研究生細(xì)胞技術(shù)緒論

細(xì)胞培養(yǎng)是一種技術(shù)，是將真核細(xì)胞或原核細(xì)胞培養(yǎng)在受人工控制的狀態(tài)下，使其生長繁殖。這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展與方法，與組織培養(yǎng)或器官培養(yǎng)關(guān)系密切。最早的實(shí)驗(yàn)室常態(tài)性動物細(xì)胞培養(yǎng)，始于1950年。不過早在19世紀(jì)，便已經(jīng)有人提出將活體細(xì)胞從原先組織中分離出來的概念。1第一頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)理論課內(nèi)容一、緒論二、細(xì)胞的體外生長大環(huán)境三、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)四、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)和雜交瘤技術(shù)五、干細(xì)胞的研究2第二頁，共118頁。第一章緒論一、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展簡史二、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基本概念三、對細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的評價四、細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題五、組織工程基本概念六、本室細(xì)胞培養(yǎng)與組織工程研究工作簡介3第三頁，共118頁。上世紀(jì)初（1907年）美國科學(xué)家Harrison和Carrel創(chuàng)建的、以淋巴液為培養(yǎng)基在試管內(nèi)成功地培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織。50年代在培養(yǎng)容器、培養(yǎng)液及技術(shù)操作上都進(jìn)行了大的改進(jìn)，使細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入一個突飛猛進(jìn)的發(fā)展階段。70年代，隨著遺傳缺陷細(xì)胞株的培育，雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，癌基因轉(zhuǎn)染及基因工程出現(xiàn)，使細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不僅用于研究生命科學(xué)，也成為生物工程、基因工程和組織工程等學(xué)科的生產(chǎn)手段。一、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展簡史4第四頁，共118頁。細(xì)胞（組織）培養(yǎng)細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的概念和進(jìn)展：細(xì)胞（組織）培養(yǎng)是指從生物體內(nèi)取出細(xì)胞（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。二、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念5第五頁，共118頁。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒂^察指標(biāo)決定組織

（器官）或是單個細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)是用剪碎的小組織塊或分離的單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)將會失去原有組織類型及某些生化特征，但它們可以增殖，可以特性化，可以獲得遺傳背景相同的群體，可以保存。培養(yǎng)選材一般來自胚胎組織的培養(yǎng)物；比成體組織更易生存和生長。這主要是因?yàn)榕咛ソM織有更多的胚胎組織干細(xì)胞（ESC），它們具有更高的自我更新和多能分化的能力。細(xì)胞（組織）培養(yǎng)選材二、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念6第六頁，共118頁。原代培養(yǎng)一般指細(xì)胞從組織中分離在體外生長至傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)。這種培養(yǎng)通常是異質(zhì)性，生長緩慢，但比較能代表原組織的類型并表達(dá)原組織特性。缺點(diǎn)是在培養(yǎng)過程中會失去許多原組織的細(xì)胞。二、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念原代與傳代培養(yǎng)7第七頁，共118頁。傳代細(xì)胞原代細(xì)胞生長物或細(xì)胞系生長到一定階段，分散成單個細(xì)胞，按一定比例接種于新的培養(yǎng)容器內(nèi)稱之傳代。傳代細(xì)胞稱之細(xì)胞系，可分為兩類：有限細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系。傳代形成的具有各自生物特性或標(biāo)志的細(xì)胞系稱之為細(xì)胞株（Cellstrain）。二、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念8第八頁，共118頁。二、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念9第九頁，共118頁。細(xì)胞純化當(dāng)細(xì)胞分離純化并不完全徹底，培養(yǎng)物中能達(dá)到以某種細(xì)胞為主（占絕大多數(shù)）的程度。二、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念是指從原代培養(yǎng)前成分混雜的異質(zhì)性細(xì)胞懸液中或者從培養(yǎng)物中獲得單一類型細(xì)胞的過程。通過細(xì)胞分離和純化得到細(xì)胞株或系。細(xì)胞富集10第十頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞水組成細(xì)胞質(zhì)膠體，是細(xì)胞重要的組成部分，占細(xì)胞總量的75％～90％。水是細(xì)胞內(nèi)外的溶媒，并且直接參加代謝中的各種反應(yīng)，制備培養(yǎng)液至少需用不含雜質(zhì)的蒸餾水。通常將水分為四種：軟化水脫鹽水（蒸餾水）純水（去離子水）高純水（超純水）11第十一頁，共118頁。1）軟化水：是指硬度降低至一定程度的水。在軟化過程中，僅硬度降低而總含鹽量不變。2）脫鹽水（蒸餾水）：這種水由于去除了強(qiáng)電解質(zhì)，水質(zhì)純，剩余含鹽量在1～5mg/L。25℃時用電導(dǎo)儀測水的電阻率為0.1～1.0×106Ω·cm。3）純水（去離子水）：制備過程是將普通自來水經(jīng)沙過濾后，再經(jīng)陽、陰離子交換樹脂和陽＋陰混合樹脂交換處理。剩余含鹽量在0.1mg/L左右。電阻率為1.0～1.0×106Ω·cm。蒸餾水和去離子水均適用于一般培養(yǎng)液的配制。4）高純水（超純水）：將純水再次純化處理，剩余含鹽量在0.1mg/L以下。25℃時，水的電阻率在1.0～1.0×106Ωcm以上。用于配置組織細(xì)胞培養(yǎng)液，并需現(xiàn)配現(xiàn)用。

細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞12第十二頁，共118頁。飽和密度(Saturationdensity)：在特殊培養(yǎng)條件下，每平方厘米(單層培養(yǎng))或每毫升細(xì)胞懸液內(nèi)可達(dá)到的最大細(xì)胞數(shù)。匯合(Confluent)：指細(xì)胞增殖生長相互連接成片占據(jù)所有底物面積現(xiàn)象。超匯合(Superconfluent)：單層細(xì)胞培養(yǎng)附在底物上生長，匯合后發(fā)展成多層狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞13第十三頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞傳代(Passage)也稱再培養(yǎng)(Subculture)，把一瓶培養(yǎng)細(xì)胞全部或分成幾份再培養(yǎng)的過程。單層細(xì)胞培養(yǎng)(Monolayerculture)：培養(yǎng)細(xì)胞在底物上生長成單層的培養(yǎng)法。代或世代(Generation)：指細(xì)胞經(jīng)過一次分裂完成后至下次分裂的過程。底物(Substrate)：指供細(xì)胞貼附生長的實(shí)質(zhì)性支持面(如塑料和玻璃等)。14第十四頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞二倍體(Diploid)：指雙倍數(shù)的染色體數(shù)或具有此數(shù)的細(xì)胞系。二倍體細(xì)胞系或株(Diploidcelllineorstrain)：具有二倍體染色體數(shù)的細(xì)胞系或株。非整倍體(Aneuploid)：細(xì)胞染色體數(shù)為非整倍數(shù)(人23n)的核型。15第十五頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞核型(Karyotype)：一個細(xì)胞全部染色體的組成和所有特征。合核體(Synkaryon)：兩個細(xì)胞融合后形成的單核雜種細(xì)胞?；盍?Viability)：以100個細(xì)胞中存活細(xì)胞數(shù)表示。16第十六頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞接觸抑制(Contactinhibition)：指細(xì)胞相互接觸后失去運(yùn)動(移動)的現(xiàn)象。接種率(Platingefficiency)：接種細(xì)胞培養(yǎng)時細(xì)胞能形成克隆的百分?jǐn)?shù)；如每一克隆均來自單個細(xì)胞時，則與克隆形成率等同。接種存活率(Seedingefficiency）：接種一定量細(xì)胞后，在一定時間內(nèi)，能貼附于底物上存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。17第十七頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞近匯合或半?yún)R合(Sub-confluent)：細(xì)胞在底物上生長接近但尚未完全匯合的狀態(tài)(可用而70％、80％或90％等表示)連續(xù)細(xì)胞系或永生性細(xì)胞系或株(Continuouscellline)：具有在體外可反復(fù)傳代無限增殖能力的細(xì)胞群。密度抑制(Densityinhibition)：由于細(xì)胞密度過大，培養(yǎng)液營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物過多和生存空間消失所引起細(xì)胞增殖的抑制現(xiàn)象。18第十八頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞克隆(Clone)：指由從一個共同的祖先通過無性繁殖而來的、遺傳上同一的細(xì)胞群或后裔；Clone也可作動詞用，用于指細(xì)胞形成克隆細(xì)胞群的過程，即從群體中把單個細(xì)胞分離出來，通過增殖形成細(xì)胞群或后裔的過程；用于分子生物學(xué)時，既有繁殖意義也有分離的意義，如分子克隆形成率(CloningEfficiency)：向底物接種單細(xì)胞懸液能增殖生長形成細(xì)胞群的百分?jǐn)?shù)。19第十九頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞平分比數(shù)(Splitratio)：細(xì)胞再培養(yǎng)時稀釋比數(shù)；如一瓶細(xì)胞分入4份100毫升或400毫升中，則平分比為4。器官培養(yǎng)(Organculture)：在體外維持器官、器官的一部分或器官原基的培養(yǎng)法。群體密度(Populationdensity)：培養(yǎng)底物單位面積上單層細(xì)胞數(shù)量。群體倍增時間(Populationdoublingtime)：細(xì)胞指數(shù)增長期時，細(xì)胞群倍增所需的時間。20第二十頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞三維培養(yǎng)(Threedimensionalculture)：把細(xì)胞懸液接種在一定立體形態(tài)的支架上，使細(xì)胞生長在三維環(huán)境中的培養(yǎng)方法。.貼壁性或錨著依賴性(Anchorage-dependent)：一些細(xì)胞依賴于貼附底物或支持物上才能增殖生長的性狀。21第二十一頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞體內(nèi)(Invivo)：指在整體內(nèi)。體外培養(yǎng)(Invitro)：原義為在試管中，即指體外，現(xiàn)與組織培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)）一詞等同。細(xì)胞融合(Cellfusion)：指兩個獨(dú)立的細(xì)胞借媒介物(PEG等)融合成雜種細(xì)胞的過程。細(xì)胞一代時間(Cellgenerationtime)：一個細(xì)胞二次分裂的間隔時間。22第二十二頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞細(xì)胞雜交(Cellhybridization)：兩個或多個細(xì)胞融合形成一個合核體(synkaryon)的過程。細(xì)胞系(Cellline)：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成為細(xì)胞系。細(xì)胞株(Cellstrain)：通過選擇或克隆法，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系所獲的培養(yǎng)物。懸滴培養(yǎng)(Suspensionculture)：把培養(yǎng)物滴在無菌蓋片上，翻轉(zhuǎn)蓋片覆在凹窩玻片上的培養(yǎng)法。23第二十三頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞懸浮培養(yǎng)(Suspensionculture)：細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長的培養(yǎng)方法。亞系(Sub-line)：由原細(xì)胞分離出的具有與原細(xì)胞系不同性狀的細(xì)胞系。亞株(Sub-strain)：由原細(xì)胞分離出的具有與原細(xì)胞株不同性狀的細(xì)胞株。24第二十四頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞有限細(xì)胞系(Finitecellline)：細(xì)胞系形成后僅能維持有限傳代次數(shù)，最后死亡。雜種細(xì)胞(Hybridcell)：指由兩種不同類型細(xì)胞通過融合所形成的新細(xì)胞。組織移植(Explant)：指組織塊移植培養(yǎng)。25第二十五頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)重要名詞增代時間(Generationtime)：指細(xì)胞一次分裂完了到下一次再分裂的時間（即形成一代的時間）。轉(zhuǎn)染(Transfection)：是指用噬菌體、質(zhì)粒、病毒等為載體與目的基因構(gòu)成的重組子后被導(dǎo)入細(xì)胞基因組中的過程。染色體組型圖(Idiogram)：細(xì)胞染色體按形態(tài)特征排列的圖形。26第二十六頁，共118頁。

三、對細(xì)胞培養(yǎng)的評價（一）培養(yǎng)的組織器官或細(xì)胞，能再一定范圍和程度上反映生命活動規(guī)律和機(jī)體功能特點(diǎn)。培養(yǎng)的細(xì)胞為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)各種研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。如：組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的醫(yī)學(xué)生物學(xué)意義

藥物篩選，療劑評價，新生物制品研發(fā)，研究病毒及其他微生物，發(fā)現(xiàn)新的傳染因子，組織工程中的支撐技術(shù)等。27第二十七頁，共118頁。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為商品化生物技術(shù)產(chǎn)品的核心。如目前可提供的產(chǎn)品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗和乙肝疫苗等；非抗體型免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白介素和集落刺激因子等；多肽生長因子：表皮生長因子和神經(jīng)生長因子等；酶類：組織型纖溶酶原激活劑；激素：EPO和促黃體生成素等；殺蟲劑：桿狀病毒；腫瘤特異抗原；癌胚抗原；通過雜交瘤生產(chǎn)的各種單克隆抗體；細(xì)胞本身（如干細(xì)胞）；皮膚重植等。（二）細(xì)胞培養(yǎng)與生物工程三、對細(xì)胞培養(yǎng)的評價28第二十八頁，共118頁。單克隆抗體（單抗）是繼疫苗、重組蛋白后最重要的一類生物技術(shù)產(chǎn)品，是21世紀(jì)生物技術(shù)和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的戰(zhàn)略制高點(diǎn)。單抗已成功應(yīng)用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等。29第二十九頁，共118頁。單抗技術(shù)經(jīng)過35年的發(fā)展，歷經(jīng)鼠源性（murine）、嵌合（chimeric）、人源化（humanized）和全人源單抗（humanmonoclonalantibody）四個階段。30第三十頁，共118頁。鼠源性單抗由鼠雜交瘤細(xì)胞分泌，免疫原性非常強(qiáng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗鼠抗體，毒副作用明顯，因而大大制約了其臨床應(yīng)用。全球單抗市場中，人源單抗是其未來的發(fā)展方向，已在歐美上市的32個單抗中，有9個是全人源單抗，13個是人源化單抗。（表1）31第三十一頁，共118頁。32第三十二頁，共118頁。33第三十三頁，共118頁。34第三十四頁，共118頁。35第三十五頁，共118頁。36第三十六頁，共118頁。37第三十七頁，共118頁。38第三十八頁，共118頁。對于生物技術(shù)所使用的各種細(xì)胞株的價值，現(xiàn)尚難作出評價。1998年，美國市場就達(dá)3.5-4億美元，而且每年還以6-8%的速度增長。美國細(xì)胞株供應(yīng)公司和機(jī)構(gòu)及國內(nèi)供應(yīng)單位可在網(wǎng)上查詢。三、對細(xì)胞培養(yǎng)的評價（三）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的商業(yè)化39第三十九頁，共118頁。三、對細(xì)胞培養(yǎng)的評價invitrogan

有關(guān)不同細(xì)胞株的用戶論壇ATCC

各種細(xì)胞株的主要供應(yīng)者提供有關(guān)細(xì)胞株的篩選Cellsalive

生產(chǎn)各種細(xì)胞感染、凋亡其他細(xì)胞過程的錄相和圖片Gentest

藥物代謝試驗(yàn)用的酶和肝細(xì)胞主要供應(yīng)者ExpessionSystems

桿病毒細(xì)胞株的主要供應(yīng)者LifeTech

供應(yīng)基礎(chǔ)研究用的特異化細(xì)胞株40第四十頁，共118頁。三、對細(xì)胞培養(yǎng)的評價細(xì)胞（組織）培養(yǎng)，包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少生物整體的嚴(yán)密聯(lián)系，不能代表整個機(jī)體。在進(jìn)行醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗(yàn)過程及對結(jié)果的評估都必須考慮這些。（四）組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的局限性41第四十一頁，共118頁。微生物是一類肉眼不能直接看見，必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡放大幾百倍或幾萬倍后才能觀察到的微小生物。根據(jù)微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分化程度和化學(xué)組成，可分為3大類：非細(xì)胞型微生物:病毒、朊病毒（朊粒）原核細(xì)胞型微生物：細(xì)菌、支原體、立克次體、衣原體、立克次體和放線菌。真核細(xì)胞型微生物：真菌四、細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題42第四十二頁，共118頁。培養(yǎng)細(xì)胞的污染概念包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞。四、細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題細(xì)胞培養(yǎng)的檢測和排除空氣：一般培養(yǎng)室環(huán)境中每立方米含菌數(shù)不應(yīng)超過1~5個器材：CO2溫箱操作血清組織樣本微生物污染的途徑43第四十三頁，共118頁。真菌污染細(xì)菌污染支原體污染：可做如下檢測相差顯微鏡檢測熒光染色法電鏡檢查DNA分子雜交或支原體培養(yǎng)方法四、細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題微生物污染的檢測44第四十四頁，共118頁。把好每一個關(guān)口，盡可能禁止任何有污染的物品進(jìn)入培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)；四、細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題微生物污染的防治抗生素：一般用常用量的5~10倍作沖擊療法。用藥24~48h后，再換常規(guī)培養(yǎng)液。加溫處理：根據(jù)支原體對熱敏感的特點(diǎn)，將受支原體污染的細(xì)胞放置在41℃作用5~10h，最長不超過18h后，以殺滅支原體。動物體內(nèi)接種：將支原體污染的細(xì)胞接種在同種動物的皮下或腹腔，借動物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)消滅支原體。待一定時間后取出細(xì)胞，做原代培養(yǎng)再進(jìn)行繁殖。45第四十五頁，共118頁。細(xì)菌污染46第四十六頁，共118頁。無支原體污染的Hela細(xì)胞47第四十七頁，共118頁。Hoechest33258熒光染色檢測

細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染被支原體污染的Vero細(xì)胞48第四十八頁，共118頁。疑似支原體污染的Vero細(xì)胞49第四十九頁，共118頁。藥物清除Vero細(xì)胞中支原體污染50第五十頁，共118頁。透射電鏡檢測細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染51第五十一頁，共118頁。52第五十二頁，共118頁。Hoechest33258熒光染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)生凋亡的Vero細(xì)胞53第五十三頁，共118頁。正常的HF細(xì)胞54第五十四頁，共118頁。透射電鏡檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果正常神經(jīng)元凋亡神經(jīng)元55第五十五頁，共118頁。五、組織工程的基本概念56第五十六頁，共118頁。首次獲得由人類胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的表皮

據(jù)發(fā)表在2009年11月21日《Lancet》雜志的一篇研究報(bào)告，I-STEM*研究所(I-STEM/

Inserm

UEVE

U861/AFM)由Marc

Peschanski主持的課題組成功地利用人類胚胎干細(xì)胞生成一塊完整的表皮。該課題組希望未來可以利用這種干細(xì)胞作為治療三度燒傷患者和遺傳性皮膚病患者的可替代療法。

人類胚胎干細(xì)胞(Human

embryonic

stem

cells

,hES)有兩個基本特征：無限增殖的能力和分化為機(jī)體各種細(xì)胞的多能性。

57第五十七頁，共118頁。首先，該課題組獲得皮膚干細(xì)胞——角質(zhì)生成細(xì)胞(keratinocytes)（角質(zhì)生成細(xì)胞可以使皮膚得到不斷更新）；然后研究人員先后分別在體外和生物體體表測試分離出來的角質(zhì)生成細(xì)胞重新形成功能性表皮細(xì)胞的能力。

在細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)方法的支持下，能使hES細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞。該課題組研究人員已在體外成功地利用角質(zhì)生成細(xì)胞重建出來一塊表皮(epidermis)，最后，他們將獲得的表皮移植到免疫能力降低的小鼠上。移植后12周，小鼠移植表皮的局部皮膚區(qū)域完全恢復(fù)正常。58第五十八頁，共118頁。59第五十九頁，共118頁。60第六十頁，共118頁。61第六十一頁，共118頁。62第六十二頁，共118頁。肝癌HepG2細(xì)胞株白蚊伊蚊C6細(xì)胞成人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株單核巨噬細(xì)胞（活化劑刺激）63第六十三頁，共118頁。組織工程最先在美國出現(xiàn)。1987年在華盛頓科學(xué)基金會上，人們提出組織工程一詞。1988年組織工程學(xué)被正式確認(rèn)和定義為：組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原則及方法，在正確認(rèn)識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。五、組織工程的基本概念64第六十四頁，共118頁。1993年R.Langer和J.Vacant對組織工程概念提出更為簡明的定義：應(yīng)用工程科學(xué)和生命科學(xué)的原理，開發(fā)用于恢復(fù)、維持及提高受損傷組織和器官功能的生物學(xué)替代物。從而使組織工程學(xué)研究的內(nèi)容、應(yīng)用范圍和任務(wù)更加明確。組織工程的主要目的或內(nèi)涵是對人體器官和組織修復(fù)。五、組織工程的基本概念65第六十五頁，共118頁。組織工程的一個獨(dú)特的方面是研究細(xì)胞與可吸收支架材料以及與組織形成有關(guān)的環(huán)境因素（包括力學(xué)負(fù)載）的相互作用，細(xì)胞對這些相互作用的反應(yīng)包括細(xì)胞增殖和基質(zhì)的生物合成。組織工程技術(shù)的關(guān)鍵在于通過細(xì)胞培養(yǎng)使其數(shù)量增加，以便于獲得足夠多的細(xì)胞用于體外構(gòu)建組織，或者將細(xì)胞單獨(dú)置入體內(nèi)，或者將細(xì)胞接種于支架材料后在體內(nèi)再生組織。五、組織工程的基本概念66第六十六頁，共118頁。67第六十七頁，共118頁。68第六十八頁，共118頁。69第六十九頁，共118頁。70第七十頁，共118頁。71第七十一頁，共118頁。五、組織工程的基本概念72第七十二頁，共118頁。組織工程的產(chǎn)生外科學(xué)的發(fā)展目前臨床常見的組織器官缺損修復(fù)技術(shù)主要有以下三種：五、組織工程的基本概念第一、異體組織移植隨著科學(xué)發(fā)展，不僅國外，現(xiàn)在我國同樣也能進(jìn)行多種大的器官，如心、肺、腎和腸等的移植。但在當(dāng)前器官移植中，仍存在著兩個關(guān)鍵的問題：一是所移植的組織或器官的相容性，即來自異體的替代物，易發(fā)生免疫反應(yīng)，終會被排斥掉，難以永久替代受損組織器官的功能；其次是供體來源嚴(yán)重不足。73第七十三頁，共118頁。第二、自體組織移植這種移植是比較理想的，一般不會引起免疫排斥反應(yīng)。但為修復(fù)病損組織，須以犧牲人體正常組織為代價，結(jié)果又形成了供獻(xiàn)部位新的組織缺損，是一種以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷的治療模式。另外自體移植尚存在著潛在的其他影響，這是因?yàn)轶w內(nèi)各種組織存在著局部調(diào)控問題，組織異位可能引起功能紊亂，例如以皮膚代替食管，30年后可能引起皮膚癌；排尿通道異位導(dǎo)入大腸，20~30年后可引起大腸癌。五、組織工程的基本概念74第七十四頁，共118頁。第三、應(yīng)用人工合成組織代用品

該類代用品植入體內(nèi)后，易導(dǎo)致異物反應(yīng)以及繼發(fā)感染，而最終被排出體外；金屬替代物能引起周圍組織萎縮，進(jìn)而需要采取矯正措施。改善上述醫(yī)療技術(shù)的追求成為組織工程產(chǎn)生的巨大動力。五、組織工程的基本概念75第七十五頁，共118頁。巨大需求促發(fā)展

當(dāng)前對組織器官有需求的患者有增無減，如在美國等候組織器官的名單上，平時就有65000人（Vacanti，2000）；按我國人口多于美國5倍粗算，等候者至少也有30萬之眾，有統(tǒng)計(jì)說我國燒傷患者每年達(dá)百萬之眾。從理論上說，人體所有組織器官都可以進(jìn)行修復(fù)和重建。不過現(xiàn)時的組織工程，畢竟仍在發(fā)展和完善之中，雖能在相當(dāng)多的組織器官中應(yīng)用，效果也很好，但還不能用于所有人體的器官，然而，組織工程的應(yīng)用趨勢已日益廣泛，效果越來越理想；組織工程全面應(yīng)用之日和效果更加完美之時，將不會遙遠(yuǎn)。五、組織工程的基本概念76第七十六頁，共118頁。實(shí)用性組織工程的最大特點(diǎn)是比其他生物工程更具有實(shí)際意義，組織工程的直接目標(biāo)就是臨床應(yīng)用。五、組織工程的基本概念科學(xué)綜合的產(chǎn)物20世紀(jì)以來所出現(xiàn)的各種工程科學(xué)：基因工程、遺傳工程、細(xì)胞工程以及組織工程等生物工程，都是科學(xué)發(fā)展的必然。所有學(xué)科都有交叉性，組織工程更是如此。77第七十七頁，共118頁。組織工程作為一種新興學(xué)科具有以下優(yōu)點(diǎn)：能形成具有生命力的活體組織，對疾病損傷進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的重建，并進(jìn)一步達(dá)到永久性替代；

可以用最少量的組織細(xì)胞（甚至可用組織穿刺的方法獲得），經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，來修復(fù)大塊的組織缺損，完成無損傷性組織結(jié)構(gòu)和功能的重建；

可按組織、器官缺損情況任意塑型，達(dá)到完美的形態(tài)修復(fù)。

五、組織工程的基本概念78第七十八頁，共118頁。組織工程的實(shí)施需有以下幾個基本條件：需要有受者機(jī)體所能接受的細(xì)胞或組織。需要有支持細(xì)胞附著和生長的物質(zhì)和材料（可取自受者，或人工合成物和陶瓷等）。需要有誘導(dǎo)、調(diào)控組織細(xì)胞生長增殖和分化調(diào)控物質(zhì)，如生長因子、促血管生長因子等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等。五、組織工程的基本概念79第七十九頁，共118頁。五、組織工程的基本概念80第八十頁，共118頁。五、組織工程的基本概念組織工程展望一、種子細(xì)胞的研究進(jìn)展1.成體干細(xì)胞的可塑性研究2.胚胎干細(xì)胞的研究3.人胚胎組織細(xì)胞

4.異種細(xì)胞的研究

5.種子細(xì)胞的擴(kuò)增及應(yīng)力與生長的研究

81第八十一頁，共118頁。二．支架材料的研究進(jìn)展

支架材料作為組織工程的人工細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞的停泊、生長、繁殖、進(jìn)行新陳代謝和形成新組織提供支持。由于人體組織結(jié)構(gòu)的特殊性，尚難以確定哪幾種材料為最佳支持材料。目前研究較多的有以下幾種：五、組織工程的基本概念1、可降解高分子材料

2、陶瓷類材料

3、復(fù)合材料4、生物衍生材料

82第八十二頁，共118頁。三、組織構(gòu)建研究進(jìn)展

（一）組織工程骨的構(gòu)建1.單純構(gòu)建

2.復(fù)合構(gòu)建3.血管化構(gòu)建

五、組織工程的基本概念（二）組織工程軟骨的構(gòu)建1.無支架離心管培養(yǎng)

2.軟骨細(xì)胞與支架材料復(fù)合構(gòu)建3.雙層支架構(gòu)建

83第八十三頁，共118頁。（三）組織工程肌腱的構(gòu)建

1.肌腱細(xì)胞與復(fù)合構(gòu)建2.應(yīng)力場三維培養(yǎng)

五、組織工程的基本概念（四）組織工程周圍神經(jīng)的構(gòu)建

1.在導(dǎo)管中接種雪旺細(xì)胞2.雪旺細(xì)胞與三維支架復(fù)合構(gòu)建

3.在支架材料上分次接種雪旺細(xì)胞4.生物反應(yīng)器構(gòu)建

84第八十四頁，共118頁。（五）組織工程皮膚的構(gòu)建

1.組織工程表皮

2.組織工程真皮3.表皮-真皮復(fù)合構(gòu)建

五、組織工程的基本概念四、組織工程臨床應(yīng)用

（一）組織工程骨的臨床應(yīng)用（二）組織工程軟骨的臨床應(yīng)用（三）組織工程皮膚的臨床應(yīng)用

85第八十五頁，共118頁。五、組織工程的基本概念組織工程尚需研究的科學(xué)問題一、種子細(xì)胞的進(jìn)一步研究（一）細(xì)胞來源研究組織工程的種子細(xì)胞可有以下來源：自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞和異種細(xì)胞。86第八十六頁，共118頁。自體細(xì)胞五、組織工程的基本概念87第八十七頁，共118頁。五、組織工程的基本概念88第八十八頁，共118頁。同種異體細(xì)胞

五、組織工程的基本概念89第八十九頁，共118頁。構(gòu)建工程化組織需要大量形態(tài)、功能均好的種子細(xì)胞，多種生物反應(yīng)器的研究成功及生長因子的應(yīng)用，已為快速、大量擴(kuò)增細(xì)胞提供了技術(shù)平臺，但存在以下問題尚需研究。

五、組織工程的基本概念二、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1.快速擴(kuò)增細(xì)胞的形態(tài)、功能檢測2.生長因子的應(yīng)用3.細(xì)胞生長與應(yīng)力的關(guān)系90第九十頁，共118頁。三、支架材料的研究四、細(xì)胞支架材料的相互作用五、動物體內(nèi)植入試驗(yàn)六、臨床驗(yàn)證研究七、檢測及評價八、產(chǎn)業(yè)化研究

組織工程產(chǎn)品按我