實驗蛋白質(zhì)含量測定2012課件

生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗實驗一

幾種蛋白質(zhì)定量測定方法的比較生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗1掌握紫外吸收法、Folin－酚試劑法（Lowry法）和考馬斯亮藍染色法（Bradford法）測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法

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掌握分光光度計的原理和使用方法實驗?zāi)康纳锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗①有多少樣品可供分析;②蛋白質(zhì)樣品濃度大約是多少;③樣品中含有哪些可能影響定量的化學(xué)物質(zhì)；④所選方法是否簡單、可靠；⑤含量測定的專一性要求是否很高。選擇合適的蛋白質(zhì)含量測定方法主要基于幾點考慮：生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗蛋白質(zhì)在紫外光區(qū)（190nm-360nm）有兩個強烈吸收峰：280nm和190nm。280nm有吸收的電子所需能量較少，因為這些光子存在于芳香環(huán)的共軛雙鍵中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香環(huán)，可吸收280nm波長的光子，苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）也有微弱吸收。蛋白質(zhì)的吸收強度與上述幾種氨基酸的含量有關(guān)，因此相同濃度的不同種類蛋白質(zhì)，其280nm的吸收值差別很大(圖1)。紫外吸收法生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗圖1.蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收光譜圖A是15μg/ml蛋白的吸收光譜。圖A中插圖是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明膠(G)的吸收光譜，緩沖液為：0.01%Brij35,0.1MK2SO4,5mMKH2PO4,pH7。圖B是10μg/mlRNA和DNA的吸收光譜。生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗肽鍵在190nm有強吸收峰。一般分光光度計在190nm的光強較弱，且O2在此波長有吸收，因此通常使用205nm或210nm波長，Trp,Phe,Tyr,His,Cys,Met,andArg的側(cè)鏈在此波長有吸收。優(yōu)點：靈敏，較穩(wěn)定。缺點:干擾因素多。許多化學(xué)物質(zhì)特別是含C＝C雙鍵和C＝O雙鍵的物質(zhì)在此波長范圍有吸收，所以必須嚴格控制反應(yīng)條件。紫外吸收法生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗缺點：干擾測定的影響因素多，尤其是RNA和DNA在此波長均有強吸收,所以一定要考慮樣品中是否有核酸.要得到準確可靠的結(jié)果，必須嚴格控制樣品溶液的pH和化學(xué)組成，使待測樣品和標準樣品的實驗條件一致。敏感度低，要求樣品的濃度較高，量較大。用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對于那些與標準蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，誤差較大。

紫外吸收法生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗管號01234567標準蛋白溶液（ml）01.01.52.02.53.04.00雙蒸水（ml）4.03.02.52.01.51.000蛋白質(zhì)含量(mg/ml)00.250.3750.50.6250.751.0

未知蛋白溶液（ml）-------4.0A280

操作步驟紫外吸收法生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗考馬斯亮藍染色法（Bradford法）原理：該方法由Bradford于1976年建立。在酸性條件下，考馬斯亮藍與蛋白質(zhì)結(jié)合后最大光吸收波長由465nm（紅色）轉(zhuǎn)移為595nm（藍色），起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His,Lys,Tyr,Trp和Phe也有作用。2－5min呈最大光吸收，至少可穩(wěn)定1小時生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗實驗操作步驟

室溫放置5分鐘后測595nm的光吸。考馬斯亮藍染料極易吸附于比色皿壁，每次測量后應(yīng)用乙醇洗滌后，用雙蒸水清洗。注意混勻，但不要劇烈震蕩。

考馬斯亮藍染色法（Bradford法）生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗原理：Folin-酚試劑法的顯色試劑由試劑甲和試劑乙組成。試劑甲中的Cu2+堿性條件下與肽鍵形成絡(luò)合物并被還原成Cu+。Cu+以及蛋白質(zhì)中的Tyr等的側(cè)鏈基團與試劑乙反應(yīng)，試劑乙中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的Tyr和Phe殘基還原，產(chǎn)生藍色化合物（鉬蘭和鎢蘭的混合物），顯色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)接近極限。顏色深淺與蛋白含量成正比，可在640nm下測光吸收。

Folin-酚試劑法（Lowry法）生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗酸、銅離子螯合劑（如EDTA、檸檬酸等）、還原劑（如巰基乙醇、DTT、苯酚等）干擾本反應(yīng)。不同蛋白質(zhì)主要因其所含的Tyr含量不同而呈現(xiàn)不同的吸收強度。進行測定時，加試劑乙時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)試劑乙加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。費時較長，試劑配制較繁瑣。Folin-酚試劑法（Lowry法）生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗試劑、實驗材料：

（已放在每個試驗臺的架子上）

標準蛋白溶液：1mg/mlBSA未知蛋白溶液考馬斯亮藍染色液Folin-酚試劑甲Folin-酚試劑乙生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗Lowry法的改進法。堿性條件下，蛋白分子中的肽鍵與Cu2+形成絡(luò)合物，并將Cu2+還原成Cu+；Cu+與BCA結(jié)合成紫色復(fù)合物，在562nm處吸收值與濃度呈正比BCA法生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測可達到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活。可耐受高達5%的表面活性劑測定不同蛋白樣品時比bradford測定法結(jié)果均一BCA法生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗1、由于各種方法測定原理不同，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度可能會有較大差異。2、即使是用同一種比色法測定同一樣品，選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品。3、所有的樣品（包括標準樣品），都必須在規(guī)定時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值會有變化，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實際的濃度不符。注意生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗722型光柵分光光度計光源單色器樣品池光電源件讀數(shù)單元測量完畢，請把光度計的蓋打開！講解完畢后，每個組出一個同學(xué)去127聽老師講解儀器使用。生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗TU1800紫外可見分光光度計波長范圍：200－1100nm測光系統(tǒng)：單光束功能指標：光度測量光譜掃描定量測量鎢燈：340－1100nm氘燈：200－340nm生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗實驗報告原始數(shù)據(jù)需老師簽字，附在實驗報告上。真實記錄實驗數(shù)據(jù)，以標準蛋白含量為橫坐標，相應(yīng)的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，并標出未知溶液的蛋白含量?？梢赃M行各種軟件繪圖。單位、標示要清楚生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗微量移液槍使用注意事項輕拿輕放，不能摔、砸。