酶參與I、II類內(nèi)含子的剪接：自我剪接I、Ⅱ類內(nèi)含子中，已發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分是屬于自身剪接內(nèi)含子，由RNA分子起酶的作用而催化剪接

I類內(nèi)含子的剪接機(jī)制：轉(zhuǎn)酯反應(yīng)(transesterification)

酯鍵從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置，需鳥苷的輔助。（p99圖3-27）II類內(nèi)含子的剪接機(jī)制：無需鳥苷的輔助，但需鎂離子的存在。分枝點(diǎn)A的2′-O對5′端交界處的磷酸二酯鍵發(fā)動親核進(jìn)攻，產(chǎn)生了套索（lariat）結(jié)構(gòu)（p100圖3-28