腫瘤生物治療試驗(yàn)室常用試驗(yàn)方法

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腫瘤生物治療試驗(yàn)室常用試驗(yàn)方法

生物治療國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室

2023,09

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1.大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）

生物治療國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室李炯

此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、連接、PCR擴(kuò)增等常規(guī)分子生物學(xué)反應(yīng)，但一般不適合轉(zhuǎn)染等較高要求的試驗(yàn)。1.取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物于EP管中，約1000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細(xì)菌沉淀盡量枯燥；

2.將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100μl溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，振蕩或槍尖吹打重懸細(xì)菌；3.參與200μl新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，蓋緊EP管口，快速顛倒離心管5次，以混合均勻，確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面與溶液II接觸，不要渦旋，臵于冰浴中；（此步為裂解細(xì)菌，裂解后的液體會(huì)拉出絲狀）4.參與150μl預(yù)冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸鉀，11.5ml冰乙酸，28.5mlH2O)，蓋緊EP管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管臵于冰上3~5分鐘；5.在最大轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液于另一新EP管；

6.用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合于室溫放臵2分鐘，最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘；

7.防備棄上清，注意勿觸動(dòng)沉淀，加1ml70%乙醇洗滌沉淀，用12,000g離心2分鐘，棄上清瞬時(shí)離心將附于管壁的液體吸出，將EP管開口臵于室溫5~10min使乙醇揮發(fā)，用適量的ddH2O溶解。8.參與0.5μl的RNase（10mg/ml）37℃溫育5~10分鐘；9.電泳鑒定。

附：質(zhì)粒DNA的快速抽提適用于快速鑒定細(xì)菌中質(zhì)粒的有無(wú)、大小或含量高低等，得到的質(zhì)粒僅可用于電泳或轉(zhuǎn)化，不適于其它與分子生物學(xué)反應(yīng)。1.取菌液100~500μl，10000g離心1min；2.棄上清，參與20~50μlddH2O重懸菌體；3.參與等體積酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）混勻；4.10000g離心3~5min；

5.防備取出上清即可用于電泳鑒定或轉(zhuǎn)化。

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2．瓊脂糖核酸電泳

生物治療國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室李炯

1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗清白，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架

好梳子；試驗(yàn)室有幾種不同廠家的模具和梳子，請(qǐng)注意配套使用；2.根據(jù)欲分開DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適合濃度的瓊脂糖凝膠：確鑿

稱量瓊脂糖干粉，參與到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi)，定量參與電泳緩沖液（一般20~30ml）；

3.放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，參與一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分

混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，注意不能產(chǎn)生氣泡，若有氣泡則設(shè)法排除，靜臵，待其凝固；

4.室溫下30~45分鐘后凝膠完全凝結(jié)，防備拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒(méi)過(guò)膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣

泡，應(yīng)設(shè)法除去；

6.在DNA樣品中參與10×體積的載樣緩沖液（loadingbuffer），混勻后，用槍

將樣品混合液緩慢參與被浸沒(méi)的凝膠加樣孔內(nèi)；

7.接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)(靠

近加樣孔的一端為負(fù))。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可；8.根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位臵，判斷是否終止電泳；一般前端染料到2/3處即可；9.電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀測(cè)電泳帶及其位臵，并與核酸分子

量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。

瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最正確分辯范圍瓊脂糖凝膠濃度0.5%0.7%1.0%1.2%1.5%

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線形DNA的最正確分辯范圍（bp）1,000～30,000800～12,000500～10,000400～7,000200～3,0002.0%50～2,0003．乙醇沉淀DNA

生物治療國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室李炯

1.參與1/10體積的乙酸鈉（3mol∕L，PH=5.2）或溶液Ⅲ于DNA溶液中充分混

勻，使其最終濃度為0.3mol∕L；

2.參與2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇混合后再次充分混勻臵于-20℃中15~30分鐘；3.12,000g離心10分鐘，防備移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4.參與1/2離心管容量的70％乙醇，12000g離心2分鐘，防備移出上清液，吸

去管壁上所有的液滴；

5.于室溫下將開蓋的EP管的臵于試驗(yàn)桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干；6.加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。

4．膠回收純化DNA

生物治療國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室李炯

膠回收DNA請(qǐng)注意避免回收過(guò)程的污染，電極裝臵及整個(gè)液體系統(tǒng)最好與平日電泳系統(tǒng)分開。

1.瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；2.依照每100mg加400μl的量參與bindingbuffer，放入到EP管振蕩器中，45℃～55℃溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解（大約要5分鐘）；

3.取出純化柱，將上述溶解液轉(zhuǎn)移至柱中，室溫下放臵2分鐘，8,000rpm離心1分鐘，棄EP管中的液體，將純化柱放回EP管中；

4.加500μl的washbuffer至柱中，8,000rpm離心1分鐘。棄管中的溶液；5.重復(fù)操作4步的操作1次，最終將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的washbuffer；

6.將純化柱放入一個(gè)新的EP管。加30~40μlH2O或者elutionbuffer至純化柱膜的中央，在37℃或50℃下放臵2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將

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EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。

7.注：若想要不電泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100μl液量加400μl的bindingbuffer,其余的步驟不變。

5．酶切

生物治療國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室李炯

1.酶切前確定待切樣品的濃度,并選擇適合的限制性內(nèi)切酶和配套Buffer。2.在離心管中參與如下成分：

10×Buffer1μl待切樣品xμl酶0.5-1μl加水補(bǔ)足10μl

3.混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

4.將離心管臵于37℃中溫育1-3hr，若待切樣品為PCR產(chǎn)物，則可將反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。

5.用未酶切的質(zhì)粒作為對(duì)照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。

注：當(dāng)酶切樣品用于回收而不是鑒定時(shí)，可按比例適當(dāng)加大反應(yīng)體積。雙酶切可選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反應(yīng)。）

6．連接

生物治療國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室李炯

1.連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。2.在離心管中參與如下成分：

10×連接Buffer1μl

待連接的樣品（膠回收產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物，載體與片段的mol比為1∶3-5）連接酶0.