蛋白質純化技術Lite

分子生物學圣經—分子克隆實驗指南現在是1頁\一共有81頁\編輯于星期五為什么要純化蛋白質？理論意義：深入研究某種蛋白質的功能以及作用機制，如信號通路中的蛋白質…應用價值蛋白質工程醫(yī)藥、工業(yè)、科研…作為藥物靶點…蛋白質是生命功能的執(zhí)行者現在是2頁\一共有81頁\編輯于星期五蛋白質工程中進行蛋白質純化的必要性首先，需要單一的蛋白質作為實驗材料，研究其結構與功能；其次，對蛋白質進行修飾改造時需要單一的蛋白質作為原材料；最后，為了生產性能更優(yōu)良的蛋白質，需要對設計改造過的蛋白質進行大量純化，從而開發(fā)出相關產品?，F在是3頁\一共有81頁\編輯于星期五本章概要蛋白質純化方法蛋白質純化原則純化步驟蛋白質的鑒定現在是4頁\一共有81頁\編輯于星期五一、蛋白純化方法蛋白質純化的根據：

不同的蛋白質，理化性質不同。理化性質不同的原因：氨基酸的數目和序列不同。現在是5頁\一共有81頁\編輯于星期五1.與蛋白質分離純化相關的理化特性①分子大?、诜肿有螤睥蹘щ娞匦寓苋芙馓匦寓菖c配體特異性結合不同⑥吸附性質⑦變性和復性現在是6頁\一共有81頁\編輯于星期五1.1分子大小蛋白質分子大小主要取決于：

蛋白質肽鏈的數目每條肽鏈的氨基酸殘基數目。幾百~百萬Da常用方法透析超濾凝膠過濾離心現在是7頁\一共有81頁\編輯于星期五

透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。現在是8頁\一共有81頁\編輯于星期五現在是9頁\一共有81頁\編輯于星期五

超濾法

應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。現在是10頁\一共有81頁\編輯于星期五

超濾法

應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的?，F在是11頁\一共有81頁\編輯于星期五凝膠過濾是按照天然蛋白質相對分子質量大小進行分離的技術，又稱為分子篩層析或排阻層析?，F在是12頁\一共有81頁\編輯于星期五現在是13頁\一共有81頁\編輯于星期五超速離心離心（centrifugation）：利用機械的快速旋轉所產生的離心力，將不同密度的物質分離開來的方法。超速離心法(ultracentrifugation)：~60萬g，6萬~8萬r/min?？捎脕頊y定蛋白質分子量?，F在是14頁\一共有81頁\編輯于星期五超速離心現在是15頁\一共有81頁\編輯于星期五1.2分子形狀形狀蛋白質在離心通過溶液時，或通過膜、凝膠過濾填料顆粒或電泳凝膠中時，都會受到分子形狀的影響。方法梯度離心電泳現在是16頁\一共有81頁\編輯于星期五1.3電荷原理蛋白質的凈電荷與蛋白質等電點pI以及環(huán)境pH值有關（pH>pI，－）方法電泳離子交換層析現在是17頁\一共有81頁\編輯于星期五現在是18頁\一共有81頁\編輯于星期五1.4溶解度原理蛋白質分子表面親水性和疏水性帶電基團不同，因此在溶劑中的溶解度不同。通過改變pH、離子強度或加入有機試劑，促進蛋白質分子的凝聚進而形成沉淀。方法：沉淀法鹽析法（eg.硫酸銨）有機溶劑沉淀法（eg.丙酮）等電點沉淀法現在是19頁\一共有81頁\編輯于星期五蛋白質在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出，稱為鹽析。鹽析原理：高濃度鹽離子破壞蛋白質分子表面的水化膜，影響蛋白質分子表面所帶電荷，從而引起蛋白質沉淀，但通常不會引起蛋白質的變性。鹽析法現在是20頁\一共有81頁\編輯于星期五1.5配體特異性結合原理生物大分子的某些特定結構區(qū)域能夠特異性識別其他分子并可逆結合，生物分子間的這種結合能力稱為親和力。方法將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對另一個分子進行分離純化。分類免疫親和層析生物親和層析金屬螯合親和層析現在是21頁\一共有81頁\編輯于星期五1.6吸附性質原理

蛋白質可吸附在不同材料的表面，如金屬、陶瓷、塑料等。方法疏水層析現在是22頁\一共有81頁\編輯于星期五1.7變性和復性原理變性：蛋白質在一定的理化條件下會失去原有的空間結構、生物學功能及部分理化特性。復性：當變性條件去除后恢復原有的空間結構及生物學功能。方法如，利用尿素的變性和復性方法，從包涵體中純化原核表達蛋白現在是23頁\一共有81頁\編輯于星期五2.分離方法在實驗操作上，分為：沉淀法離心法電泳法超濾法相分配法層析法現在是24頁\一共有81頁\編輯于星期五現在是25頁\一共有81頁\編輯于星期五*不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離純化所有的蛋白質，*但每一種蛋白質可能都有一套適合的分離純化程序，*而且所用的主要技術手段都基本相同。Note現在是26頁\一共有81頁\編輯于星期五二、蛋白質純化的總原則和純化步驟總原則以合理的效率、速度、收率和純度，將目標蛋白從細胞的全部其他成分，特別是從雜蛋白中分離出來，同時仍保留其生物學活性和化學完整性?，F在是27頁\一共有81頁\編輯于星期五二、蛋白質純化的總原則和純化步驟步驟選擇實驗材料，實驗材料預處理蛋白質的提取蛋白質的粗分級蛋白質的細分級蛋白質的鑒定現在是28頁\一共有81頁\編輯于星期五蛋白質純化的前期準備關于蛋白質我們已知什么？最好的來源？蛋白質純度要求？活性要求？純化蛋白的量？如何進行鑒定？純化時間長短？最終花費？純化方案？現在是29頁\一共有81頁\編輯于星期五1、選擇實驗材料及預處理選擇實驗材料物種的選擇組織的選擇實驗材料預處理液體材料過濾離心固體材料洗滌：自來水—蒸餾水—提取緩沖液材料破碎：現在是30頁\一共有81頁\編輯于星期五材料破碎機械剪碎研磨反復凍融法超聲破碎法高壓勻漿法酶解法現在是31頁\一共有81頁\編輯于星期五2、蛋白質的提取①提取分離原則盡可能多地提取目的蛋白，同時避免活性丟失（溫度過高、pH、有機試劑、金屬離子、蛋白酶等因素）選擇合適的pH、選擇合適的離子強度現在是32頁\一共有81頁\編輯于星期五2、蛋白質的提?、谔崛∫撼煞值拇_定pH緩沖液：Tris-HCl,Tris-Gly,Gly-HCl,檸檬酸-檸檬酸鈉…離子：動物NaCl,植物KCl還原劑:DTT…蛋白酶抑制劑：EDTA,PMSF…金屬離子螯合劑:EDTA,EGTA…去污劑:SDS,CHAPS,TritonX-100,Tween-20甘油③溫度0~4℃現在是33頁\一共有81頁\編輯于星期五3、蛋白質的粗分級（粗提）使用蛋白質提取緩沖液提取實驗材料后，蛋白提取液中目標蛋白質的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標蛋白質濃縮，同時去除大量的雜質。常用的實驗技術：沉淀法（鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀）、超速離心、透析、超濾…現在是34頁\一共有81頁\編輯于星期五4、蛋白質的細分級粗分級只是使蛋白質得到濃縮和初步分離純化，多數情況下還要根據蛋白質分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進一步純化。常用的實驗技術：層析現在是35頁\一共有81頁\編輯于星期五4.1.層析（chromatography）固定相：凝膠流動相：緩沖液原理：現在是36頁\一共有81頁\編輯于星期五凝膠介質PharmaciaBioGelAagaroseBioGelPacrylamideBio-RadSephadexglucose(dextrose)SepharoseagaroseSephacrylglucose+acrylamideSephacelcellulose現在是37頁\一共有81頁\編輯于星期五

層析裝置（Chromatographicequipment）蠕動泵層析柱檢測器記錄儀部分收集器現在是38頁\一共有81頁\編輯于星期五①②③現在是39頁\一共有81頁\編輯于星期五現在是40頁\一共有81頁\編輯于星期五4.1.層析（chromatography）分子篩層析（Gelfiltration）離子交換層析（Ionexchange）疏水作用層析（Hydrophobicinteraction）親和層析（Affinity）現在是41頁\一共有81頁\編輯于星期五4.1.1分子篩層析（Gelfiltration）原理也稱為凝膠過濾、排阻層析。是以多孔凝膠材料為支持物，當蛋白質溶液流經此支持物時，分子大小不同的蛋白質所受到的阻滯作用不同而先后流出，從而達到分離純化的目的。凝膠介質葡聚糖（glucose）瓊脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纖維素（cellulose）現在是42頁\一共有81頁\編輯于星期五分子篩層析

GelfiltrationchromatographyHydrophilicNospontaneousbindingtoproteins.ChemicallyandphysicallystableRigidtoallowahighlinearflow-rate親水對蛋白質親和力低物理化學性質穩(wěn)定流速穩(wěn)定現在是43頁\一共有81頁\編輯于星期五分子篩層析

Gelfiltrationchromatography現在是44頁\一共有81頁\編輯于星期五分子篩層析

Gelfiltrationchromatography>>現在是45頁\一共有81頁\編輯于星期五分子篩層析

Gelfiltrationchromatography>>現在是46頁\一共有81頁\編輯于星期五4.1.2離子交換層析（Ionexchange）原理在一定的pH條件下，不同的蛋白質帶有的電荷的種類和數量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。利用蛋白質和帶電凝膠之間作用力的差別，把蛋白質分開的層析方法?，F在是47頁\一共有81頁\編輯于星期五4.1.2離子交換層析（Ionexchange）種類陽離子交換柱：凝膠帶負電荷，蛋白質帶正電荷陰離子交換柱：凝膠帶正電荷，蛋白質帶負電荷介質惰性支持物：瓊脂糖，葡聚糖…帶電基團：羧甲基—帶負電；二乙基氨基—帶正電平衡離子：負電基團：H+或Na+

正電基團：OH-或Cl-現在是48頁\一共有81頁\編輯于星期五離子交換層析（Ionexchange）陽離子交換：陰離子先，陽離子后陰離子交換：陽離子先，陰離子后現在是49頁\一共有81頁\編輯于星期五4.1.3親和層析（Affinitychromatography）原理利用蛋白質與配體專一性識別并結合的特性而分離蛋白質的一種層析方法。將配體固定于支持物上，當混合樣品流過此支持物時，只有目標蛋白能與配體專一性結合。先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后改變洗脫條件，將目標蛋白洗脫下來?，F在是50頁\一共有81頁\編輯于星期五親和層析（Affinitychromatography）現在是51頁\一共有81頁\編輯于星期五His-親合示意圖（金屬螯合層析）固相載體鎳柱（Ni-NTA）PETexpressionsystem現在是52頁\一共有81頁\編輯于星期五4.1.4疏水作用層析原理蛋白質表面疏水基團與介質疏水配體的可逆相互作用方法高離子強度下待分離的樣品吸附在疏水介質上，然后降低離子強度選擇性將樣品解吸，疏水弱的物質先洗脫，疏水強的物質后洗脫?，F在是53頁\一共有81頁\編輯于星期五4.2.電泳（Electrophoresis

）電泳就是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動。現在是54頁\一共有81頁\編輯于星期五蛋白質常用電泳技術聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing-IEF）雙向電泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）現在是55頁\一共有81頁\編輯于星期五4.2.1SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS：1、覆蓋蛋白質表面電荷，消除電荷差異2、改變蛋白質分子構象，消除形狀差異現在是56頁\一共有81頁\編輯于星期五電泳法測目標蛋白的分子量現在是57頁\一共有81頁\編輯于星期五不連續(xù)PAGE分離蛋白質的原理在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小和形狀不同的蛋白質在凝膠中能夠被分離。原理電荷效應濃縮效應快慢離子效應凝膠濃度差效應分子篩效應現在是58頁\一共有81頁\編輯于星期五4.2.3等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing—IEF）現在是59頁\一共有81頁\編輯于星期五等電聚焦（Isoelectricfocusing）現在是60頁\一共有81頁\編輯于星期五4.2.4雙向電泳第一向：等電聚焦（pI）第二向：SDS(MW)雙向電泳技術是蛋白質組學研究中蛋白質多肽鏈分離純化和鑒定的主要實驗技術之一?，F在是61頁\一共有81頁\編輯于星期五①Isoelectricfocusing②SDSgelelectrophoresis現在是62頁\一共有81頁\編輯于星期五TwoDimensionalElectrophoresisofE.coliProteins

-morethan2,000proteinswerevisualized現在是63頁\一共有81頁\編輯于星期五蛋白質純化策略方案設計篇

Proteinpurificationstrategy現在是64頁\一共有81頁\編輯于星期五三、純化方案設計原則確定純化目標purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically現在是65頁\一共有81頁\編輯于星期五確定純化目標現在是66頁\一共有81頁\編輯于星期五三、純化方案設計原則確定目標purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically現在是67頁\一共有81頁\編輯于星期五三、純化方案設計原則確定目標purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically現在是68頁\一共有81頁\編輯于星期五嚴格依據目標蛋白質的特殊生物學性質，來設計活性檢測方案常見檢測方法:酶學檢測enzymaticassays.配體檢測ligand-bindingassays免疫檢測immunologicalassays活性測定方法的要求：快速、簡便、特異和定量確定活性檢測方法現在是69頁\一共有81頁\編輯于星期五三、純化方案設計原則確定目標purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically現在是70頁\一共有81頁\編輯于星期五盡量減少純化步驟純化步驟越多，樣品損失越大（產量、活性）現在是71頁\一共有81頁\編輯于星期五減少每步操作時間toavoidlengthyprocedureswhichrisklosingactivity/reducingrecovery減少添加物additivesmayneedtoberemovedinanextrapurificationstepormayinterferewithactivityassays早期除去降解物（如蛋白酶）forexample,proteases每步使用不同的純化方法totakeadvantageofsamplecharacteristicswhichcanbeusedforsepar