基因工程育種微生物遺傳育種課件

1第五章基因工程育種

Geneticengineering

基因工程是將不同生物的基因在體外人工剪切組合，并和載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒）DNA連接，然后轉(zhuǎn)入微生物或細胞內(nèi)，進行擴增，并使轉(zhuǎn)入的基因在細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。2奠定基因工程的三項關鍵技術DNA的特異切割

Smith和Nathans

獲1978年諾貝爾醫(yī)學獎DNA的分子克隆

Berg（1972）將猴病毒SV40DNA與λ噬菌體基因融合，成功構(gòu)建重組DNA；

Cohen和Boyer（1973）將質(zhì)粒pSC101與R的tetrkmr基因融合，并將重組DNA轉(zhuǎn)化E.coli，首次實現(xiàn)了DNA的分子克隆。DNA的快速測序

Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化學法DNA快速測序技術

1980年諾貝爾化學獎：Berg,Gilbert,Sanger3分離或合成基因；通過體外重組將基因插入載體；將重組DNA導入細胞；擴增克隆的基因；篩選重組體克?。粚寺〉幕蜻M行鑒定或測序；控制外源基因的表達；得到基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物基因工程操作的主要步驟51、寄主控制的限制與修飾作用（1）寄主控制的限制作用(Restriction)作用：破壞外源DNA，使之迅速降解機制：限制性核酸內(nèi)切酶，識別特定的堿基序列并進行切割（2）寄主控制的修飾作用(Modification)作用：保護自身的DNA，使之不受限制機制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。62、限制性核酸內(nèi)切酶的類型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型功能限制、修飾限制限制、修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不同亞基單一成分2種不同亞基所需輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識別序列EcoB:TGA(N)8TGCT4~8bp,旋轉(zhuǎn)對稱EcoPI:AGACC切割位點距識別位點至少1000kb處隨機切割在識別序列內(nèi)（或附近）距識別位點3’-端24~26bp處73、限制性核酸內(nèi)切酶的命名用產(chǎn)生菌的屬名一個字母(大寫，斜體)＋種名兩個字母(小寫，斜體)[＋菌株名一個字母]＋編號（羅馬數(shù)字）[例]EcoRI,EcoRII：從E.coli

Rye13菌株中獲得HindI，HindII，HindIII：從Haemophilusinfluenzae

d菌株獲得9（2）切割：產(chǎn)生平末端：SmaI5’-CCC↓GGG-3’3’-GGG↑CCC-5’產(chǎn)生3’-OH單鏈粘性末端:PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’產(chǎn)生5’-P單鏈粘性末端:EcoRI5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↑G-5’1011酶剪切條件需要鎂離子的存在，特定的酸堿度和離子強度。輔助條件：DTT、牛血清蛋白。抑制因子：雜蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、高鹽濃度。其它：甘油濃度等可以改變對序列的識別。13

兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶

BamHI:G↓GATCCBglⅡ：T↓GATCA（4）同尾酶(isoocaudamer)14二、DNA連接酶（DNAligase）

催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5’-P與3’-OH之間形成磷酸二酯鍵。1、體外DNA連接連接具有互補粘性末端的DNA片段連接具有平末端的DNA片段先在DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，再行連接152、連接用酶（1）T4DNA連接酶：催化反應需要Mg+2,ATP催化粘性末端連接，效率較高催化平末端連接（2）大腸桿菌連接酶催化反應需要NAD+只能催化粘性末端的連接17三、反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)催化以mRNA為模板的cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：互補于mRNA的DNA片段內(nèi)含子外顯子

DNA↓轉(zhuǎn)錄前體mRNA↓修飾成熟mRNA18Reversetranscription19四、末端轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)催化將脫氧核苷酸連接至DNA分子末端的3’-OH上向3’-單鏈末端上連接：Mg+2向平末端上連接：Co+2五、TaqDNA聚合酶來源：棲熱水生菌Thermusaquaticus21一、質(zhì)粒載體1、質(zhì)粒的一般生物學特性

(1)環(huán)狀雙鏈質(zhì)粒DNA的構(gòu)型共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA):兩條鏈均保持完整的環(huán)狀構(gòu)型，通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型開環(huán)DNA(ocDNA)：一條鏈保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口，即OC構(gòu)型線形DNA(lDNA)：質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶的切割后，發(fā)生雙鏈斷裂，稱L構(gòu)型2223(2)表型效應性別：F，SCP1抗生素類物質(zhì)合成：SCP1，Col抗藥性：R分解性質(zhì)粒：CAM(樟腦)，TOL(甲苯)酶的合成：Rye13隱蔽性質(zhì)粒(crypticplasmid)：2m25接合類型接合型質(zhì)粒(conjugative)

非接合型質(zhì)粒(nonconjugative)質(zhì)粒的不親和性(incompatibility)

在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。同一不親和群：不能共存于同一細胞中不同的不親和群：能共存于同一細胞中26(4)質(zhì)粒的命名①質(zhì)粒名以三個英文字母加阿拉伯數(shù)字表示

pUC19plasmid發(fā)現(xiàn)者或?qū)嶒炇颐幪?小寫）（大寫）29（2）克隆質(zhì)粒載體3031質(zhì)粒分離的步驟：粗提精提32氯化銫梯度離心法：有效地去除蛋白質(zhì)、RNA、染色體DNA、受損質(zhì)粒。33二、l噬菌體克隆載體1、優(yōu)點遺傳學背景十分清楚載體容量大，~23kb具有較高的感染效率2、類型插入型載體:較小片段DNA的插入（10kb以內(nèi)）；取代型載體：較大片段DNA的插入；重組DNA分子大小為l噬菌體DNA的75～105％；野生型λDNA為48kb，λ噬菌體的包裝上限是51kb。編碼必要基因的DNA區(qū)段占28kb，因此λ載體克隆外源DNA的理論極限值應是23kb。34插入型載體35取代型載體363、l噬菌體克隆載體的導入轉(zhuǎn)染：用λ重組體DNA分子直接感染大腸桿菌，使之侵入寄主細胞內(nèi)。效率低：未經(jīng)任何基因操作處理的新鮮制備的λDNA，其典型的轉(zhuǎn)染效率也僅為105～106噬菌斑/微克λDNA，體外連接的結(jié)果，轉(zhuǎn)染效率便下降到了104～103左右。λDNA的體外包裝：在離體條件下，將重組體DNA包入噬菌體等病毒顆粒，形成有感染功能的病毒載體。37三、柯斯質(zhì)粒載體(cosmidvector)

由l噬菌體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建而成。含有來自質(zhì)粒的一個復制起點、抗藥性標記、一個或多個限制酶單一位點，來自l噬菌體粘性末端的DNA片段（cos位點）。38優(yōu)點具有l(wèi)噬菌體的特性，在體外包裝后具有噬菌體的高效感染力；具有質(zhì)粒DNA的復制方式；具有克隆大片段外源DNA的能力(45kb)；具有與同源序列的質(zhì)粒進行重組的能力39柯斯克?。╟osmidcloning）應用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術40第三節(jié)基因工程的基本操作一、目的基因的獲得1、從供體細胞的DNA中分離

（基因文庫的構(gòu)建）基因文庫：某生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。如“鳥槍法”(ShotgunMethod)41步驟提取染色體DNA限制酶解電泳分離與載體連接導入宿主篩選陽性克隆422、從mRNA合成cDNA(cDNA文庫構(gòu)建）所謂cDNA文庫是指某生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。43步驟提取mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈合成cDNA第二鏈與載體連接導入宿主細胞篩選陽性克隆443、PCR體外擴增目的基因PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶鏈式反應：利用特殊的DNA聚合酶，在體外擴增位于兩段已知序列之間的特定DNA區(qū)段的方法。(1)PCR組成：含目標DNA序列的模板DNA寡核苷酸引物DNA聚合酶：Taq或PfudNTPs緩沖體系和金屬離子45(2)PCR過程變性(denaturation)：90℃以上退火(annealing)：40~60℃延伸(extension)：72℃

如此進行20~40個循環(huán)，DNA量擴增106~107倍。4647484、基因的化學合成主要應用于已知核苷酸序列的、分子量較小的基因的制備。通常先合成一定長度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再組裝成完整的基因。方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法和自動化法等。49二、目的DNA與載體的連接1、粘性末端連接2、平齊末端連接3、同聚末端連接4、人工接頭連接50三、重組DNA導入宿主細胞1、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染2、體外包裝與感染3、電穿孔法electroporation常用宿主系統(tǒng)51過程：連接反應的混合液+感受態(tài)細胞;

冰浴10至30分鐘;

熱休克0.5至2分鐘;

加入培養(yǎng)基37C振蕩培養(yǎng)1小時;

涂布平板，培養(yǎng)。52四、重組體的篩選與鑒定1、遺傳學方法：檢測選擇性標記2、核酸雜交方法：檢測目的基因3、免疫化學方法：檢測目的基因產(chǎn)物4、直接檢出法：檢測目的基因產(chǎn)物53五、DNA序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法1、試劑引物模板：待測序DNADNA聚合酶dNTPsddNTP542、測序反應3、制備聚丙烯酰胺凝膠3、凝膠加樣4、電泳5、結(jié)果記錄與分析555657六、外源基因的表達影響表達的因素細胞中基因拷貝數(shù)：拷貝數(shù)多，產(chǎn)物多轉(zhuǎn)錄水平：啟動子與RNA多聚酶的統(tǒng)一翻譯水平：mRNA的核糖體結(jié)合部位與宿主核糖體的統(tǒng)一；密碼子與tRNA的統(tǒng)一；mRNA的穩(wěn)定性外源基因的插入方向轉(zhuǎn)錄后的修飾及翻譯后的修飾58第四節(jié)基因工程的實際應用微生物發(fā)酵病毒疫苗哺乳動物蛋白（人源蛋白藥物）轉(zhuǎn)基因動植物環(huán)境生物技術基因診斷與基因治療蛋白質(zhì)工程（定點突變、定向進化）代謝工程59復習題1、何謂基因工程？基因工程操作主要步驟。2、何謂限制性核酸內(nèi)切酶？Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶有何特點？3、克隆載體的基本要求。4、質(zhì)粒的表型效應、分類、命名。5、目的基因的獲得途徑6、名詞：基因文庫、cDNA文庫、PCR、質(zhì)粒不親和性60插入鈍化/失活（insertionalinactivation)由于外源DNA插入到某一基因內(nèi)而使其功能喪失的現(xiàn)象。受體細胞是Amp、Tet的敏感型在Amp+Tet培養(yǎng)基上生長的是野生型質(zhì)粒只在Amp培養(yǎng)基上生長的帶有重組質(zhì)粒選擇性標記篩選61b-半乳糖苷酶顯色反應（藍白斑篩選）

β-半乳糖苷酶能將無色底物X-gal切割成半乳糖和深藍色的5-bromo-4-chloroindigo，菌落呈藍色宿主基因合成的是缺失N-末端11~41氨基酸的缺陷型酶，無活性pUC系列等質(zhì)粒具有l(wèi)acZ’基因，所編碼酶的N-末端片段與宿主基因產(chǎn)物組成有活性的酶（α-互