液相色譜故障分析和維護(hù)

液相色譜故障分析和維護(hù)第1頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日采用“HPLC”級(jí)溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對(duì)試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小流動(dòng)相的選擇液相色譜柱對(duì)流動(dòng)相的要求第2頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶與檢測(cè)器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長(zhǎng)等等第3頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日水的等級(jí)純化水蒸餾水去離子水波長(zhǎng)(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無(wú)機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率流動(dòng)相的選擇第4頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve鬼峰的出現(xiàn)流動(dòng)相的選擇第5頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日溶劑的等級(jí)HPLC級(jí)優(yōu)級(jí)純分析純都經(jīng)過(guò)蒸餾和0.45u的過(guò)濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級(jí)經(jīng)過(guò)0.2μm的過(guò)濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫流動(dòng)相的選擇第6頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日甲醇乙睛正己烷分析純級(jí)和HPLC級(jí)溶劑的吸光度比較圖流動(dòng)相的選擇第7頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日濾膜類(lèi)型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶劑。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和

有機(jī)溶劑溶劑的過(guò)濾第8頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡第9頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日檢測(cè)器氣泡第10頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日脫氣的目的防止由溶解（在液體中的）氣體量的變動(dòng)引起的檢測(cè)信號(hào)不穩(wěn)定

1）示差折射率檢測(cè)器：*使折射率變化

2）UV檢測(cè)器（200nm以下）：*溶解氧氣有吸收

3）熒光檢測(cè)器：*溶解氧氣有消光作用第11頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日流動(dòng)相脫氣的方法加熱簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波簡(jiǎn)單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)（氟樹(shù)脂膜的減壓脫氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度第12頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日樣品處理使用流動(dòng)相溶解樣品

--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)尤為重要

--保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀· 第13頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日裝置：

高壓梯度：用兩臺(tái)高壓輸液泵將兩種溶劑輸入低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動(dòng)相輸入到色譜柱中。梯度洗脫法優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度第14頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日梯度洗脫法的注意點(diǎn)溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器（如示差折光檢測(cè)器）查看空白實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。第15頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日緩沖液

選擇緩沖液的步驟

1.確定最佳分離狀態(tài)時(shí)的流動(dòng)相pH2.選擇具有與流動(dòng)相的pH相近的pKa的緩沖液

（即使?jié)舛认∫簿哂休^強(qiáng)能力的緩沖液）3.確認(rèn)檢測(cè)波長(zhǎng)下緩沖液是否有大的吸收

（在波長(zhǎng)210nm附近進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，

不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）第16頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日緩沖液的使用

使用前必須過(guò)濾

使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞第17頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日分離的簡(jiǎn)單原則出得來(lái)；分得開(kāi)；盡量快。第18頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題

不要總是首先埋怨色譜柱!!!第19頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日常見(jiàn)問(wèn)題及其對(duì)策液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題類(lèi)型

A.壓力異常（偏高、波動(dòng)）B.漏液C.保留時(shí)間漂移D.基線問(wèn)題（漂移、噪聲）E.峰形異常第20頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)象：無(wú)壓力，流動(dòng)相不流動(dòng)可能原因

1、保險(xiǎn)絲斷或電源問(wèn)題

2、柱塞桿折斷

3、泵頭內(nèi)有空氣或流動(dòng)相不足

4、單向閥損壞

5、漏液

6、壓力傳感器損壞(流動(dòng)相流動(dòng)正常，但無(wú)壓力)壓力異常第21頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏高或不斷上升

1、流速設(shè)定過(guò)高

2、保護(hù)柱或柱子篩板堵塞

3、流動(dòng)相使用不當(dāng)或有緩沖鹽析出

4、色譜柱選擇不當(dāng)

5、進(jìn)樣閥損壞

6、線路過(guò)濾器堵塞壓力異常第22頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏低

1、流速設(shè)定過(guò)低

2、色譜柱選擇不當(dāng)

3、柱溫過(guò)高

4、系統(tǒng)漏液壓力異常第23頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日壓力異?，F(xiàn)象：壓力波動(dòng)可能原因泵頭中有氣泡單向閥損壞柱塞密封圈損壞脫氣不充分系統(tǒng)漏液使用了梯度洗脫第24頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日漏液接頭處漏液

1、接頭處松動(dòng)

2、接頭磨損

3、接頭被污染

4、部件不匹配

第25頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日漏液泵漏液

1、單向閥松動(dòng)

2、泵密封損壞

3、放空閥損壞

4、接頭松動(dòng)（不要擰的太緊）第26頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日檢測(cè)器漏液可能原因

1、流通池墊片損壞

2、流通池透鏡破碎

3、手緊接頭處漏液

4、進(jìn)樣針尺寸不合適

5、廢液管堵塞

6、流通池堵塞漏液第27頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

可能原因

1、柱溫變化

2、流動(dòng)相組分變化

3、色譜柱沒(méi)有平衡

4、流速變化

5、泵中有氣泡

6、流動(dòng)相選擇不當(dāng)

7、鍵合相流失

8、緩沖容量不夠保留時(shí)間漂移第28頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日基線漂移可能原因

1、溫度波動(dòng)

2、流動(dòng)相不均勻(脫氣，使用純度更高的溶劑)3、流通池被污染或有氣泡

4、流通池窗口破裂

5、流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化

6、柱子平衡（約30－60min）基線問(wèn)題第29頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日基線漂移可能原因

7、流動(dòng)相污染，變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

8、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)以饅頭樣峰被洗出

9、檢測(cè)器沒(méi)有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處基線問(wèn)題第30頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日基線噪聲（規(guī)則的）可能原因

1、流動(dòng)相、泵、檢測(cè)器中有氣泡

2、有地方漏液

3、流動(dòng)相混和不均勻

4、溫度影響（檢測(cè)器和柱溫差別太大）

5、其他電子設(shè)備的影響基線問(wèn)題第31頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日基線噪聲（不規(guī)則的）可能原因

1、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成

2、有地方漏液

3、流動(dòng)相各溶劑不相溶或混和不均勻

4、流通池污染

5、檢測(cè)池能量不足

6、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡基線問(wèn)題第32頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜峰分裂柱外死體積柱頭填料污染部分阻塞進(jìn)樣閥密封問(wèn)題化合物一起洗脫第33頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜峰展寬所有的色譜峰展寬柱效降低進(jìn)樣體積太大部分色譜峰展寬上次進(jìn)樣洗脫的色譜峰蛋白或聚合物等高分子量化合物第34頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜峰拖尾部分色譜峰拖尾次級(jí)保留效應(yīng)–

殘留硅醇基的作用在大峰的尾部有小峰所有色譜峰拖尾柱外效應(yīng)柱頭污染重金屬離子色譜柱填充不理想第35頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日前伸峰色譜柱沒(méi)有充分平衡在主峰前有小色譜峰第36頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日負(fù)峰檢測(cè)器輸出信號(hào)的極性相反樣品的吸收小于流動(dòng)相，流動(dòng)相不純樣品溶劑干擾示差折光檢測(cè)器中樣品的折射率較低進(jìn)樣中帶入氣泡第37頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

可能原因

1、樣品過(guò)載

2、樣品溶劑選擇不當(dāng)變形峰第38頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日鬼峰1、進(jìn)樣閥殘余峰2、樣品中未知物3、柱未平衡4、水污染5、三氟乙酸氧化第39頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日液相色譜實(shí)用技術(shù)（二）色譜柱的使用及保養(yǎng)第40頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日1.柱頭螺絲2.過(guò)濾篩板3.色譜柱管刃環(huán)4.柱頭壓帽5.色譜柱柱管

色譜柱結(jié)構(gòu)第41頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

3微米多孔二氧化硅微球第42頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日固定相基質(zhì)類(lèi)型第43頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日Si-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-H硅膠顆粒表面硅羥基鍵合相Si-O-HSi-O-SiSi-O-Si-O-SiSi-O-Si液相色譜固定相第44頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日烷基鍵合固定相表面第45頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)測(cè)定柱效（說(shuō)明書(shū)+實(shí)際條件）保留在新色譜柱上測(cè)得的色譜圖，并記錄條件定期檢測(cè)柱效定期檢測(cè)儀器的譜帶展寬第46頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱的使用及操作流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換流速（壓力）的變化幅度溫度的變化幅度專(zhuān)用色譜柱∶樣品及溶劑的要求第47頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱的保養(yǎng)（一）樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用第48頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱的保養(yǎng)（二）流動(dòng)相方面除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例第49頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動(dòng)相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過(guò)濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱第50頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日在線過(guò)濾器In-LineFilter，部件號(hào)WAT084560防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效在需要高柱效的分析時(shí)中常用（如：氨基酸分析）在色譜柱類(lèi)型特殊時(shí)使用可更換的消耗品更換濾芯，部件號(hào)WAT005139(5/pkgs)更換墊圈，部件號(hào)WAT084567(10/pkgs)第51頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響到整個(gè)色譜柱的柱效，特別是在用微柱時(shí)保護(hù)柱的種類(lèi)普通自裝填料的保護(hù)柱Waters的部件號(hào)，WAT084550，用戶自裝填料影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān)，柱效降低較大Guard-Pak預(yù)裝保護(hù)柱Waters的部件號(hào)，WAT088141有各種填料的預(yù)裝柱供選擇，使用方便。填料容積較小，也引起柱效降低第52頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日可換芯式保護(hù)柱第53頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日新型的保護(hù)柱—SentryGuard適應(yīng)的用戶類(lèi)型非常臟,非常復(fù)雜的樣品本底生化樣品,溶液環(huán)境樣品食品不想做太多的固相萃取不想降低柱效第54頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日新型的保護(hù)柱—SentryGuard第55頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日SentryGuard的特點(diǎn)特點(diǎn)高質(zhì)量,高效填料-不損失柱效增加分析柱效-增加適應(yīng)范圍20mm柱長(zhǎng)-臟樣品載荷能力大，能延長(zhǎng)保護(hù)柱壽命手可擰緊接頭，安裝時(shí)不需要工具通用柱套-適用于所有的HPLC柱(3.9及4.6內(nèi)徑)整體式（對(duì)Waters柱）-使用方便，容易各種不同填料配合Waters柱第56頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日SentryGuard的規(guī)格產(chǎn)品描述3.920mm柱長(zhǎng)適應(yīng)任何色譜柱，不需工具即可安裝及更換可換柱芯式設(shè)計(jì)，提供各種填料:BondaPak: C18,phenyl,CN,NH2,SilicaNova-Pak: C18,C8,phenyl,CN,SilicaResolve: C18,C8,SilicaDelta-Pak: C18,C4Symmetry: C18,C8第57頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱的清洗對(duì)所做的樣品要有充分的了解用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗第58頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽等等合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動(dòng)防止細(xì)菌生長(zhǎng)注意存放的溫度第59頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱儲(chǔ)存固定相儲(chǔ)存溶劑反相(C18,C8,C4,etc.)甲醇或乙腈Phenyl甲醇或乙腈

CN(反相)乙腈CN(正相)

3:97Heptane:IPA

NH2,Diol,Silica

3:97Heptane:IPA

第60頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱常見(jiàn)毛病柱壓過(guò)高多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異不同溫度有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低第61頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日柱壓過(guò)高

為什么柱壓會(huì)過(guò)高微粒堵塞樣品流動(dòng)相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長(zhǎng)第62頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過(guò)濾片部分堵塞樣品、流動(dòng)相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動(dòng)相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理?yè)p壞機(jī)械震動(dòng)造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯第63頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日重復(fù)性差、回收率低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差色譜柱被污染流動(dòng)相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過(guò)強(qiáng)或流動(dòng)相過(guò)弱非特異性吸附第64頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱以外的因素（一）“柱效”問(wèn)題，不一定是色譜柱問(wèn)題！儀器問(wèn)題：連接不好造成死體積進(jìn)樣器檢測(cè)器管路，連接口保護(hù)柱在線過(guò)濾器堵塞流動(dòng)相問(wèn)題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大第65頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日色譜柱與儀器的聯(lián)接除HP外，不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)時(shí)，會(huì)造成：色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏解決辦法：自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）這種錐箍在不銹鋼管上是活動(dòng)的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。從PhaseSeparations公司能得到一些PEEK工程塑料的接頭，可用在所有類(lèi)型的色譜柱上的。第66頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日Waters色譜柱的聯(lián)接Waters及PhaseSeparations錐箍及螺母相同，但錐箍前露出不銹鋼管長(zhǎng)度不同，其長(zhǎng)度被稱(chēng)為：“stop-depth”Waters除Spherisorb以外的各種品牌的色譜柱用的是“Waters”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth的長(zhǎng)度為0.130英寸Spherisorb品牌的色譜柱及PhaseSeparations公司其他品牌色譜柱用的是“Parker-style”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth為0.090英寸第67頁(yè)，共72頁(yè)，2023年，2月20日，星期日HPLC常用的色譜柱接頭TroubleshootingLCFittings,PartII.J.W.DolanandP.Upchurch.LC/GCMagazine6:788(1988)0.09in.=2.33mmSw